Summary
ここでは、調査員は、マウスの循環系に内皮由来の接着分子でコーティングされたチャンバーを接続することにより、ex vivoでの白血球動員のダイナミクスを評価することを可能にするプロトコルを提示する。それは相対的な生物学的条件下で、白血球の評価を可能にするため、この方法は重要な利点を提供しています。
Abstract
白血球 - 内皮相互作用は、急性および慢性炎症における初期の重要なイベントであると、無調節時、永久的な病理学的な損傷につながる組織損傷を媒介することができる。既存の従来のアッセイは、血液から白血球を抽出した後の白血球接着分子の分析を可能にする。末梢血白血球（PBLの）が今度は研究結果に影響を与えるのPBLを刺激することができる、分析のための準備ができる前に、これにはいくつかの段階を経るために血液を必要とします。 autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイは、しかし、科学者たちは、コーティングされた室を操作の自由度を持ちながら生きたマウスの全身の流れを用いて機能調節異常の早期白血球を研究することができます。疾患モデルを介して、白血球接着分子の機能的発現は、固定化された内皮細胞接着分子をex vivoで被覆したマイクロガラスチャンバーで評価し、定量化することができる。このモデルでは、血液が流れる右総頸動脈、および麻酔下で生きたマウスの左外頸静脈の間に、チャンバー内のネイティブのPBLの相互作用を可能にする。リアルタイム実験的分析は、生体顕微鏡の援助ならびにハーバード装置の加圧装置を用いて達成される。ガラスチャンバーの入力点での流量調整の適用は実験間で比較可能な生理学的な流れの状態を可能にする。速度ローリング白血球は主な結果であると米国国立衛生研究所のオープンアクセスソフトウェアImageJのを使用して測定される。要約すると、autoperfusedマイクロ流チャンバーアッセイは、白血球の内皮相互作用を研究するための最適な生理的環境を提供し、炎症を研究する際、研究者が正確な結論を引き出すことを可能にする。
Introduction
炎症は、傷害に対する体の普遍的応答であり、両方の先天性および適応免疫系機能における重要なステップである。損傷および/または炎症性刺激に応答して、内皮細胞は、特定の接着分子をアップレギュレートする。これは主に、ポスト毛細血管細静脈で、微小血管内皮を通じて溢出白血球につながる。このプロセスは、内皮上血流中の自由流動白血球のテザリングで始まる。次に遊出および細胞毒性剤の分泌をもたらす安定したローリング白血球の堅固な接着、これは1,2係留従う。セレクチンカスケード3-5の初期段階を媒介することが知られている。インテグリンは、強固な接着と輪廻1,6-8の後のステップに関与している。
多くの証拠は、虚血再灌流傷害の動物モデルにおいて、白血球および内皮接着分子がある重要な役割を示唆している、喘息、乾癬、多発性硬化症、および加齢性黄斑変性症9-12。これらの条件下では、炎症反応は、健康な組織の破壊をもたらし、自分の身体を攻撃するために誤った方向に向けている。 （例えば、非ステロイド性抗炎症薬、コルチコステロイド、または他の化学療法剤など）は、既存の抗炎症薬は、長期使用13重篤な副作用のリスクを伴う。したがって、非毒性の14を維持しながら、最終的に所望の抗炎症効果を有するように標的化することができる疾患特異的な分子を同定する能力は、適切なツールを持っている非常に興味深い。
そのような静的な白血球接着アッセイとして、インビトロの方法で既存のは、1976年15として使用した。並流チャンバは、第一の流条件下で、白血球-内皮相互作用を研究するために1987年に、インビトロで使用された。これらの実験では、フーマー刺激nの静脈血から、多形核白血球（PMNは）一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単層上で灌流した。血行力学的流動条件を制御するために、ハーバード装置シリンジポンプ16を使用した。代替的に、人工的な白血球の分離を回避するために、全血を固定化接着分子17で被覆されたガラスチャンバーと組み合わせて使用した。
白血球刺激を回避し、機構的におおよその生理学的条件下での接着分子との相互作用を研究するために、 エキソビボ autoperfused、体外、動静脈回路16を開発した。この回路では、血液は、単一または共固定化接着分子でコーティングされたガラスマイクロチャンバ内でネイティブのPBLの相互作用を可能にする、麻酔下で生きたマウスの右総頸動脈、左外頸静脈との間を流れる。このsysteに大きな利点mは、炎症経路に直接または間接的に操作された遺伝子改変マウスを用いる能力である。さらに、流動条件下で、外部の活性化の自由炎症への白血球接着分子の単離された寄与を特定する能力がある。フローチャンバーの入力点での流量調整の適用は、動脈または静脈系18〜22のいずれかを模倣する剪断力の実験的変動の広い範囲を提供する。ここでは、ex vivoでの製造及び性能に関するプロトコルはマイクロフローチャンバーアッセイをautoperfused非常に詳細に説明します。
Protocol
動物実験はすべてビジョンの研究のための協会に従って処理し、眼科及び視覚研究における動物の使用のための眼科声明、およびマサチューセッツ州アイと耳診療所動物管理委員会によって定められたガイドラインおよび規制された。
実験前日：
フローチャンバ用チューブの調製
- 頸静脈側を製造するために、5cmのポリエチレン管に続いて6センチメートルシリコンチューブに1cmのPE10ポリエチレンチューブを接続します。頚動脈側については、約1.5cm離れた1cmのポリエチレンチューブは6センチシリコンチューブ内のT字管の添加により頚側と同様に調製した（ 図1A、B）。 T字管を挿入するために、必要に応じて、微細なピンセットを使用してシリコンチューブを広げる。
- 頚動脈sのT側を挿入する、圧力変換器にシリコンチューブの10cmの一端を接続しIDEのT字管の他の端に。接続サイトが締まっていることを確認し、自由に漏れ。必要に応じて、漏れ（ 図1C）を防止するために、チューブが一緒に収まるどこオーバーパラフィルムの小さな長方形の部分を適用します。
2.会議所のコーティング
- 0.1％BSAに内皮表面コートタンパク質（ 例えば、Pセレクチン、細胞間接着分子-1（ICAM-1）、血管細胞接着タンパク質-1（VCAM-1））を準備する。ガイドラインとして、タンパク質1μgの200μlのBSAが4-5室コートするのに十分です。 25 G針に接続された1mlシリンジを用いて、内皮細胞表面コートタンパク質と（0.04 xは0.4×50mm）の各チャンバに注入する。一晩4℃で15 mlのチューブで被覆された室に保管してください。
実験の日：
商工会議所の準備3.
- 4℃からコーティングされたチャンバーを取り外し、各側に頸静脈とチューブを接続します。 connectiをシール慎重にチューブは、チャンバを満たしている場所の上パラフィルムの小さな長方形の部分を延伸することにより、ONS。注射器を使用して、0.1％のBSA（漏れをチェックする）とチャンバとチューブを埋める。 45分間インキュベートする。
- 皿の両側にノッチを切断することにより、チャンバを保持するために35ミリメートルペトリ皿を準備します。ノッチ内のチャンバを安定させる。その後ノッチサイトの皿にチャンバーを固定するために、シリコンの小滴を使用しています。チャンバーは顕微鏡下で見ることによってレベルであることを確認してください。シリコーンは、少なくとも15分間乾燥することができます。
- ヘパリンと60ミリリットルのロック注射器を記入し、圧力変換器に接続します。トランスデューサ、シリコンチューブ、およびT字管：次の順序で頚動脈チューブに圧力トランスデューサを接続します。
- トランスデューサーとの接続を確保するためのT字管に接続されたシリコンチューブの間に1cmのPE50を使用してください。圧力クランプ（ 図1D）を介して頸動脈のシリコンチューブを渡します。ファイル名を指定して実行100USPヘパリンのthro気泡がなくなるまでのチューブとチャンバーぐふ。
4.ソフトウェアのセットアップ
- ソフトウェアを準備するために、コンピュータ、顕微鏡、およびオープンラボデバイスの電源を入れます。ダブルライカアプリケーションスイート（LAS）（または同等品）をクリックし、ビデオを保存するフォルダを準備します。→取得→映画をブラウズ→クリップのシーケンス（クリップ= 15、記録時間= 30秒、との間隔= 15秒）を定義するその後確認のため、「+」記号をクリックします。
- 流れ圧力が上記の、 ステップ4.1で記録フォルダにファイル名をLabChart（または同等の）ファイルを開き、座標記録するには。
5.手術手順
- ケタミンの組み合わせた（60mg / kg）およびキシラジン（6ミリグラム/ kg）を用いて、8-10週齢のマウスを麻酔する腹腔内（IP）注射した。深い鎮静がペダル引っ込め反射の喪失により5〜10分以内に達成されることを確認してください。必要に応じて、イソフルラン必要に応じて、フェイスマスクを介して送達を挙げることができる。
- 麻酔下の間、ケージの下で加温パッドに置き、体温を維持するために37℃に設定。適切な麻酔が確認されると、眼の乾燥を防ぐために、バシトラシン軟膏で腹位置し、コート目にマウスを置く。
- その後、カミソリの刃を使用して切開部位の毛を剃ると徹底的にアルコールでサイトをクリーニングします。
- 一度完全に麻酔をかけたテープが腹の位置でマウスを保持したまま動物を確保する。はさみで首の領域を露光し、気管や血管（ 図2A）を露出するために甲状腺を取り除く。
- それは完全に迷走神経（ 図2B）を損傷しないように注意しながら露出するまで頚動脈を清掃してください。縫合糸の一部を折り、その後頸動脈の下に縫合糸の2個存在することになりますので、曲がりで切断頸動脈の下に曲がりを渡す。ループノットに各縫合糸（締めないでくださいノット）。
- 同様（ 図2D）で縫合糸を準備し、左頸静脈（ 図2C）を露出するために同じ手順を繰り返します。
- マウスの血管系にチューブを接続します。
- ヘパリンIP 1mlの注射することによってマウスをHeparinize。
- 頸動脈の上限縫合糸を締めます。それは頸動脈（ 図3A）に行くことができると低く、血管クランプを置きます。 microscissors（ 図3B）を使用して、小切開、動脈の円周の約1/8を上限縫合することにより動脈を保持し、作るために鉗子を使用してください。
- 上部の縫合糸にし、動脈に切開内に第2の結び目を通して頚動脈チューブを渡します。動脈がチューブの周りでシールされるように、下縫合糸を縛る（; 図3C、いくつかの結び目が密封を確実にするためになされるべきである）。
- （頸静脈チューブを挿入するための容器を同じ手順を繰り返しますクランプは、頸静脈側には必要ありません; 図3D）。
- 血管クランプを解放することによって、フローをテストします。漏れがない場合は、顕微鏡にマウスを移動し、（手術手技のデモンストレーションのために添付のビデオを参照）、チャンバチューブに頸動脈管と頸静脈に接続します。
6.録音ローリング速度
- マウスの循環系を有する回路を作る、室を埋めるために頸動脈クランプを開きます。流れの状態が安定するように、血液が3-5分間循環させています。チャンバは、顕微鏡対物レンズとの一端から他端までのレベルがあり、その縁部がスクリーン上で録画窓と平行になるように3〜5分間の待機期間中は、顕微鏡のステージを調整する。
- チャンバを通って流れる細胞が見えるように皿に10×水浸対物レンズを下げ、次に水でガラス容器を含む改変ペトリ皿を埋める。光強度は、細胞の適切な表示のために調整されなければならない。一般的に低い強度が優れています。
- トランスデューサはメディア生理的な流れ圧力に相関する、安定した30ミリメートルHgのを読み取るように、または必要に応じて、チューブのクランプを調整します。
- ビデオと頸静最後に近く、完成するまで、頸動脈端に向かって流れに逆らって移動する第1の時間経過に伴う圧力の両方の記録を開始するために押して「スタート」。
注：異なる接着分子を用いていくつかのコーティング条件は、複数のチャンバを用いて同じマウスで研究することができる。唯一つのチャンバは、一度記録されている。- 記録が終了すると、血液の流れを停止、入力部位で弁を閉じる。チャンバーを取り外し、他の手で片手に細かい鉗子と溝付き鉗子を用いた回路に（別の接着分子でコーティングされた）新しいチャンバーにフィット。 手順で説明したように新しい室の記録を再開6.1から6.4。
- 実験の終了時に脊髄脱臼に続いてCO 2窒息によりすべてのマウスを安楽死させる。手順は、したがって、マウスは、実験の終了時に、脊髄脱臼により安楽死させ、端末である。
7.結果の解釈
- 分析するに記録されたデータはImageJソフトウェア23は「M TrackJ」プラグインを使用する。
- [ファイル]→[インポート]→[AVI→グレースケールに変換することでグレースケールにファイルを変換します。
- →グローバル→フレーム間隔（i）を入力するプロパティ→選択→イメージでフレームを標準化。 （画像Jビデオウィンドウの上隅に表示）1ビデオのフレーム数によって合計ビデオ再生時間（通常は30秒）を分周してフレーム間隔を計算します。
- セレクトプラグインによって各白血球の流れを測定→M TrackJは→トラックを追加→白血球を選択20秒→マージ - →15各フレームでそれを追跡します。
- ビュー内のすべての白血球を繰り返し手順7.4。
- 2列がコピー→M TrakJのすべてが表示され選択→措置により、白血球の平均転がり速度を決定します。スプレッドシートに追跡します。 "Vを意味する」と記された列は、ピクセル/秒で測定された白血球のローリングです。 2/3で割ることにより、ミクロン/秒に変換します。
- 各実験群間の比較のためにΔP（mmHgで）とT（ダイン/ cm 2）：スプレッドシートに圧力データのハイライトと輸出を分析し、次の計算を実行するには。計算された後は、グラフ作成のためのプリズムソフトウェアにデータをコピーします。
Representative Results
各記録のみ相互作用、白血球中にチャンバに明らかである。代表的な実験からの結果を図4に見ることができる。白い矢印は、興味のある接着分子によって捕捉され、血流内の他の自由に流動するものの間で、チャンバに沿って展開している個々の白血球を指す。チャンバの外側の一般的なアーチファクトは、すべての画像が大きく暗い球を見ることができる。暗い球は、読者が固定点に関連して白血球の動きに感謝助ける。 22秒の期間にわたって白血球の進歩は、球に関連して見ることができる。同図のグラフは、Tx1には、ローリング速度（左へのシフト）を減少させ、Tx2には、対照と比較して速度（右へのシフト）を増加させるデータの最終プロットを示している。
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図1：フローチャンバ用チューブの準備。チューブとチャンバーアセンブリに必要な（A）ツール（マイクロガラスチャンバー0.4×0.04×50mmのポリエチレンチューブPE10ポリエチレンチューブPE60、シリコーンチューブ002、Yチューブ、Tチューブ35mmのペトリ皿、微細鉗子、微細はさみ、チューブホルダ、血管クランプ、7-0絹縫合糸。コーティングされたチャンバを通ってマウスの血液の流れを再指向するための頸動脈と頸静脈管の（B）の調製。（C）圧力変換器に頸動脈の管を接続する。 （D）の血流量を調整するためのクランプを通してトランスデューサからチューブを通します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：Tへのチューブの接続彼は動脈と頚静脈頸動脈。 （A）は、頸動脈に上限結び目を締め、下結び目下のクランプを配置します。（B）microscissorsを使用して、頸動脈に小さな切開を行い、約1/8周長（点線の黄色い円が切開を示す）。（ C）頸動脈にチューブを挿入し、少なくとも2本の縫合糸（緑の点線は、チューブと黄色の点線頸動脈を示している）で固定します。（D）同様に（緑の点線がチューブを示しており、頸静脈内チューブを挿入する黄色の点線頸静脈）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：フロー· チャムを通じてローリング白血球の代表的な時間経過BER（スケールバー= 100μm）の（白矢じりはローリング白血球を指摘するが）。グラフはグラフのプログラムにエクスポートした後の代表的な結果を示している（Tx1が及びTx2には、実験的治療群であり、CTRは、対照群である）。 TX1はTx2には速度をローリングする白血球の増加を反映し、右シフトにつながる一方で、未処理群（CTR）に比べて速度とグラフの左シフトをローリングする白血球の減少につながる遅く白血球せる処理を表します。 クリックしてくださいここで、この図の拡大版を表示します。
Discussion
白血球動員のプロセスは、炎症反応において重要なステップです。それは彼らのエフェクター機能を発揮することができる標的組織に向かって循環系からの白血球の移動を伴う。白血球の動員は、アテローム性動脈硬化プラーク、心筋梗塞、虚血/再灌流、および移植手術1と同様に、複数のCNS 関連の神経炎症状態10-12,20,24,25などの炎症の様々な条件に不可欠である。白血球動員スパンその疾患状態の多様性を考慮すると、autoperfusedマイクロフローチャンバーは、調査員の白血球遊走のダイナミクスを研究する能力を可能不可欠なツールを提供しています。
過去数十年にわたって、種々 のインビトロアッセイは、白血球細胞接着26のダイナミクスを研究するために開発されてきた。残念ながら、これらのアッセイの全ては、抽出を必要とする血液からの白血球は、機械的活性化を導入する。 インビボ環境に近づけるために、適合は、全血サンプルを収集し、血行力学的流動条件16,17を制御するために行われた。ここでは、マウスの循環系にコーティングされたチャンバを連結することによって、フィールドの前の進歩を拡張する。我々は、生理的範囲への血液の流れを調節し、白血球ローリングのダイナミクスを研究することができる。コーティングされたチャンバーは、私たちに特異的接着分子と白血球の相互作用を研究する機能を提供します。システムは、ライブマウスによって操作部として機能しているので、より密接に、私たちは、免疫学的マウスモデルの様々な白血球 - 内皮相互作用を研究することができ、自然環境を模倣する。さらに、このシステムは、私たちが利用可能な複数の遺伝的マウスモデルを利用することができます。システムが完全に生体内環境を複製しませんが、納入仕様を研究するためのプラットフォームを提供します生理学的条件下で、白血球のc要素、以前には不可能であった偉業。これは歩近づく、より生理的な環境への私たちを取るにもかかわらず、システムには限界がある。我々は唯一の室内コーティングに制限されている白血球の相互作用の特定の要素を評価することができますので、それは完全に血管系の複雑な3Dマトリックスを複製しません。また、細心の注意は、プロトコルに記載されているすべての手順を実行して、マウスの循環にクローズドシステムを確実にするために注意する必要があります。気泡の導入は非常に実験の正確さと再現性に影響を与える。
我々は、白血球ローリング動態を評価するためAutoperfusedマイクロフローチャンバーの使用を記載している間の手順は、様々な疾患を研究する研究者によって個人化される可能性を有している。例えば、癌細胞は、白血球で共有される共通のインテグリンを多く発現することによって転移する。 Studyinグラムより密接に我々の知識に役立つ可能性インビボ環境を模倣する設定、及びある種の癌細胞の侵襲性の可能性の予測、それらの圧延ダイナミクス。 1つの可能なアプローチは、GFPを発現する癌細胞のローリングダイナミクスを追跡するために、フローチャンバーアッセイと一緒に、そのようなGFP 27として、がん細胞の標識技術を組み合わせることができる。種々の物質でチャンバーをコーティングし、同じマウスに複数のチャンバを接続する柔軟性を考えると、この手順は、遺伝的に改変マウスと疾患モデルとの組み合わせで、他の研究室での使用のために改変されているかを見るのは興味深いだろう。私たちはここで説明する手法は、まさに唯一、研究者の創造性によって制限されてはるかに広いアプリケーションの可能性に触れています。
Acknowledgments
R01EY022084 / S1（KMC）、T32EY007145（HS）とP30EY014104：この出版物で報告された研究は、受賞番号の下に国立衛生研究所の国立眼研究所によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。追加のサポートは、マサチューセッツ州ライオンズ·アイリサーチ基金（KMC）と（KMC）は失明防止の研究から特別奨学生賞によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro glass chamber 0.4 x 0.04 x 50 mm | VitroCom | 2540-050 | |
| Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 | |
| Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 | |
| Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A | |
| Y tube | Value Plastics | Y210-6 | |
| T tube | value plastics | T410-6 | |
| Silicone gel | Hardware store - Home Depo | ||
| 35 mm Petri dish | Corning | 430165 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 | |
| Fine forceps | FST | 11253-25 | |
| Fine scissors | FST | 15000-08 | |
| Tube holder | FST | 00608-11 | |
| Clamp applicator | FST | 18057-14 | |
| Vascular clamp | FST | 18055-04 | |
| 6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 | |
| 25 x 1 G needles | BD | 305125 | |
| 30 x 1/2 G needles | BD | 305106 | |
| Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |
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