Summary
Qui, presentiamo un protocollo che permette al ricercatore di valutare dinamiche reclutamento di leucociti ex vivo collegando una camera rivestita con molecole di adesione endoteliali derivate al sistema circolatorio di un topo. Questo metodo offre notevoli vantaggi, in quanto permette di valutazione leucociti in condizioni biologiche relative.
Abstract
Interazioni leucociti-endotelio sono precoci e importanti eventi in infiammazione acuta e cronica e può, quando deregolazione, mediare lesioni dei tessuti che porta a danni permanenti patologico. Esistenti saggi convenzionali consentono l'analisi di molecole di adesione leucocitaria solo dopo l'estrazione dei leucociti dal sangue. Questo richiede il sangue sottoporsi a diversi passaggi prima leucociti del sangue periferico (PBL) possono essere pronti per l'analisi, che a sua volta può stimolare PBLs influenzano i risultati della ricerca. Il test camera di flusso micro autoperfused, tuttavia, consente agli scienziati di studiare i primi leucociti disregolazione funzionale al flusso sistemico di un topo vivo pur avendo la libertà di manipolare una camera rivestita. Attraverso un modello di malattia, l'espressione funzionale di molecole di adesione leucocitaria può essere valutata e quantificata in una camera di micro-vetro rivestito con le molecole di adesione endoteliale immobilizzati ex vivo. In questo modello, il sangue scorretra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo l'interazione di PBLs nativi nella camera. Analisi sperimentale in tempo reale è ottenuto con l'aiuto di un microscopio intravitale, nonché un dispositivo di pressione Apparecchiatura Harvard. L'applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di vetro permette comparabili condizioni fisiologiche di flusso tra gli esperimenti. La velocità di rotolamento dei leucociti è il risultato principale e si misura con il National Institutes of Health open-access software ImageJ. In sintesi, il autoperfused micro test camera di flusso fornisce un ambiente fisiologico ottimale per studiare l'interazione leucociti endoteliale e permette ai ricercatori di trarre conclusioni precise quando si studia l'infiammazione.
Introduction
L'infiammazione è la risposta universale del corpo di infortunio ed è un passo cruciale sia la funzione del sistema immunitario innato e adattativo. In risposta al danno e / o stimoli infiammatori, le cellule endoteliali upregulate molecole di adesione specifici; questo porta a leucociti stravaso attraverso l'endotelio microvascolare, soprattutto in venule post-capillari. Questo processo inizia con tethering dei leucociti flusso libero nel sangue sull'endotelio. Rolling stabile e ferma adesione dei leucociti, che a sua volta conduce alla trasmigrazione e la secrezione di agenti citotossici, seguono questa legare 1,2. Selectine sono noti per mediare i primi passaggi della cascata 3-5; integrine sono responsabili per i passi successivi della ditta adesione e la trasmigrazione 1,6-8.
Un crescente corpo di evidenza suggerisce leucociti e molecole di adesione endoteliali hanno un ruolo fondamentale in modelli animali di ischemia riperfusione, Asma, psoriasi, sclerosi multipla, e la degenerazione maculare senile 9-12. In queste condizioni, la risposta infiammatoria è indirizzato ad attaccare il proprio corpo, con conseguente rottura del tessuto sano. Agenti anti-infiammatori esistenti (come i farmaci non steroidei anti-infiammatori, corticosteroidi o altri agenti chemioterapici) comportano il rischio di gravi effetti collaterali con l'uso a lungo termine 13. Pertanto, è di grande interesse per avere gli strumenti appropriati con la capacità di identificare molecole malattie specifiche, che alla fine possono essere mirati ad avere l'effetto anti-infiammatorio desiderata rimanendo atossico 14.
Esistenti metodi in vitro, come il test di adesione leucocitaria statico sono state usate come già nel 1976 15. La camera di flusso parallelo è stato impiegato in vitro nel 1987 per studiare le interazioni leucociti-endotelio in condizioni di flusso. In questi esperimenti, stimolato Human leucociti polimorfonucleati (PMN) dal sangue venoso sono stati perfusi su un monostrato di cellule primarie umane vena ombelicale endoteliali (HUVEC). Per controllare le condizioni di flusso emodinamico, la pompa a siringa Harvard Apparatus 16 è stato impiegato. In alternativa, per evitare l'isolamento leucociti artificiale, sangue intero è stato usato in combinazione con la camera di vetro rivestito con molecole di adesione immobilizzati 17.
Per evitare la stimolazione dei leucociti e studiare meccanicamente la loro interazione con le molecole di adesione in condizioni fisiologiche approssimativi, un ex vivo autoperfused, extracorporea, circuito artero è stato sviluppato 16. In questo circuito, il sangue scorre tra il diritto carotide comune e sinistra vena giugulare esterna di un topo vivo sotto anestesia, permettendo interazione di PBLs nativi entro una camera microflusso vetro rivestito con molecole singole o co-immobilizzato adesione. Uno dei principali vantaggi di questo system è la capacità di impiegare topi geneticamente ingegnerizzati, in cui vie infiammatorie sono manipolati direttamente o indirettamente. Inoltre, vi è la possibilità di individuare il contributo isolato di molecole di adesione leucocitaria all'infiammazione, gratuitamente attivazione esterna, in condizioni di flusso. L'applicazione di un regolatore di flusso al punto di ingresso della camera di flusso fornisce una vasta gamma di variazioni sperimentali di forze di taglio per mimare sia arterioso o venoso 18-22. Qui si descrive in grande dettaglio un protocollo sulla preparazione e le prestazioni della ex vivo autoperfused microflusso test camera.
Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati trattati in conformità con l'Associazione per la Ricerca e la Visione e Oftalmologia Dichiarazione per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e le linee guida e regolamenti stabiliti dal Massachusetts Eye and Ear Infirmary Comitato Animal Care.
Il giorno prima dell'esperimento:
1. Preparazione di tubi per camera di flusso
- Per preparare il lato giugulare, collegare 1 centimetro PE10 tubo di polietilene per tubi di silicio 6 centimetri seguita da tubo di polietilene 5 centimetri. Per il lato carotide, preparare in modo simile al lato giugulare con l'aggiunta di un tubo a T nel tubo di silicio 6 centimetri circa 1,5 cm di distanza dal tubo di polietilene da 1 cm (Figura 1A, B). Per inserire il tubo a T, allargare il tubo in silicone utilizzando una pinza sottile se necessario.
- Collegare un'estremità di 10 cm di tubo in silicone al trasduttore di pressione poi inserire l'estremità T della carotide side T-tube nell'altra estremità. Assicurarsi che il collegamento siti sono stretti e perdite. Applicare un piccolo pezzo rettangolare di parafilm su dove il tubo adatta insieme, se necessario, per impedire la perdita (Figura 1C).
2. Rivestimento della Camera
- Preparare la proteina di rivestimento endoteliale (ad esempio, P selectina, ICAM-1 (ICAM-1), vascolari proteina-1 di adesione cellulare (VCAM-1)) in 0,1% BSA. Come linea guida, 1 mg di proteina in 200 ml BSA è sufficiente per ricoprire 4-5 camere. Usando una siringa da 1 ml collegato ad un ago 25 G, infondere ciascuna camera (0,04 x 0,4 x 50 mm) con proteine rivestimento endoteliale. Conservare le camere rivestite in una provetta da 15 ml a 4 ° C durante la notte.
Il giorno dell'esperimento:
3. Preparare la Camera
- Rimuovere le camere rivestite da 4 ° C e collegare il tubo giugulare e carotide per ogni lato. Sigillare le connections allungando con attenzione un piccolo pezzo rettangolare di parafilm su dove il tubo incontra la camera. Utilizzando una siringa, riempire la camera e il tubo con il 0,1% di BSA (controllo delle perdite). Incubare per 45 min.
- Preparare un piatto 35 millimetri Petri per contenere la camera tagliando tacche su ciascun lato del piatto. Stabilizzare la camera in tacche; quindi utilizzare una piccola goccia di silicone per apporre la camera al piatto al sito dentata. Assicurarsi che la camera sia in piano, cercando al microscopio. Lasciare che il silicone asciugare per almeno 15 minuti.
- Riempire una siringa da 60 ml di bloccaggio con eparina e collegarsi al trasduttore di pressione. Collegare il trasduttore di pressione al tubo carotide nel seguente ordine: trasduttore, tubo in silicone, e T-tubo.
- Utilizzare un PE50 1 cm tra il tubo in silicone collegato al trasduttore e il tubo a T per fissare il collegamento. Passare il tubo in silicone carotide attraverso il morsetto pressione (Figura 1D). Eseguire 100USP eparina through il tubo e la camera fino a quando non ci siano bolle d'aria.
4. Configurazione del Software
- Per preparare il software, accendere il computer, microscopio, e il dispositivo di laboratorio aperto. Fare doppio clic sulla suite di applicazioni Leica (LAS) (o equivalente) e preparare una cartella in cui salvare il video: sfogliare → → acquisire film → definire sequenza di clip (clip = 15, tempo di registrazione = 30 sec, e gli intervalli = 15 sec) quindi fare clic sul segno "+" per confermare.
- Per registrare la pressione del flusso aprire il LabChart (o equivalente) di file e coordinare il nome del file nella cartella di registrazione nella fase 4.1, sopra.
5. Procedura chirurgica
- Anestetizzare un 8-10 settimane di età mouse utilizzando una combinazione di ketamina (60 mg / kg) e xilazina (6 mg / kg) iniettata intra-peritoneally (IP). Verificare che la sedazione profonda viene raggiunto entro 5-10 minuti dalla perdita di recesso pedale reflex. Se necessario, isofluranodistribuito mediante maschera facciale può essere somministrato come necessario.
- Mentre in anestesia, posizionare un pad riscaldamento sotto la gabbia e impostare a 37 ° C per mantenere la temperatura corporea. Una volta che l'anestesia corretta è confermato, posizionare il mouse in una posizione ventrale e cappotto gli occhi con bacitracina unguento per prevenire la secchezza oculare.
- Successivamente, radersi i capelli al sito di incisione con una lama di rasoio e pulire accuratamente il sito con l'alcol.
- Una volta completamente anestetizzato fissare l'animale con nastro mantenere il mouse in posizione ventrale. Esporre la zona del collo con le forbici e rimuovere la ghiandola tiroidea per esporre la trachea e navi (Figura 2A).
- Pulire la carotide finché non è completamente esposto facendo attenzione a non danneggiare il nervo vago (Figura 2B). Piegare un pezzo di sutura e superare la curva sotto la carotide poi tagliare alla curva così ora ci sono 2 pezzi di sutura sotto la carotide. Loop ogni sutura in nodi (non stringere lanodi).
- Ripetere la stessa procedura per esporre la vena giugulare sinistra (Figura 2C), preparazione delle suture nello stesso modo (Figura 2D).
- Collegare il tubo alla vascolarizzazione del mouse.
- Eparinizzare il mouse iniettando 1 ml di eparina IP.
- Serrare la sutura superiore sulla carotide. Posizionare il morsetto nave a partire da esso può andare sulla carotide (Figura 3A). Utilizzare pinze per tenere l'arteria dalla sutura superiore e fare una piccola incisione, circa 1/8 della circonferenza dell'arteria, utilizzando i microscissors (Figura 3B).
- Passare il tubo carotide attraverso il secondo nodo nella sutura superiore e nella incisione fatta nell'arteria. Tie off sutura inferiore in modo che l'arteria è sigillata attorno al tubo (diversi nodi devono essere effettuate per garantire una tenuta stagna; la figura 3C).
- Ripetere la stessa procedura per inserire il tubo vena giugulare (navemorsetto non è necessaria per il lato giugulare; Figura 3D).
- Controllare la portata rilasciando il morsetto nave. Se non ci sono perdite di muovere il mouse per il microscopio e collegare il tubo carotide e della vena giugulare per il tubo della camera (vedi video allegato per la dimostrazione di intervento chirurgico).
6. Registrazione di rotolamento Velocity
- Aprire il morsetto carotide per riempire la camera, rendendo un circuito con il sistema circolatorio del mouse. Lasciare il sangue di circolare per 3-5 minuti in modo che le condizioni di flusso stabilizzano. Durante il periodo di attesa di 3-5 min, regolare la fase di microscopio in modo che la camera è a partire da un'estremità all'altra con l'obiettivo microscopio ed il suo bordo è parallelo alla finestra di registrazione video sullo schermo.
- Riempire il piatto Petri modificato contenente la camera di vetro con acqua quindi abbassare l'obiettivo 10X immersione in acqua nel piatto in modo che le cellule che scorre attraverso la camera sono visibili.L'intensità della luce può essere regolato per un'adeguata visualizzazione delle cellule. Generalmente una minore intensità è migliore.
- Regolare la fascetta sul tubo in modo che il trasduttore legge un costante 30 mm Hg, correlando a media pressione di flusso fisiologico, o come desiderato.
- Premere "start" per avviare la registrazione sia il video e la pressione con il primo time lapse vicino alla fine giugulare e muoversi contro il flusso verso l'estremità carotide fino completata.
NOTA: Diverse condizioni di rivestimento utilizzando diverse molecole di adesione possono essere studiati nello stesso mouse utilizzando camere multiple. Solo una camera è registrata in una volta.- Quando la registrazione è terminata, chiudere la valvola nel sito di ingresso, fermando il flusso di sangue. Rimuovere la camera e inserire una nuova camera (rivestito con una diversa molecola di adesione) al circuito utilizzando una pinza sottile in una mano e pinze scanalati con l'altra mano. Riprendere la registrazione per la nuova camera come indicato nei passi6,1-6,4.
- Euthanize tutti i topi da CO 2 asfissia seguita da una dislocazione del midollo spinale alla fine dell'esperimento. La procedura viene terminale, quindi, i topi vengono sacrificati per dislocazione del midollo spinale alla fine dell'esperimento.
7. Interpretazione dei risultati
- Per analizzare i dati registrati utilizzano il plugin "M TrackJ" per il software ImageJ 23.
- Convertire il file in scala di grigi da selezionare File → Importa → → AVI convertire in scala di grigi.
- Standardizzare le cornici Seleziona → un'immagine → proprietà → per inserire gli intervalli di telaio (i) → globale. Calcolare gli intervalli telaio dividendo la durata complessiva video (di solito 30 sec) per il numero di frame in un video (indicato nell'angolo superiore della finestra video J Image).
- Misurare il flusso di ogni leucociti Select plug → M TrackJ → Aggiungi brani → selezionare un leucociti→ seguirli con ogni fotogramma per 15-20 sec → Merge.
- Ripetere il punto 7.4 per tutti i leucociti in vista.
- Determinare la velocità media di rotolamento dei leucociti da Select misura → due colonne → Copia appaiono tutte le M TrakJ: tracce in un foglio di calcolo. La colonna "V significa" è il rotolamento dei leucociti misurata in pixel / secondo. Convertire in micron / sec dividendo per 2/3.
- Per analizzare l'evidenziazione dei dati di pressione e di esportazione in un foglio di calcolo ed eseguire il seguente calcolo: Ap (mm Hg) e t (dyne / cm 2) per un confronto tra ciascun gruppo sperimentale. Una volta calcolato, copiare i dati in un software per la rappresentazione grafica del prisma.
Representative Results
Durante ogni registrazione leucociti solo interagiscono sono evidenti sulla camera. I risultati di un esperimento rappresentativo può essere visto in Figura 4. Le frecce bianche indicano i singoli leucociti che sono stati catturati dalla molecola di adesione di interesse e sono a rotazione lungo la camera tra le altre quelle fluidità all'interno del flusso sanguigno. Un artefatto comune fuori la camera può essere visto con le grandi sfere scure in tutte le immagini. Le sfere scuri aiutano il lettore apprezzare il movimento dei leucociti in relazione ad un punto fisso. Leucociti avanzamento per un periodo di 22 sec può essere visto in relazione alle sfere. Il grafico nella stessa figura mostra un grafico finale dei dati dove Tx1 diminuisce la velocità di rotazione (uno spostamento verso sinistra) e Tx2 aumenta la velocità (uno spostamento verso destra) rispetto al controllo.
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Figura 1: Preparazione del tubo per la camera di flusso. (A) Strumenti necessari per le tubazioni e il montaggio della camera (micro camera di vetro 0,4 x 0,04 x 50 mm, in polietilene tubi PE10, tubi in polietilene PE60, tubi di silicio 002, tubo Y, tubo T, 35 millimetri piatto di Petri, una pinza sottile, forbici sottili, supporto del tubo, morsetto vascolare, sutura di seta 7-0. (B) Preparazione della carotide e la vena giugulare tubi per re-indirizzare il mouse flusso di sangue attraverso la camera rivestito. (C) Collegamento l'arteria carotide tubo al trasduttore di pressione. (D) Far passare il tubo dal trasduttore attraverso il morsetto per regolare la velocità del flusso sanguigno. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. L'esposizione del carotide e della vena giugulare (A) ha tagliato con cura la zona del collo per esporre la trachea (B) Pulire la carotide destra in modo che un pezzo di sutura può essere passato sotto l'imbarcazione (punteggiato giallo. linea delinea la carotide). (C) Pulire la vena giugulare sinistra in modo che un pezzo di sutura può essere passato sotto la nave (linea gialla punteggiata delinea la vena giugulare). (D) organizza vagamente legato suture alle regioni superiori e inferiori della carotide e della vena giugulare (frecce indicano le regioni superiori e inferiori delle navi). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Collegamento del tubo a tegli carotide e della vena giugulare. (A) Stringere il nodo superiore sulla carotide e posizionare il morsetto sotto il nodo più basso. (B) Con i microscissors, fare una piccola incisione nella carotide, di circa 1/8 la circonferenza (punteggiata cerchio giallo indica l'incisione). ( C) Inserire il tubo nella carotide e sicuro con almeno due suture (linea tratteggiata verde indica il tubo e la linea tratteggiata gialla carotide). (D) Analogamente inserire tubi in giugulare (linea tratteggiata verde indica il tubo e la giallo linea tratteggiata la vena giugulare). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: decorso Rappresentante dei leucociti rotolano attraverso il cham flussoBER (Scala bar = 100 micron) (frecce bianche indicano leucociti rotolamento). Il grafico illustra i risultati di rappresentanza dopo l'esportazione in un programma di grafica (Tx1 e Tx2 sono gruppi di trattamento sperimentale e CTR è il gruppo di controllo). Tx1 rappresenta un trattamento in cui leucociti rallentare portando ad una diminuzione della velocità di leucociti e uno spostamento a sinistra del grafico rispetto al gruppo non trattato (CTR) laminazione, mentre Tx2 porta ad uno spostamento a destra che riflette un aumento della velocità di rotolamento leucociti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il processo di reclutamento dei leucociti è un passo cruciale nella risposta infiammatoria; comporta la migrazione dei leucociti dal sistema circolatorio verso tessuti bersaglio, dove sono in grado di esercitare la loro funzione effettrice. Il reclutamento dei leucociti è integrale in una varietà di condizioni infiammatorie come placche aterosclerotiche, infarto miocardico, ischemia / riperfusione e chirurgia dei trapianti 1, così come più CNS relative condizioni neuro-infiammatori 10-12,20,24,25. Considerando la diversità delle condizioni di malattia che si estende il reclutamento dei leucociti, la camera di microflusso autoperfused fornisce uno strumento indispensabile che consente al ricercatore la possibilità di studiare la dinamica di migrazione dei leucociti.
Nel corso degli ultimi decenni, una serie di test in vitro sono stati sviluppati per studiare la dinamica dei leucociti cella adesione 26. Purtroppo, tutti questi saggi richiedono l'estrazione dii leucociti dal sangue, introducendo attivazione meccanica. Per avvicinarsi all'ambiente in vivo, sono stati effettuati adattamenti per raccogliere campioni di sangue intero e controllare le condizioni di flusso emodinamico 16,17. Qui, si estendono i progressi precedenti nel campo collegando una camera rivestita al sistema circolatorio del mouse. Possiamo regolare il flusso del sangue in un intervallo fisiologico e studiare la dinamica di leucociti rotolamento. La camera rivestita ci dà la possibilità di studiare le interazioni leucociti con specifiche molecole di adesione. Poiché il sistema funziona come unità azionata da un topo vivo, imita più strettamente l'ambiente naturale, consentendo di studiare le interazioni leucociti-endotelio in una varietà di modelli di topo immunologici. Inoltre, questo sistema ci permette di trarre vantaggio dalle molteplici modelli murini genetiche disponibili. Mentre il sistema non replica completamente l'ambiente in vivo, fornisce una piattaforma per studiare specifielementi c dei leucociti in condizioni fisiologiche, una prodezza che non è stato possibile in precedenza. Anche se questo ci porta un passo avanti verso un ambiente più fisiologica ci sono limitazioni al sistema. Essa non replica completamente la complessa matrice 3D della vascolarizzazione quindi siamo solo in grado di valutare alcuni elementi di interazioni leucociti che sono limitati al rivestimento della camera. Inoltre, grande attenzione dovrebbe essere presa per garantire un sistema chiuso per la circolazione del mouse seguendo tutti i passaggi indicati nel protocollo. L'introduzione di bolle d'aria influenzerà notevolmente la precisione e la riproducibilità degli esperimenti.
Mentre si descrive l'uso della camera Autoperfused Microflow per valutare le dinamiche di rotolamento dei leucociti la procedura ha il potenziale per essere personalizzato dagli investigatori di studiare una serie di malattie. Ad esempio, le cellule tumorali metastatizzano esprimendo molte delle integrine comuni condivisi dai leucociti. Studying loro dinamica di laminazione in un ambiente che imita più da vicino un ambiente in vivo potrebbe aiutare nella nostra conoscenza, e forse la previsione, la natura invasiva delle cellule tumorali. Un possibile approccio potrebbe essere quello di combinare una tecnica di etichettatura per le cellule tumorali, come GFP 27, insieme con il test camera di flusso per monitorare le dinamiche di rotolamento delle cellule tumorali esprimenti GFP. Data la flessibilità del rivestimento della camera con una varietà di sostanze e collegando camere multiple allo stesso topo sarà interessante vedere come questa procedura viene modificato per l'utilizzo in altri laboratori in combinazione con topi geneticamente modificati e modelli di malattia. La tecnica che descriviamo qui tocca solo su una potenziale applicazione molto più ampio che è limitato solo dalla creatività del ricercatore.
Acknowledgments
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Eye Institute dei National Institutes of Health di cui ai numeri di aggiudicazione: R01EY022084 / S1 (KMC), T32EY007145 (HS) e P30EY014104. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Ulteriore supporto è stato fornito dal Fondo Massachusetts Lions Eye Research (KMC) e un premio speciale dal Research Scholar per prevenire la cecità (a KMC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro glass chamber 0.4 x 0.04 x 50 mm | VitroCom | 2540-050 | |
| Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 | |
| Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 | |
| Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A | |
| Y tube | Value Plastics | Y210-6 | |
| T tube | value plastics | T410-6 | |
| Silicone gel | Hardware store - Home Depo | ||
| 35 mm Petri dish | Corning | 430165 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 | |
| Fine forceps | FST | 11253-25 | |
| Fine scissors | FST | 15000-08 | |
| Tube holder | FST | 00608-11 | |
| Clamp applicator | FST | 18057-14 | |
| Vascular clamp | FST | 18055-04 | |
| 6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 | |
| 25 x 1 G needles | BD | 305125 | |
| 30 x 1/2 G needles | BD | 305106 | |
| Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |
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