Summary
यहाँ, हम अन्वेषक एक माउस की संचार प्रणाली को एन्दोथेलिअल व्युत्पन्न आसंजन अणुओं के साथ लेपित एक कक्ष को जोड़ने के द्वारा ल्युकोसैट भर्ती गतिशीलता पूर्व vivo का आकलन करने की अनुमति देता है कि एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह रिश्तेदार जैविक शर्तों के तहत ल्युकोसैट आकलन के लिए अनुमति देता है के बाद से इस पद्धति का महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है।
Abstract
ल्युकोसैट endothelial बातचीत तीव्र और जीर्ण सूजन में जल्दी और महत्वपूर्ण घटनाओं रहे हैं और, dysregulated जब, स्थायी रोग क्षति के लिए अग्रणी ऊतक चोट मध्यस्थता कर सकते हैं। मौजूदा पारंपरिक assays के ही खून से leukocytes की निकासी के बाद ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के विश्लेषण अनुमति देते हैं। इस परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स (PBLs) बदले में अनुसंधान के निष्कर्षों को प्रभावित करने PBLs प्रोत्साहित कर सकते हैं, जो विश्लेषण के लिए तैयार किया जा सकता से पहले कई चरणों से गुजरना करने के लिए रक्त की आवश्यकता है। autoperfused सूक्ष्म प्रवाह चैम्बर परख, हालांकि, वैज्ञानिकों ने एक लेपित चैम्बर जोड़ तोड़ की स्वतंत्रता होने जबकि एक लाइव माउस के प्रणालीगत प्रवाह का उपयोग कर कार्यात्मक अनियंत्रण जल्दी ल्यूकोसाइट्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। एक रोग मॉडल के माध्यम से, ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के कार्यात्मक अभिव्यक्ति का आकलन किया जा सकता है और स्थिर endothelial आसंजन अणुओं पूर्व vivo के साथ लेपित एक माइक्रो गिलास कक्ष में मात्रा निर्धारित। इस मॉडल में, खून बहता हैचेंबर में देशी PBLs की बातचीत की अनुमति सही आम मन्या धमनी और संज्ञाहरण के तहत एक जीवित माउस के बाएं बाहरी गले नस के बीच। वास्तविक समय प्रयोगात्मक विश्लेषण एक intravital माइक्रोस्कोप की सहायता के रूप में अच्छी तरह से एक हार्वर्ड उपकरण दबाव डिवाइस के साथ हासिल की है। कांच चैम्बर के इनपुट बिंदु पर एक प्रवाह नियामक के आवेदन के प्रयोगों के बीच तुलनीय शारीरिक प्रवाह की स्थिति की अनुमति देता है। ल्युकोसैट रोलिंग वेग मुख्य नतीजा है और स्वास्थ्य खुले उपयोग सॉफ्टवेयर ImageJ के राष्ट्रीय संस्थानों का उपयोग कर मापा जाता है। सारांश में, autoperfused सूक्ष्म प्रवाह चैम्बर परख ल्यूकोसाइट्स एन्दोथेलिअल बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक इष्टतम शारीरिक वातावरण प्रदान करता है और सूजन का अध्ययन जब शोधकर्ताओं ने सटीक निष्कर्ष आकर्षित करने की अनुमति देता है।
Introduction
शोथ चोट करने के लिए शरीर की सार्वभौमिक प्रतिक्रिया है और दोनों सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली समारोह में एक महत्वपूर्ण कदम है। चोट और / या भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में, endothelial कोशिकाओं विशिष्ट आसंजन अणुओं upregulate; यह मुख्य रूप से पद केशिका venules में, माइक्रोवैस्कुलर अन्तःचूचुक के माध्यम से परिस्त्राव ल्युकोसैट की ओर जाता है। इस प्रक्रिया अन्तःचूचुक पर खून में मुक्त बह leukocytes के लिए tethering के साथ शुरू होता है। स्थिर रोलिंग और बदले में स्थानांतरगमन और साइटोटोक्सिक एजेंटों का स्राव होता है, जो ल्यूकोसाइट्स की फर्म आसंजन, इस 1,2 tethering का पालन करें। Selectins झरना 3-5 के प्रारंभिक चरणों में मध्यस्थता करने के लिए जाना जाता है; integrins फर्म आसंजन और स्थानांतरगमन 1,6-8 के बाद के चरणों के लिए जिम्मेदार हैं।
सबूत के एक बढ़ती शरीर ischemia के reperfusion की चोट के पशु मॉडल में leukocytes और endothelial आसंजन अणुओं है महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है, अस्थमा, सोरायसिस, एकाधिक काठिन्य, और उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 9-12। इन शर्तों के तहत, भड़काऊ प्रतिक्रिया स्वस्थ ऊतकों का टूटना, जिसके परिणामस्वरूप एक ही शरीर पर हमला करने misdirected है। (जैसे गैर स्टेरायडल विरोधी भड़काऊ दवाओं, corticosteroids के, या अन्य एजेंटों के रूप में) मौजूदा विरोधी भड़काऊ एजेंट लंबी अवधि के उपयोग 13 से गंभीर साइड इफेक्ट का जोखिम ले। इसलिए, यह गैर विषैले 14 जबकि शेष अंततः वांछित विरोधी भड़काऊ प्रभाव है लक्षित किया जा सकता है, जो रोग विशिष्ट अणुओं की पहचान करने की क्षमता है, साथ उपयुक्त उपकरण है करने के लिए महान ब्याज की है।
ऐसे स्थिर ल्युकोसैट आसंजन परख के रूप में इन विट्रो तरीकों में मौजूदा रूप में जल्दी 1976 15 के रूप में इस्तेमाल कर रहे थे। समानांतर प्रवाह चैम्बर पहले प्रवाह शर्तों के तहत ल्युकोसैट endothelial बातचीत का अध्ययन करने के लिए 1987 में इन विट्रो में इस्तेमाल किया गया था। इन प्रयोगों में, हुमा प्रेरितएन शिरापरक रक्त से polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs) प्राथमिक मानव नाल की नस endothelial कोशिकाओं (HUVECs) की एक monolayer अधिक perfused थे। Hemodynamic प्रवाह की स्थिति के लिए नियंत्रित करने के लिए, हार्वर्ड उपकरण सिरिंज पंप 16 नियोजित किया गया था। वैकल्पिक रूप से, कृत्रिम ल्यूकोसाइट्स अलगाव से बचने के लिए, पूरे रक्त स्थिर आसंजन अणुओं 17 के साथ लेपित गिलास चैम्बर के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया गया था।
ल्युकोसैट उत्तेजना से बचने के लिए और mechanistically अनुमानित शारीरिक शर्तों के तहत आसंजन अणुओं के साथ उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए, एक पूर्व vivo autoperfused, extracorporal, धमनी-सर्किट में 16 विकसित किया गया था। इस सर्किट में, रक्त एकल या सह immobilized आसंजन अणुओं के साथ लेपित एक गिलास microflow कक्ष के भीतर देशी PBLs की बातचीत की अनुमति, संज्ञाहरण के तहत एक जीवित माउस का अधिकार आम मन्या धमनी और बाएं बाहरी गले नस के बीच बहती है। इस syste को एक प्रमुख लाभएम भड़काऊ रास्ते सीधे या परोक्ष रूप से छेड़छाड़ कर रहे हैं, जिसमें अनुवांशिक इंजीनियर चूहों, रोजगार करने की क्षमता है। इसके अतिरिक्त, प्रवाह शर्तों के तहत, बाहरी सक्रियण से मुक्त सूजन के लिए ल्युकोसैट आसंजन अणुओं के अलग योगदान तुच्छ करने की क्षमता नहीं है। प्रवाह चैम्बर के इनपुट बिंदु पर एक प्रवाह नियामक के आवेदन धमनी या शिरा प्रणालियों 18-22 या तो नकल करने कतरनी बलों की प्रयोगात्मक बदलाव की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है। यहाँ हम महान विस्तार में पूर्व vivo autoperfused microflow चैम्बर परख की तैयारी और प्रदर्शन के विषय में एक प्रोटोकॉल का वर्णन है।
Protocol
जानवरों पर सभी प्रयोगों नेत्र और विजन रिसर्च में जानवरों के इस्तेमाल के लिए दृष्टि और नेत्र विज्ञान वक्तव्य में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के अनुसार संभाल रहे थे, और दिशा निर्देशों और नियमों मैसाचुसेट्स आँख और कान दुर्बलता पशु की देखभाल समिति द्वारा निर्धारित।
प्रयोग से पहले दिन:
फ्लो चैंबर के लिए ट्यूबिंग का 1. तैयारी
- कंठ पक्ष तैयार करने के लिए, 5 सेमी पॉलीथीन ट्यूबिंग द्वारा पीछा 6 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग के लिए एक सेमी PE10 पॉलीथीन टयूबिंग कनेक्ट। मन्या पक्ष के लिए, के बारे में 1.5 सेमी की दूरी पर 1 सेमी पॉलीथीन टयूबिंग से 6 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग के भीतर एक टी-ट्यूब के अलावा के साथ कंठ ओर करने के लिए इसी तरह तैयार करते हैं (चित्रा 1 ए, बी)। टी-ट्यूब डालने के लिए आदेश में, यदि आवश्यक हो तो ठीक संदंश का उपयोग करके सिलिकॉन ट्यूब चौड़ा।
- दबाव transducer के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के 10 सेमी की एक छोर से कनेक्ट तो मन्या एस के टी अंत डालनेदूसरे छोर में आईडीई टी-ट्यूब। साइटों तंग कर रहे हैं संबंध सुनिश्चित करने और मुक्त रिसाव। यदि आवश्यक हो तो ट्यूबिंग, एक साथ फिट बैठता है, जहां अधिक parafilm का एक छोटा सा आयताकार टुकड़ा लागू करें, रिसाव (चित्रा 1C) को रोकने के लिए।
2. चैंबर कोटिंग
- Endothelial सतह कोटिंग प्रोटीन तैयार है (उदाहरण के लिए, पी selectin, कहनेवाला आसंजन अणु-1 (ICAM-1), नाड़ी कोशिका आसंजन प्रोटीन-1 (Vcam-1)) 0.1% BSA में। एक दिशानिर्देश के रूप में, प्रोटीन की एक माइक्रोग्राम प्रति 200 μl में बीएसए 4-5 कक्षों कोट करने के लिए पर्याप्त है। Endothelial सतह कोटिंग प्रोटीन के साथ प्रत्येक कक्ष (0.04 एक्स 0.4 x 50 मिमी) पानी में डालना, एक 25 जी सुई से जुड़ा एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करना। रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में लेपित कक्षों स्टोर।
प्रयोग के दिन:
3. चैंबर की तैयारी
- 4 डिग्री सेल्सियस से लेपित कक्षों निकालें और प्रत्येक पक्ष को कंठ और मन्या ट्यूबिंग कनेक्ट। Connecti सीलध्यान से ट्यूबिंग चैम्बर को पूरा करती है, जहां अधिक parafilm का एक छोटा सा आयताकार टुकड़ा खींच द्वारा ऑन्स। एक सिरिंज का प्रयोग, 0.1% बीएसए (रिसाव के लिए जाँच) के साथ चैम्बर और ट्यूबिंग भरें। 45 मिनट के लिए सेते हैं।
- पकवान के प्रत्येक पक्ष पर डिग्री काटने से चैम्बर धारण करने के लिए एक 35 मिमी पेट्री डिश तैयार करें। डिग्री में चैम्बर स्थिर; तो नोकदार स्थल पर डिश के लिए चैम्बर प्रत्यय सिलिकॉन की एक छोटी सी बूंद का उपयोग करें। चैम्बर खुर्दबीन के नीचे देख कर स्तर है सुनिश्चित करें। सिलिकॉन कम से कम 15 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
- हेपरिन के साथ एक 60 मिलीलीटर ताला लगा सिरिंज भरें और दबाव transducer से कनेक्ट। ट्रांन्सड्यूसर, सिलिकॉन टयूबिंग, और टी-ट्यूब: मन्या निम्नलिखित क्रम में ट्यूबिंग के लिए दबाव transducer कनेक्ट करें।
- ट्रांसड्यूसर और कनेक्शन को सुरक्षित करने के लिए टी-ट्यूब से जुड़ा सिलिकॉन टयूबिंग के बीच एक 1 सेमी PE50 का प्रयोग करें। दबाव दबाना (चित्रा -1) के माध्यम से कैरोटिड धमनी सिलिकॉन टयूबिंग गुजरती हैं। 100USP हेपरिन अपरोक्ष भागोऊ कोई हवाई बुलबुले ट्यूबिंग और चैम्बर कर रहे हैं जब तक।
4. सॉफ्टवेयर की स्थापना
- सॉफ्टवेयर तैयार करने के लिए, कंप्यूटर, माइक्रोस्कोप, और खुले प्रयोगशाला उपकरण चालू करें। डबल लीका आवेदन सूट (लास) (या समतुल्य) पर क्लिक करें और वीडियो को बचाने के लिए एक फोल्डर तैयार: ब्राउज़ कर → अधिग्रहण → फिल्म → क्लिप के अनुक्रम को परिभाषित (क्लिप = 15, रिकॉर्डिंग समय = 30 सेकंड, और अंतराल = 15 सेकंड) तो इस बात की पुष्टि करने के लिए "+" पर हस्ताक्षर क्लिक करें।
- प्रवाह के दबाव से ऊपर है, कदम 4.1 में रिकॉर्डिंग फ़ोल्डर में फ़ाइल नाम LabChart (या समतुल्य) फ़ाइल को खोलने और समन्वय रिकॉर्ड है।
5. सर्जिकल प्रक्रिया
- Ketamine (60 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (6 मिलीग्राम / किग्रा) के संयोजन का उपयोग एक 8-10 सप्ताह पुरानी माउस anesthetize इंट्रा-peritoneally (आईपी) इंजेक्शन। गहरी बेहोश करने की क्रिया पेडल वापसी पलटा के नुकसान से 5-10 मिनट के भीतर हासिल की है कि पुष्टि करें। आवश्यक हो, isoflurane हैंजरूरत के रूप में चेहरे नकाब के माध्यम से वितरित दिया जा सकता है।
- संज्ञाहरण के तहत, वहीं पिंजरे के तहत एक वार्मिंग पैड जगह है और शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। उचित संज्ञाहरण पुष्टि होती है, आंख का सूखापन को रोकने के लिए Bacitracin मरहम के साथ एक उदर स्थिति और कोट में आंखों माउस जगह है।
- इसके बाद, एक रेजर ब्लेड का उपयोग चीरा साइट पर बाल दाढ़ी और अच्छी तरह से शराब के साथ साइट को साफ।
- पूरी तरह से anesthetized एक बार टेप एक उदर स्थिति में माउस रखने के साथ पशु सुरक्षित। कैंची से गर्दन क्षेत्र बेनकाब और श्वासनली और वाहिकाओं (2A चित्रा) को बेनकाब करने के थायरॉयड ग्रंथि को हटा दें।
- यह पूरी तरह से वेगस तंत्रिका (चित्रा 2 बी) को नुकसान नहीं ख्याल रख रही अवगत कराया है जब तक मन्या धमनी साफ करें। सिवनी का एक टुकड़ा मोड़ो और उसके बाद मन्या नीचे सीवन के दो टुकड़े वहाँ अब कर रहे हैं ताकि मोड़ पर कटौती मन्या धमनी के नीचे मोड़ से गुजरती हैं। लूप समुद्री मील में प्रत्येक सिवनी (कस नहीं हैसमुद्री मील)।
- एक ही तरीके (चित्रा 2 डी) में टांके की तैयारी, बाईं गले नस (चित्रा -2) को बेनकाब करने के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ।
- माउस vasculature को ट्यूबिंग कनेक्ट करें।
- हेपरिन आईपी के 1 मिलीलीटर इंजेक्शन द्वारा माउस Heparinize।
- कैरोटिड धमनी पर ऊपरी सीवन कसो। यह मन्या धमनी (चित्रा 3A) पर जा सकते हैं के रूप में के रूप में कम पोत दबाना रखें। Microscissors के (3B चित्रा) का उपयोग करते हुए, एक छोटा सा चीरा, धमनी की परिधि के बारे में 1/8 ऊपरी सिवनी से धमनी पकड़ और बनाने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- ऊपरी सिवनी में और धमनी में बनाया चीरा में दूसरा गाँठ के माध्यम से कैरोटिड धमनी ट्यूबिंग गुजरती हैं। धमनी (; चित्रा -3 सी कई समुद्री मील एक तंग सील सुनिश्चित करने के लिए बनाया जाना चाहिए) ट्यूबिंग चारों ओर से सील किया गया है ताकि कम सिवनी बंद टाई।
- (गले नस ट्यूबिंग डालने के लिए पोत एक ही प्रक्रिया दोहराएँदबाना कंठ पक्ष के लिए की जरूरत नहीं है, चित्रा 3 डी)।
- पोत दबाना जारी करके प्रवाह का परीक्षण करें। कोई लीक कर रहे हैं, तो माइक्रोस्कोप माउस ले जाने और चैम्बर ट्यूबिंग (शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के प्रदर्शन के लिए संलग्न वीडियो देखें) मन्या ट्यूबिंग और गले नस कनेक्ट।
6. रिकॉर्डिंग रोलिंग वेग
- माउस संचार प्रणाली के साथ एक सर्किट बनाने, चैम्बर भरने के लिए मन्या दबाना खोलें। प्रवाह की स्थिति को स्थिर है, ताकि रक्त 3-5 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें। चैम्बर माइक्रोस्कोप उद्देश्य के साथ एक छोर से दूसरे के लिए स्तर है और इसके किनारे स्क्रीन पर वीडियो रिकॉर्डिंग खिड़की के साथ समानांतर इतना है कि 3-5 मिनट की प्रतीक्षा अवधि के दौरान, खुर्दबीन मंच समायोजित करें।
- कक्ष के माध्यम से बह कोशिकाओं दिखाई दे रहे हैं तो फिर डिश में 10X पानी विसर्जन उद्देश्य कम पानी के साथ कांच चैम्बर युक्त संशोधित पेट्री डिश भरें।प्रकाश की तीव्रता कोशिकाओं की पर्याप्त को देखने के लिए समायोजित किया जा सकता है। आम तौर पर एक कम तीव्रता बेहतर है।
- ट्रांसड्यूसर एक मध्यम शारीरिक प्रवाह दबाव के correlating, एक स्थिर 30 मिमी पारा पढ़ता है, इसलिए है कि या के रूप में वांछित ट्यूबिंग पर दबाना समायोजित करें।
- प्रेस वीडियो और गले का अंत करने के लिए करीब है और पूरा जब तक मन्या अंत की ओर प्रवाह के खिलाफ चल पहली बार चूक के साथ दबाव दोनों रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए "शुरू"।
नोट: विभिन्न आसंजन अणुओं का उपयोग कर कई कोटिंग शर्तों कई कक्षों का उपयोग करके एक ही माउस में अध्ययन किया जा सकता है। केवल एक ही कक्ष में एक समय में दर्ज की गई है।- रिकॉर्डिंग समाप्त हो गया है, रक्त प्रवाह को रोकने, इनपुट स्थल पर वाल्व बंद कर दें। चैम्बर निकालें और दूसरे हाथ में एक हाथ में ठीक संदंश और अंडाकार संदंश का उपयोग सर्किट (एक अलग आसंजन अणु के साथ लेपित) एक नया कक्ष फिट बैठते हैं। चरणों में उल्लिखित के रूप में नए चैम्बर के लिए रिकॉर्डिंग फिर से शुरू6.1-6.4।
- सीओ द्वारा प्रयोग के अंत में एक रीढ़ की हड्डी की अव्यवस्था के बाद दो asphyxiation के सभी चूहों euthanize। प्रक्रिया है, इसलिए, चूहों प्रयोग के अंत में एक रीढ़ की हड्डी की अव्यवस्था से टर्मिनल euthanized हैं है।
7. परिणामों की व्याख्या
- दर्ज आंकड़ों ImageJ सॉफ्टवेयर 23 के लिए 'एम TrackJ "प्लगइन का उपयोग का विश्लेषण करने के लिए।
- फ़ाइल का चयन करें → आयात → AVI के → स्केल में कन्वर्ट द्वारा स्केल के लिए फ़ाइल में परिवर्तित।
- वैश्विक → फ्रेम अंतराल (मैं) में प्रवेश संपत्ति → → चयन करें → छवि से तख्ते मानकीकरण। (छवि जम्मू वीडियो विंडो के ऊपरी कोने में दिखाया गया है) एक वीडियो में फ्रेम की संख्या से कुल वीडियो अवधि (आमतौर पर 30 सेकंड) विभाजित करके फ्रेम अंतराल की गणना।
- एम TrackJ → एक ल्युकोसैट चयन पटरियों को जोड़ने → → चयन करें प्लगइन द्वारा प्रत्येक ल्युकोसैट के प्रवाह को मापने→ 15 के लिए प्रत्येक फ्रेम के साथ यह ट्रैक - 20 सेकंड → विलय।
- ध्यान में रखते हुए सभी ल्यूकोसाइट्स के लिए दोहराएँ कदम 7.4।
- दो कॉलम की प्रतिलिपि → एम TrakJ के सभी दिखाई देते हैं → चयन करें उपाय से leukocytes के माध्य रोलिंग वेग का निर्धारण: एक स्प्रेडशीट में पटरियों। "वी मतलब" लेबल स्तंभ पिक्सल / सेकेंड में मापा ल्युकोसैट रोलिंग है। 03/02 से विभाजित करके माइक्रोन / सेकंड में कन्वर्ट।
- एक स्प्रेडशीट में दबाव डेटा पर प्रकाश डाला और निर्यात का विश्लेषण और निम्न गणना प्रदर्शन करने के लिए: ΔP (मिमी पारा) और टी (डाएन / 2 सेमी) प्रत्येक प्रायोगिक समूह के बीच एक तुलना के लिए। गणना करने के बाद, रेखांकन के लिए चश्मे सॉफ्टवेयर में डाटा कॉपी।
Representative Results
प्रत्येक रिकॉर्डिंग केवल बातचीत ल्यूकोसाइट्स के दौरान कक्ष पर स्पष्ट कर रहे हैं। एक प्रतिनिधि प्रयोग से परिणाम चित्रा 4 में देखा जा सकता है। सफेद तीर ब्याज की आसंजन अणु के द्वारा कब्जा कर लिया गया है और रक्त प्रवाह के भीतर अन्य मुक्त बह लोगों के बीच चैम्बर के साथ चल रहे हैं कि व्यक्तिगत ल्यूकोसाइट्स को इंगित करें। कक्ष के बाहर एक आम विरूपण साक्ष्य सभी छवियों में बड़ी अंधेरे क्षेत्रों के साथ देखा जा सकता है। अंधेरे क्षेत्रों पाठक एक नियत बिन्दु के संबंध में ल्युकोसैट आंदोलन की सराहना की मदद। 22 सेकंड की अवधि में leukocytes उन्नति क्षेत्रों के संबंध में देखा जा सकता है। एक ही व्यक्ति में ग्राफ TX1 रोलिंग वेग (बाईं ओर एक पारी) कम हो जाती है और TX2 नियंत्रण की तुलना में वेग (सही करने के लिए एक पाली) बढ़ जाती है जहां डेटा की एक अंतिम साजिश को दर्शाता है।
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चित्रा 1: प्रवाह चैम्बर के लिए ट्यूबिंग की तैयारी। (ए) उपकरण सिलिकॉन 002, वाई ट्यूब, टी ट्यूब, 35 मिमी पेट्री डिश, ठीक संदंश, ठीक कैंची ट्यूबिंग, ट्यूबिंग और चैम्बर विधानसभा (माइक्रो कांच चैम्बर 0.4 एक्स 0.04 x 50 मिमी, पॉलीथीन ट्यूबिंग PE10, पॉलीथीन ट्यूबिंग PE60 के लिए आवश्यक है, ट्यूब धारक, नाड़ी बंद करना, 7-0 रेशम सीवन। लेपित कक्ष के माध्यम से माउस रक्त का प्रवाह फिर से निर्देशन के लिए मन्या धमनी और गले नस ट्यूबिंग (बी) तैयार करना। (सी) के दबाव transducer से कैरोटिड धमनी ट्यूबिंग कनेक्ट कर रहा है। (डी) रक्त के प्रवाह की दर को समायोजित करने के लिए दबाना के माध्यम से transducer से ट्यूबिंग गुजरती हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: ट्यूबिंग कनेक्ट कर रहा है करने के लिए टीवह धमनी और गले नस मन्या। (ए) मन्या पर ऊपरी गाँठ कस और कम गाँठ नीचे दबाना जगह है। (बी) microscissors का प्रयोग, मन्या में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए, के बारे में 1/8 परिधि (बिंदीदार पीला सर्कल चीरा इंगित करता है)। ( सी) मन्या में टयूबिंग डालें और कम से कम दो टांके (हरी बिंदीदार रेखा ट्यूबिंग और पीले बिंदीदार रेखा मन्या धमनी से पता चलता है) के साथ सुरक्षित है। (डी) इसी प्रकार हरी बिंदीदार रेखा ट्यूबिंग और पता चलता है (कंठ में ट्यूबिंग डालने पीले बिंदीदार रेखा गले नस)। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: प्रवाह चाम के माध्यम से रोलिंग leukocytes के प्रतिनिधि समय पाठ्यक्रमदिसंबर (स्केल बार = 100 माइक्रोन) (सफेद तीर रोलिंग ल्यूकोसाइट्स बाहर बिंदु)। ग्राफ एक रेखांकन कार्यक्रम में निर्यात करने के बाद प्रतिनिधि परिणाम दर्शाया गया है (TX1 और TX2 प्रयोगात्मक उपचार समूह हैं और सीटीआर नियंत्रण समूह है)। Tx2 वेग रोलिंग ल्यूकोसाइट्स में वृद्धि को दर्शाती एक सही बदलाव की ओर जाता है, जबकि TX1 वेग और अनुपचारित समूह (सीटीआर) की तुलना में ग्राफ के बाईं पारी रोलिंग ल्यूकोसाइट्स में कमी करने के लिए अग्रणी को धीमा leukocytes जिसमें एक इलाज का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया क्लिक करें यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
Discussion
ल्युकोसैट भर्ती की प्रक्रिया भड़काऊ प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है; यह है कि वे अपने प्रेरक समारोह लागू करने में सक्षम हैं, जहां लक्ष्य ऊतकों की ओर संचार प्रणाली से leukocytes के प्रवास शामिल है। ल्युकोसैट भर्ती ऐसे atherosclerotic सजीले टुकड़े, रोधगलन, ischemia / reperfusion, और प्रत्यारोपण शल्य चिकित्सा के एक है, साथ ही कई सीएनएस संबंधित न्यूरो भड़काऊ शर्तों 10-12,20,24,25 के रूप में भड़काऊ स्थितियों की एक किस्म में अभिन्न अंग है। ल्युकोसैट भर्ती फैला, autoperfused microflow चैम्बर अन्वेषक ल्युकोसैट प्रवास गतिशीलता का अध्ययन करने की क्षमता की अनुमति के लिए एक अनिवार्य उपकरण प्रदान करता है कि बीमारी की स्थिति की विविधता को ध्यान में रखते हुए।
पिछले कई दशकों में, इन विट्रो assays की एक किस्म ल्युकोसैट सेल आसंजन 26 की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। दुर्भाग्य से, इन assays के सभी की निकासी की आवश्यकता होती हैखून से ल्यूकोसाइट्स, यांत्रिक सक्रियण शुरू। Vivo में पर्यावरण के लिए करीब पाने के लिए, रूपांतरों पूरे रक्त के नमूने लेने और hemodynamic प्रवाह की स्थिति 16,17 नियंत्रित करने के लिए किए गए थे। यहाँ, हम माउस संचार प्रणाली के लिए एक लेपित चैम्बर जोड़ने के द्वारा क्षेत्र में पिछले अग्रिमों का विस्तार। हम एक शारीरिक श्रृंखला के लिए रक्त के प्रवाह को विनियमित करने और ल्युकोसैट रोलिंग की गतिशीलता का अध्ययन करने में सक्षम हैं। लेपित चैम्बर हमें विशिष्ट आसंजन अणुओं के साथ ल्युकोसैट बातचीत का अध्ययन करने की क्षमता देता है। प्रणाली एक लाइव माउस द्वारा संचालित एक इकाई के रूप में कार्य कर रहा है के बाद से, यह और अधिक बारीकी से हमें immunologic माउस मॉडल की एक किस्म में ल्युकोसैट endothelial बातचीत का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, प्राकृतिक वातावरण mimics। इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली हमें उपलब्ध कई आनुवंशिक माउस मॉडल का लाभ लेने के लिए अनुमति देता है। प्रणाली पूरी तरह से vivo वातावरण में नकल नहीं करता है, यह specifi के अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदान करता हैशारीरिक शर्तों के तहत leukocytes के सी तत्वों, जो पहले संभव नहीं किया गया है कि एक करतब। इस एक कदम और करीब एक अधिक शारीरिक पर्यावरण के लिए हमें लगता है कि भले ही व्यवस्था करने के लिए सीमाएं हैं। हम चैम्बर कोटिंग करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं कि ल्युकोसैट बातचीत के कुछ तत्वों का आकलन करने में सक्षम हैं, तो यह पूरी तरह से vasculature की जटिल 3 डी मैट्रिक्स नकल नहीं करता है। इसके अलावा, महान देखभाल प्रोटोकॉल में उल्लिखित सभी चरणों का पालन करके माउस संचलन के लिए एक बंद व्यवस्था सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए। हवा के बुलबुले की शुरूआत काफी प्रयोगों की सटीकता और reproducibility को प्रभावित करेगा।
हम ल्युकोसैट रोलिंग गतिशीलता का आकलन करने के लिए Autoperfused Microflow चैंबर के उपयोग का वर्णन जबकि प्रक्रिया रोगों की एक किस्म का अध्ययन करने के जांचकर्ताओं द्वारा व्यक्तिगत होने की संभावना है। उदाहरण के लिए, कैंसर की कोशिकाओं को ल्यूकोसाइट्स द्वारा साझा आम integrins के कई व्यक्त metastasize। पढ़ाईजी अधिक बारीकी से हमारे ज्ञान में मदद कर सकता है एक vivo वातावरण mimics कि एक सेटिंग है, और कुछ कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामक प्रकृति के संभवतः भविष्यवाणी में उनके रोलिंग गतिशीलता। एक संभव दृष्टिकोण व्यक्त GFP कैंसर कोशिकाओं के रोलिंग की गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए प्रवाह चैम्बर परख के साथ साथ, इस तरह के GFP के रूप में 27 कैंसर की कोशिकाओं, के लिए एक लेबलिंग तकनीक गठबंधन करने के लिए हो सकता है। यह इस प्रक्रिया आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों और रोग मॉडल के साथ संयोजन में अन्य प्रयोगशालाओं में प्रयोग के लिए संशोधित किया गया है कि कैसे देखना दिलचस्प होगा पदार्थों की एक किस्म के साथ चैम्बर कोटिंग और एक ही माउस के लिए कई कक्षों को जोड़ने के लचीलेपन को देखते हुए। हम यहाँ वर्णन तकनीक बस केवल अन्वेषक की रचनात्मकता से सीमित है कि एक बहुत व्यापक आवेदन क्षमता पर छू लेती है।
Acknowledgments
R01EY022084 / एस 1 (केएमसी), T32EY007145 (एचएस) और P30EY014104: इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान पुरस्कार संख्या के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय नेत्र संस्थान द्वारा समर्थित किया गया। सामग्री केवल लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के आधिकारिक विचार का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। अतिरिक्त सहायता मैसाचुसेट्स लायंस नेत्र रिसर्च फंड (केएमसी) और (केएमसी के लिए) को रोकने अंधापन रिसर्च से एक विशेष विद्वान पुरस्कार प्रदान किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro glass chamber 0.4 x 0.04 x 50 mm | VitroCom | 2540-050 | |
| Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 | |
| Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 | |
| Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A | |
| Y tube | Value Plastics | Y210-6 | |
| T tube | value plastics | T410-6 | |
| Silicone gel | Hardware store - Home Depo | ||
| 35 mm Petri dish | Corning | 430165 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 | |
| Fine forceps | FST | 11253-25 | |
| Fine scissors | FST | 15000-08 | |
| Tube holder | FST | 00608-11 | |
| Clamp applicator | FST | 18057-14 | |
| Vascular clamp | FST | 18055-04 | |
| 6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 | |
| 25 x 1 G needles | BD | 305125 | |
| 30 x 1/2 G needles | BD | 305106 | |
| Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |
References
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