Abstract
Här presenterar vi en rad tuffa tester väl standardiserade forskningsprotokoll anpassade för användning i avlägsna marina miljöer. Protokollen provtagnings inkluderar bedömning av resurserna till den mikrobiella (löst organiskt kol, partikel organiskt material, oorganiska näringsämnen), och en omfattande beskrivning av de virala och bakteriella samhällen (via direkta virala och mikrobiella räknas, uppräkning av autofluorescerande mikrober, och konstruktion av virala och mikrobiella metagenomes). Vi använder en kombination av metoder, som utgör ett spritt fält av vetenskapliga discipliner som innefattar redan etablerade protokoll och några av de senaste tekniker som utvecklats. Speciellt metagenomic sekvenseringstekniker som används för virus- och bakteriesamhället karakterisering, har fastställts först på senare år, och som således fortsättningsvis utsätts för ständig förbättring. Detta har lett till en mängd olika provtagnings- och provhantering currently används. Uppsättningen metoder som presenteras här erbjuder en aktuell metod för att samla in och bearbeta miljöprover. Parametrar som behandlas med dessa protokoll ger ett minimum av information nödvändig för att karakterisera och förstå de bakomliggande mekanismerna för virala och mikrobiella samhällsdynamik. Det ger lätt att följa riktlinjer för att genomföra omfattande undersökningar och diskuterar kritiska steg och potentiella förbehåll relevanta för varje teknik.
Introduction
Marina ekosystem utsätts för ett brett spektrum av störningar som medför förändringar från näringstillgång till biomassan av toppredatorer. Under det senaste decenniet har flera studier visat på vikten av de mikrobiella samhällen i marina ekosystem 1-4. Det är uppenbart att förändringar i bakterie- och virus gemenskap är nära förknippade med den totala nedbrytningen av marina miljöer 5. Dessa förändringar kan underlättas genom förändrad geokemi i vattenmassan, såsom syretillgång eller kol remineralization 6,7. Som en följd av det ömsesidiga beroendet mellan makroorganismer, vattenkemi och mikrobiell aktivitet återkopplingar kan accelerera takten i ekosystemet nedbrytnings 8.
På 1970- och 80-talet flera försök gjordes att nysta biogeokemiska kretslopp i marina ekosystem 9-11. En av de största utmaningarna för dessa tidiga studier var bristenav standardiserade metoder för att mäta de bedömda biogeokemiska parametrar. Även om det fanns protokoll som finns, främst på havsvatten näringsämnen 12,13, var bedömningen av koldynamik och mikrobiella samhällsstrukturen begränsas av de verktyg och metoder som finns tillgängliga. Med JGOFS EqPac metoder jämförelse, et al. Sharp 14 föreslås för första gången en pålitlig och standardiserat protokoll för bedömningar löst organiskt kol (DOC) koncentration. I början av 2000-talet de analytiska utmaningar att bestämma tillgängliga resurser för mikrobiella hade således till stor del lösts och tillvägagångssätt för att karakterisera mikrobiella samhällen i kontrollerade kulturmiljöer hade fastställts (se DeLong 15). De traditionella sekvenseringsmetoder på den tiden förlitat sig på odlade klonala kulturer. Tidig miljö gen sekvensering av naturliga prover visade dock att majoriteten av mikrobiell biodiversitet hade missats av Kulturation baserade metoder 16. År 2002 Breitbart et al. 17 shotgun-sekvensering för första gången för att beskriva den virala samhället i miljö havsvatten prover fastställer en metod för att sekvensera hela genom icke odlade marina virala samhällen.
Inom de befintliga bedömningar mikrobiella, virus fortfarande särskilt under studerade, eftersom de flesta är svåra att odla och de saknar ett universellt bevarad markör såsom 16S ribosom RNA (rRNA) gener som vanligtvis används för att bedöma mångfald och gemenskap profilering. Den metagenomic sekvense metod ger ett alternativ till kulturberoende och gen inriktade metoder för att analysera komplexa virus samhällen. Medan de första virala metagenomes genereras från havsvatten sekvenserades med hjälp av Sanger-sekvense 17, har utvecklingen av nästa generations teknik för sekvense och förbättrade molekylära tekniker har lett till en snabb ökning av metagenomic studier 18 19-21.
För att främja befintlig kunskap om virus, mikrober och biokemisk funktion i akvatiska ekosystem, att jämföra datamängder i olika system runt om i världen är viktigt. Däremot har de etablerade protokoll till stor del utvecklats för strandnära miljöer med lätt åtkomliga laboratorier. Således, bristen på standardiserade fältmetoder hindrar dessa tvärekosystem jämförelser. Här presenterar vi grundligt testade och väl standardiserade anpassningar från toppmoderna forskningsprotokoll för användning i avlägsna fältplatser. Dessa metoder har visat sig vara framgångsrika i flera studier som spänner över det senaste decenniet 5,22 och används idag av olika marina laboratorier samt på NOAAReef Bedömning och Monitoring Program (RAMP) i hela Stilla havet 4. Protokollen provtagnings inkluderar vattenkemiparametrar (oorganiska och organiska kol koncentrationer, oorganiska näringsämnen koncentration), virus och mikrobiell överflöd (direkt bakterietal, direkta virala räknas, och flödescytometri bedöma autotroph vs heterotroph förhållanden), och viral och mikrobiell samhällsstruktur och metabolisk potential genom metagenomic analys (för en översikt se figur 1). Resultaten från de metoder som beskrivs här krävs för att belysa viktiga biogeokemiska bakgrundsparametrar som krävs för att på ett heltäckande karaktärisera akvatiska ekosystem.
Protocol
1. Beredning av Instrument
- Beredning av Filtrering Setup
- Bered en 5% saltsyra (HCI) lösning (0,5-0,6 M, tillsätt 250 ml 32-36% HCl till 4,75 L destillerat vatten till 5 liter färdig lösning). Förvara lösningen i en hög-densitetspolyetenbehållare (HDPE) i upp till 2 veckor.
- Låt alla delar som kommer i kontakt med provet (utom filter) för 24 timmar i 5% HCl-lösning för att blodigel ut eventuella löst organiskt kol (DOC) föroreningar. Efter varje provtillfälle skölja alla delar och skölj rader med ca 30 ml 5% HCl-lösning för att förhindra kontaminering av koldioxid (t.ex. från rökgaser, olja, båtar, mygga spray).
- Håll alla provtagnings poster insvept i förväg förbränns aluminiumfolie eller täckta tills omedelbart före användning.
- Precombust 25 mm GF / F-filter inlindade i aluminiumfolie i en muffelugn vid 550 ° C i 12 timmar för att avdunsta bort allt kol och förvara dem på en ren, torrplacera fram till användning. Använd syratvättade pincett och sterila, icke-pudrade handskar för att hantera de precombusted filter vid alla tidpunkter.
- Beredning av Viral Metagenome Provtagningsmaterial
- Tvätta fyra 20 L hopfällbara lågdensitetspolyeten dunkar och fyra 20 L högdensitetspolyeten hinkar och lock med 10% blekmedel.
- Därefter skölj alla artiklar 3x med destillerat och sedan prov vatten och förslut dunkar med tapp.
- Tvätta tangentiellt flöde Filter (TFF) efter varje användning enligt följande protokoll, och rent förebyggande syfte om filtret inte har använts under de senaste fem dagarna.
- Lös upp 50 g av NaOH-pelletar i 5 liter vatten i en tvätthink.
- Fäst en våt TFF till slangen och montera enligt figur 3.
- Kör peristaltisk pump vid ~ 30 rpm utan någon mottryck för att flytta en del av NaOH-tvättlösning genom systemet. När tvätt strömmar från returledningen, flytta överföring att tvätta hinkatt fullborda cirkulationen av lösningen.
- Applicera mottryck till systemet genom att placera en klämma på returledningen nedströms om TFF. Detta kommer att tvinga tvättlösningen ut filtratet linje. Överdriven tid (5 min) för att översvämma utsidan av TFF och producera filtratet är indikativ för en degraderad TFF.
- Kör systemet tills all NaOH-lösning är i ledningarna. Ta sedan bort mottryck, kör lösning ur systemet och kasta.
- Skölj TFF genom att köra vatten under mottryck tills pH i vattnet flödar från retur och filtratet ledningar är pH 7-8.
- Ta slangen från den peristaltiska pumpen och TFF. Återförslut TFF för lagring. Se till att TFF fortfarande blöt tills nästa användning.
2. Provtagning
OBS: Under transport alla insamlade prover bör förvaras svalt (om möjligt 4 ° C) och inte utsätts för direkt solljus tills vidare bearbetning.
- Provtagningför Carbon, Näringsämnen, mikroskopi, flödescytometri, och mikrobiell metagenomiken
- Ta två Hatay Niskin enheter per provtillfälle (vilket resulterade i 4 L vattenprov). Öppna provtagningskärlen strax innan submerging (annars instängd luft kommer att förhindra fallande).
- På den berörda platsen, spola insidan av provtagningskärlet med provet vatten genom att öppna båda ändarna och flytta cylindern längs polaxeln genom vattnet.
- Ta provet och stänga provtagningsbehållaren försiktigt. Se till att provtagningsplatsen är uppströms från båt och dykare för att undvika kontaminering.
- Provtagning för virus metagenomiken
- På målplatsen montera länspump på 20 L glasbehållare.
- Fyll carboy syftar länspump inlopp vid varje målområdet och tätningsdamejeanne med motsvarande tapp.
- Samla 4 dunkar av ofiltrerat havsvatten (tillsammans 80 L) från varje provtagningsställe.
3. Provle beredning
OBS: Behandla proverna i den ordning som presenteras här, börjar med DOC för att minimera risken för kontaminering. Använd puderfria handskar för hela förfarandet.
- Löst organiskt kol (DOC)
- Montering en av de två alikvota Hatay Niskin enheter i respektive slits av filtreringsuppsättningen. Anslut utloppsslangen som leder till respektive filterhållaren. Anslut trycksatt luft (0,2 bar) slangen till Hatay Niskin anläggningen (se figur 2).
- Spola alla linjer med 100 ml vattenprov innan du sätter filter i filterhållaren. Placera 25 mm pre-förbrända GF / F-filter i filterhållaren med hjälp av syratvättade pincett. Skölj varje DOC flaskan och locket 3 gånger med ca 20 ml filtrerade vattenprovtagning.
- Fyll flaskan med ca 40 ml (~ 2/3 fullt) för provtagning vatten. Samla åtminstone kopior av DOC prover för att ha en backup i händelse av eventuella föroreningar eller förlust under transport.
- Freeze provtagningsflaskor står upprätt vid -20 ° C fram till analys.
- Partikel Organiskt material (POM)
- Efter DOC prover har samlats fortsätter filtreringen tills totalt 500 ml har passerat GF / F-filter, inklusive det som passerade genom samtidigt samla DOC prover.
- Skruva loss inline filterhållaren.
- Ta bort filtret för POM analys med hjälp av pincett och sätt filtret i en kvadrat av pre-förbrända aluminiumfolie, vik övre sida vänd in i sig själv, och linda.
- Frysa filtren vid -20 ° C för förvaring tills kastades elementar och isotopanalys.
- Oorganiska Näringsämnen
- Placera en 0,2 um Track-Etsad filter till varje filterhållaren. Sätt tillbaka filterkassetter.
- Skölj varje 20 ml plastflaska scintillation tre gånger med vattenprovtagning. Fyll varje flaska för att ansatsen (~ 18 ml).
- Frys vid -20 ° C fram till senare analys.
- Microscopy (SYBR Guld och DAPI)
- Ta av filterhållaren.
- Samla 1 ml vatten i vardera av två mikrocentrifugrör.
- Lägg 66 l 32% paraformaldehyd till en av portioner (för senare SYBR Guld färgning). Lägg 12 l 25% glutaraldehyd till motsvarande andra (för senare DAPI färgning).
- Blanda försiktigt och låta prover för att "fixa" i minst 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Flödescytometri
- Placera ett 8,0 um polykarbonatfilter i en av filterhållarna för att utesluta skräp och stora eukaryota celler.
- Passera vattenprovtagning genom att fylla 2 cryovials från varje provtagningsplats med 1 ml prov.
- Tillsätt 5 pl av 25% glutaraldehyd till varje cryovial (slutlig koncentration = 0,125%).
- Vänd flaskorna att blanda.
- Låt provet fastställa till 15-30 min vid RT. Överskrid inte 30 min.
- Flash frysa proverna i flytande kväve.
- Förvara proverna vid -80 ° C eller i LIQUId kväve torr avlastaren tills analys på en flödescytometer.
- Mikrobiell metagenomic Prov
- Ta in line filterhållare.
- Direkt montera en 0,22 um cylindriskt filter på respektive linje.
- Filter återstående vattenprov av både Hatay Niskin enheter från varje plats (totalt 3-4 L per filter) genom ett filter.
- Efter filtreringen pressa det återstående vattnet ur varje filter genom att använda en ren 10 ml spruta fylld med luft.
- Placera filtret tillbaka i originalförpackningen och försegla paket med lab tejp.
- Förvara individuellt förpackade filter vid -20 ° C.
- Viral metagenomic Prov
- Överför virala metagenome prover omedelbart in i de tvättade hinkar för att säkerställa att inget prov försvinner eller förorenas av omgivningen.
- Pre-filter med stor porstorlek nylonnät (25-100 mikrometer) för att avlägsna skräp och cellmaterial före koncentrationen 19.
- Ställ upp TFF såsom visas i fig 3, att placera tillförselledningen i ett prov hink, och lämnar de återvinnings- och filtratet linjer som löper i en vask.
- Slå på peristaltisk pump och spola linjer med 1-2 liter vattenprov.
- Placera returledningen i prov skopan för att slutföra cykel, tillsätt 0,7 bar i mottryck.
- Samtidigt koncentrera havsvattnet, fyll provbehållare som nivån sjunker. När vattennivån sjunker under sugledningen i hinken, överföring koncentrat till ett blekmedel-tvättad, trippel sköljas tripour bägare och fortsätta koncentrera.
- Om behållaren bägare är tom, ta bort mottryck, ökar pumphastigheten och tryck hela provet genom ledningarna, återvinna den i tripour.
- Passera koncentratet genom 0,45 um cylindriska filter för att ta bort de flesta bakterier utan att diskriminera någon virus linjerna.
- Ändra 0.45 um cylindriska filter efter var 150 ml. Samla upp 0,45 um-filtrerat virala koncentratet i 50 ml rör.
- Lägg 250 pl kloroform till varje 50 ml alikvot av filtrerad viral koncentrat för att eliminera kvarvarande bakterier. Invertera att blanda, och lagra, upprätt vid 4 ° C fram till efterföljande bearbetning.
- Torka 0.45 um filter och lagra dem som beskrivs i steg 3.6.5 och 3.6.6.
4. Behandling av mikroskopi Prover
OBS: Skölj filter torn med 10% blekmedel, följt av 95% etanol för att förhindra eventuella fläckar eller biologiska rester mellan körningar. Process mikroskop prover inom 1 timme och undvika att utsätta fläckar och färgade filter för ljus om möjligt.
- Mount
- Addera 100 pl av 10% askorbinsyra till 4,9 ml av 1 x PBS, och blanda omsorgsfullt.
- Tillsätt 5 ml av 100% glycerol, och blanda väl.
- Filterfästet med hjälp av en 0,02 um aluminiumoxidmatris engångsspruta filter, delprov och förvara vid -20 ° C.
- SYBRGuld Färgning
- Pipettera en 500 | il alikvot av varje prov fixerades med 2% slutkoncentration paraformaldehyd i ett mikrocentrifugrör.
- Lägg 0,5 pl 1,000x SYBR Gold-lösning till varje portioner.
- Blanda provet försiktigt och lägg den i mörker under 10 minuter.
- Placera en 0,02 um aluminiummatrisfilter med ringformad polypropylen stödring på varje filterstativ av vakuumpumpen och fäst filtertorn (Figur 4). Se till 0,02 pm filter placeras på filter stand plastsidan upp, eftersom dessa filter har en dubbel porositet.
- Med vakuumpumpen avstängd, tillsätt 500 ìl av SYBR färgade prov, tillsammans med 2 ml av 0,02 um filtrerat virus fritt vatten för att säkerställa att provet fördelas jämnt över filtret.
- Slå på vakuumpumpen för att skapa ett undertryck på högst 1 bar för att undvika skadliga virus och mikrober som filtreras.
- Låt hela provet att gåigenom.
- Använd pincett (inte samma par som används för DOC), försiktigt bort varje filter efter filtrering tornet, och passera över en grannlaga uppgift att torka för att säkerställa att filtret är torrt.
- Pipettera 10 pl mount på ett objektglas och placera det torra filtret med färgade provet på droppe mount.
- Addera 10 pl mount till toppen av varje filter före tillsats av ett täckglas.
- Tryck försiktigt täckglas ner. Försök att eliminera luftbubblor om så är möjligt och för att undvika sidorörelse av täckglas.
- Placera bilden i ett slidebox och förvara vid -20 ° C.
- DAPI Färgning
- Placera en 0,2 um aluminiummatrisfilter med ringformad polypropylen stödring på varje filterstativet och montera filtertorn.
- Med vakuumpumpen avstängd, tillsätt 2 ml av 0,02 um filtrerat virus fritt vatten till varje torn som används.
- Pipettera 1 ml av glutaraldehyd-fixerade provet i varje torn, vilket resulterar i en total volym of 3 ml i varje filtertornet.
- Slå på vakuumpumpen för att skapa ett negativt tryck av inte mer än 1 bar.
- Filter hela provet på 0,2 pm aluminiumoxidmatris filter.
- Ta försiktigt bort filtret från filtertornet med hjälp av pincett (inte samma par som används för DOC).
- Placera filtret på en 100 l droppe DAPI-lösning [25 ng / ml] i en petriskål hålla filtret rätt sida upp och låt prov fläcken i 15 min. Undvik ljus under färgningsprocessen.
- Efter 15 minuter, ta bort filtret från fläcken, passerar den över en grannlaga uppgift torka torka och överför till en 100 pl droppe av 0,02 um filtrerat virusfritt vatten, återigen hålla filtret rätt sida upp, för att tvätta bort resterande DAPI fläcken för 1 min. Upprepa denna tvätt en gång.
- Montera filter på mikroskop skjut samma sätt som beskrivits för SYBR Gold proven.
5. DNA-extraktion
- Mikrobiell metagenomic DNA
- Tina de cylindriska filter under minst 20 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort eventuell kvarvarande havsvatten i filtret med hjälp av en 10 ml spruta. Förslut den nedre änden av det cylindriska filtret med användning av ett blekt och autoklaveras locket.
- För varje filter, blanda 360 ^ il T1 "pre-lys" buffert och 50 | il proteinas K och sedan pipettera blandningen i filtret. Förslut den öppna änden.
- Inkubera lyse reaktionen i en roterande ugn O / N (eller åtminstone 2 h) vid 55 ° C.
- Ta bort en av locket och tillsätt 200 l B3 "lys" buffert i filtret till pre-lyse prov. Re-cap-filter och inkubera blandningen i en roterande ugn under 10-20 min vid 70 ° C.
- Utdrag hela volymen från den cylindriska filtret med hjälp av en 3 ml spruta genom att suga ut vätskan med filtret upp och ned.
- Utvisa den lyserade provet i ett nytt mikrofugrör och tillsätt 200 | il 100% etanol.
- Blanda väl, ladda hela provet på spinnkolonn, och fortsätt enligt tillverkarens anvisningar protokoll.
- Kvantifiera DNA med en fluorescerande baserad analys.
- Marine Viral metagenomiken
- Rening och koncentrera fagpartiklar (modifierad från Thurber et al. 19)
- Lös CsCl i havsvatten för att framställa lösningar av 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (kalibrerat genom att väga upp 1 ml lösning). Filtrera varje fraktion med 0,02 ^ m filter före användning.
OBS: Se till att densiteten för varje fraktion med en noggrannhet på tre signifikanta siffror innan lösningarna och filtrera alla lösningar med en 0,02 pm filter före användning. Använd havsvatten eller havsvatten mättad med CsCl att sänka eller öka tätheten, respektive. - Gör ett objektglas från 1 ml kombinerade reagenser som beskrivs i avsnitt 4.2 för att säkerställa att alla reagenser saknar virus innan du fortsätter.
- Lägg 9 g CsCl till 45 ml av viral TFF koncentrat tillen slutlig densitet av 1,12 g / ml. Kylskåp medan inrättandet av CsCl steggradient.
- Från och med 1,7 g / ml lösning successivt tillsätt 1 ml av varje sekventiellt mindre tät fraktion långsamt in i varje rör med hjälp av serologiska pipetter. Markera nivån för varje enskilt menisken och se till att pycnoclines mellan fraktionerna inte störs. För mer information se följeslagare papper (al. Lim et 2014).
- Med en serologisk pipett belastning 7,5 ml av provet i vardera av sex rör och centrifugera vid ~ 83.000 xg, 4 ° C under 2 h.
- Utan att störa densitetsgradienter lasta rotorn och borra röret strax under tidigare märkt 1,5 g / ml densitet lager (Figur 5) med en 18 G nål på en 3 ml spruta. Sug upp 1,5 ml av renade VLP och överför till en ny mikrocentrifugrör. Upprepa för samtliga prover.
- Lägg 0,2 volym kloroform till de renade VLP, blanda kraftigt, inkubera vid RT i 10 min.
- Lägg 150 &# 181; l 10x DNAse buffert i varje mikrocentrifugrör.
- Snurra vid 16.000 xg under 5 min och samla in den vattenhaltiga fasen. Om kloroform samlar inte i botten av mikrocentrifugrör, tillsätt mer DNAse buffert, blanda och repetera.
- Lägg DNas I (slutlig koncentration = 2,5 enheter / | il) och inkubera vid 37 ° C under 2 h, därefter inaktivera DNas-aktivitet genom att inkubera vid 65 ° C under 15 min.
- Lös CsCl i havsvatten för att framställa lösningar av 1,7 g / ml, 1,5 g / ml, 1,35 g / ml, 1,2 g / ml (kalibrerat genom att väga upp 1 ml lösning). Filtrera varje fraktion med 0,02 ^ m filter före användning.
- DNA-extraktion från Virala liknande partiklar (VLP: er)
- Jämnt slå de renade VLP från varje prov i två rengjorts och autoklave Oak Ridge-rör.
- Lägg 0,1 volym 2 M Tris-HCl (pH 8,5) med 0,2 M EDTA, 0,01 volym 0,5 M EDTA, 1 volym av formamid, 10 | il glykogen (10 mg / ml). Blanda väl och inkubera vid RT i 30 min.
- Med hänvisning till ny volym, tillsätt 2 volymer RT 100% etanol. Blanda och inkubera vid 4 ° C i mer än 30 min.
- Pellets DNA genom att snurra på Oak Ridge rören vid 17.200 xg under 60 minuter, vid 4 & #176; C.
- Avlägsna supernatanten. Tvätta DNA-pelleten två gånger med iskall 70% etanol med användning av serologiska pipetter.
- Ta bort all etanol (re-spinning kort om det behövs), omslag, och låt pelleten lufttorka vid rumstemperatur i> 15 min.
- Resuspendera DNA-pelleten i> 15 min i 567 | il av 1 x TE-buffert (pH 8,0). Överför 567 | il suspenderade DNA i en ny 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Addera 30 pl av 10% SDS (pre-varm vid 65 ° C före användning) och 3 pl av proteinas K (20 pg / ml), blanda väl och inkubera under 1 h vid 56 ° C.
- Addera 100 pl av 5 M NaCl och blanda omsorgsfullt. Addera 80 pl av förvärmda CTAB NaCl-lösning, virvel, och inkubera under 10 min vid 65 ° C.
- Lägg 0,2 delar av volym kloroform, virvel, och centrifugering vid 16.000 xg under 2 min. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg lika stor volym av fenol-kloroform isoamyl-25: 24: 1 lösning, virvel för att blanda,och snurra vid 16.000 xg under 2 min. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg lika stor volym kloroform, virvel, och centrifugering vid 16.000 xg under 2 min. Överför supernatanten till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg 0,7 volym isopropanol till supernatanten fraktionen och inkubera vid -20 ° C under minst 30 min för att fälla ut DNA.
- Pelletera DNA: t genom centrifugering vid 16.000 xg under 20 minuter vid 4 ° C. Pipettera av supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 500 | il iskall 70% etanol.
- Snurra vid 16.000 xg och avlägsna kvarvarande etanol ur röret. Lufttorka pelleten för 15 min.
- Resuspendera DNA-pelleten med 50 | il elueringsbuffert (5 mM Tris, pH 7,5) eller Tris-EDTA pH 8,0 under åtminstone 5 min vid RT.
- Kvantifiera DNA med högkänsliga fluorescensbaserad analys.
- Rening och koncentrera fagpartiklar (modifierad från Thurber et al. 19)
Representative Results
Mikroskopi
Mikroskopi prover kan och bör analyseras omedelbart för att säkerställa att de är av önskad kvalitet. För att mäta förekomst och storleksfördelning av den bakteriella samhället, kommer DAPI diabilder granskas av epifluorescensmikroskopi (excitation / emission: 358/461 nm, se et al McDole 2012.) (Figur 6A). Celler och dimensioner kan samlas in med hjälp av bildbehandlingsprogram (t.ex. ImagePro eller ImageJ). Från längd- och breddmått cellvolym (V) härleds genom att göra antagandet att alla celler har formen av cylindrar med halvsfäriska lock med hjälp av följande ekvation:
V = π / 4 × v 2 (L - w / 3)
där L är längden och w är bredden av varje cell 23,4. Mikrobiell biomassa kan då skattas med hjälp av tidigare fastställda storleksberoende relationer for marina mikrobiella samhällen 24. Generellt marina bakterier varierar i längd från 0,1 till 4 pm, men gå upp till ~ 8 um på vissa platser.
Även filtren (0,2 mikrometer) färgade med DAPI visar bara bakterier, de filter som används för SYBR Gold fläcken (0,02 um) innehåller bakterier och virus. Mätning av överflödet av virus följer samma protokoll som för mikrober, men en excitation av 325-375 nm kommer att användas och emissionsmaximum är vid 537 nm (figur 6B).
För att generera kvantitativa data samplingsvolymen kan behöva justeras beroende på den virala överflöd i det ursprungliga provet. Rätt volym för att filtrera bäst empiriskt för en viss vattenförekomst. Exempel på mikrofotografier som innehåller prover med varierande virus koncentrationer illustreras i figur 7.
Resultat från tidigare studier tyder på att virus till Krilonförhållanden (VMR) varierar i allmänhet från 1 till 50 i vattensystem 25-29, och mellan 3 och 20, med ett genomsnitt på cirka 6 i korallrev system (Knowles opublicerade data).
Flödescytometri
Förutom de direkta räknas och storleks uppskattning av den mikrobiella miljön, kan bedömningar av förhållandet mellan autotrofa till heterotrofa mikrober via flödescytometri ytterligare extraheras från de insamlade proverna (exemplar flödescytometri Effekten som anges i figur 8). För att bestämma det totala antalet bakterieceller, är proverna färgades med SYBR Green I och ett fotomultiplikatorrör med en 530/30 bandpassfilter används för detektion. En kanal för klorofyll (tillbaka till rygg LP speglarna resulterar i ett område av 675 till 735 nm) och fykoeryterin (585/42 bandpassfilter) används för att räkna det överflöd av autotrophs i ofärgade prover. För att bestämma det överflöd av heterotrofa mikrober, de autotrofa räknas från den icke-färgade partiet subtraheras sedan från SYBR-färgade totalantal (McDole et al., submitted).
Virala metagenomiken
Viral metagenomiken utnyttjar en kultur oberoende molekylär metod för viral ekologi, med användning av total genomisk sekvensinformation för att bestämma gemenskap struktur och funktion. Metagenomiken har att öka kunskaperna om komplexiteten och mångfalden av virala samhällen på lokal 17 till global nivå 30. Den senaste utvecklingen av ett brett utbud av bioinformatiska verktyg för analys av virala metagenomic uppgifter har minskat beräkningsflaskhalsar, vilket möjliggör en mer heltäckande bild av den virosphere genom linsen av metagenomik.
De metoder som presenteras här belysa isolering och anrikning av virala partiklar från havsvatten med användning av en kombination av pre-filtrering med stor porstorlek nylonnät för att avlägsna skräp och cellulärt material, koncentrationen avprover med TFF (figur 3) och en efterföljande 0,45 fim filtrering för att avlägsna större celler. Denna metod ger ungefär en 100x koncentrerade provet (figur 5B-5E), som gör det möjligt för oss att utföra nedströmsprocesser i mindre volymer. För att förhindra tillväxten av eventuella kvarvarande mikrobiella celler i viruslysat och därmed förändringar i den virala överflöd av provet under den långa tiden för passage mellan fältstation och laboratorium, är kloroform ofta till en slutkoncentration av 2% för lagring. Efter isolering och rening av VLP är epifluorescensmikroskopi med nukleinsyra-färgämnen såsom SYBR Gold används för att verifiera närvaron och renheten av de virala partiklama (fig 5B-5E).
Här presenterar vi två virus metagenomes från Södra Linjen Island korallrev, specifikt, Starbuck (Star7) och Millennium (CAR9, tidigare känd som Caroline) öar. En total volym av 120 L sampel vatten samlades in från varje plats på ett djup av 10 meter och behandlas som beskrivs i avsnitt 3.7 och 5.2. VLP renade från cesiumklorid-gradient centrifugering var 3,3 x 10 8 partiklar / ml för CAR9 (Figur 5D) och 2,9 x 10 9 partiklar per ml för Star7 som kontrolleras i enlighet med den metod som beskrivs i punkt 4 (fig 5B). Den totala mängden av DNA som isolerats från dessa prover var omkring 400 ng baserad på Nanodrop mätningen. DNA förstärktes med hjälp Phi29 polymeras och sekvens av Environmental Genomics Core Facility 2011. Egenskaperna hos sekvensdata presenteras i tabell 1. Utifrån likhets sökningar med befintliga databaser, majoriteten (> 70%) av sekvenserna ofta hamnade okarakteriserade, dvs, okänt ursprung och funktioner. På liknande sätt är två viromes presenteras här presenterade mer än 97% av okända sekvenser. Som ett resultat av icke-databasberoende analys användes för analys och öppnat en ny gren av forskningen möjlighet på "mörk materia" i virala metagenomik (Seguritan et al. i tryck).
Mikrobiell metagenomiken
Analysen av mikrobiella metagenomes möjliggör karakterisering av mikrobiella närvarande och funktionell beskrivning av dessa samhällen. Exempel inkluderar uppskattningar av förekomsten av patogener och virulens 5,22 eller jämförelser mellan förändringar i macrobial samhällsstruktur eller tillgängliga näringsämnen och förekomst av arter och deras dominerande metaboliska vägar (Figur 9; Kelly et al 2014.).
Vattenkemi
Vattenkemiska parametrar i allmänhet tar omfattande analytisk bearbetning för att generera önskad data; prover för DOC-analys kommer att mätas genom hög temperatur katalytisk oxidation 31,32, partikulärt organiskt material (POM) via isotopförhållande masspektrometri kopplat till en elementaranalysator 33-35, och oorganiska näringsämnen från Flow Injection Analysis 36,12,37. Efter ett framgångsrikt slutförande av alla analyser kommer information som visas i Tabell 1 att finnas som komplement karakterisering av mikrobiella och virala samhällen. Denna information kan kompletteras med stabila isotopkvoter av organiska kol- och kväveprover (se et al. Haas 35) och kvoter mellan autotrophs och heterotrofa (McDole et al. Submitted).
Figur 1. Översikt av metoder som beskrivs i protokollet avsnittet. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Figur 2. Exempel på bearbetning rigg inställningar. Filtrerings inställning införs här (schematisk ritning vänster, själva bilden högra panelen) inte nödvändigtvis krävs för att generera prover men kommer att påskynda processen avsevärt. Inställnings består av en ryggplatta, på vilken Hatay Niskin enheter (1) är monterade. På utloppet nedåt, är Hatay Niskin enheter anslutna med silikonslang till in-line filterhållare (2). Dessa låta vattnet passera genom respektive filter samplas i flaskor i HDPE provtagning (3) monterat rätt under. Filtreringsprocessen accelereras genom trycksatt luft (4), som och regleras av en tryckmätare (5). Ett överflöde bassängen förhindrar att spilla vatten under byte av HDPE flaskor eller POM filtrering. Pleaseklicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Tangentiell flödesfilter lineup (modifierad från et al. Thurber 19). Nylonnät filtrerat prov vatten pumpas från behållaren (1) via en peristaltisk pump (2) till ett tangentiellt flödesfilter (3). Vattenprovet återgår till behållaren (1) längs returledningen (4) i frånvaro av mottryck. När mottryck appliceras genom en slangklämma (5) på returledningen, passerar vattnet genom filtret och kasseras eller lämnas till filtratet behållaren (6). Vattenprovet skall ersättas eftersom det är koncentrerat ut filtratet linje tills alla prov vatten koncentreras i slangledningarna.
Figur 4. Mikroskop slide filtrerings setup.Att fördela DAPI och SYBR guld färgade prover på respektive aluminiummatrisfilter (1), filter måste placeras in mellan filtertornet (2) och stam av filtreringsröret och fixeras med en klämma (4). En tryck reglerat vakuum (5) kommer att påskynda filtreringsprocessen (schematisk ritning topp, själva bilden nedre panelen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Rening och koncentrering av fagpartiklar. Totalt 1 ml av varje cesiumkloriddensitetsgradient skiktas ovanpå varandra före leder det förbehandlade provet (A). Varje skikt bör markeras utanför röret för att underlätta extraktionen efter ultracentrifugering. Röda pilen markerar var röret ska borrat exskriftar VLP fraktionen. (BE) mikrofotografier av virala koncentrat: epifluorescens mikrografer av 0,45 ^ m-filtrerade representativa virala koncentrat av Star7 (B) och CAR9 (D). Stora partiklar inklusive bakterieceller var synlig från 0,45 um-filtraten från båda Star7 (B) och CAR9 (D) proverna, medan endast VLP (vita pilar) kvar efter cesiumklorid-gradient ultracentrifugering; Star 7 (C) och CAR9 (E). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. Exempel på DAPI och SYBR Gold mikroskopanalys. Skärmdump från analysen av (A) DAPI och (B) SYBR Guld färgade slide exempel. (A) Längd och bredd (im) i alla markerade partiklar(= Mikrober) kan bedömas med hjälp av ett bildbehandlingsprogram. Notera aggregationen i centrum av bilden. Dessa kluster kommer att behöva uteslutas från efterföljande analys. (B) Under analys virus och bakterier måste arkiveras av storlekströsklar i VLP och cellulära storleksintervall (VLP rött, cellulär grön). Observera att det finns oftast några svaga VLP Uncategorized av respektive bildprogrammet. Dessa VLP som ser ut som svaga vita prickar måste manuellt räknas och adderas till de automatiserade virus räknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7. Koncentrationer av SYBR Guld färgade prover. Micrographs av en 0,02 aluminiummatrisfilter som innehåller olika antal SYBR färgade virusprov. Panel A visar afIlter som innehåller en lämplig mängd havsvatten filtreras, medan koncentrationerna på filtret som visas i B är för höga och i C för låg för tillförlitlig räknas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8. Resultat av flödescytometrianalys utgången på ett rev-vattenprov. Panel (A) visar molekylärbiologisk kvalitet enbart vatten med gul-grönt fluorescerande mikrosfärer (0.75 pm), som används för att verifiera minimal bakgrund med instrumentets inställningar. Panel (B) visar utsignalen från revet vattenprovet kör med samma inställningar och layout som i A. Notera att pärlorna fortfarande kan ses på samma plats, tillsammans med flera populationer av autotrophs. (C) (B), som används för att back-gate flödescytometern, inriktning SYBR positiva händelser (autotrofa + heterotrofa räknas) och minimera bakgrunden. (D) Representations rev-vattenprov färgas med SYBR Green I. Använda grind etablerad i (C), var den totala mikrob räknas som genereras, och heterotrofa och autotrofa mikrober partitione av klorofyll autofluorescens (se McDole et al. 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9. Exempel på mikrobiella metagenome uppgifter. Mönster mellan de mikrobiella metagenomic sekvensdata och webbplats beroende variabler. Här, den relativa förekomsten av Synechococcus Pelagibacter spp. var inte (vänster paneler). Den metaboliska vägen för konjugativ överföring var positivt korrelerad med nitrathalter, medan den metaboliska vägen för DNA-reparation var konsekvent mellan alla metagenomes (höger paneler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Stjärn 7 | CAR9 | |
| Totalt antal Läser | 939.311 | 591.600 |
| Antal förbehandlas Läser | 579.664 | 360.246 |
| Genomsnittlig Sekvenslängd (bp) | 395 ± 131 | 451 ± 159 |
| Annoterade Sekvenser (%) | 42.218 (7,3%) 9117 (2,5%) | |
| Okänd (%) | 537.446 (92,7%) | 351.129 (97,5%) |
Tabell 1. Data egenskaper två viromes genereras från de södra Line Islands, Starbuck och Millennium. Graden av annotation bygger på BLAT använder MG-RAST server.
Tabell 2. Representativa resultat som visar data från olika platser under en expedition. De här bedömda parametrar inkluderar vattenkemimätningar parade med mikrobiella och virala abundances. Tabellen innehåller ytterligare filnamn som hänvisar till respektive metagenomic data för varje provtagningsplats. Kol och oorganiska näringshalter ges i mikromol / L. Pleaseklicka här för att se en större version av den här tabellen.
Discussion
De metoder som presenteras här kommer att ge ett verktyg för att generera en omfattande bedömning av virala och mikrobiella dynamik i akvatiska ekosystem. De är inriktade på att kvantifiera stående lager av organiska och oorganiska resurser tillgängliga för mikrobiella samhällen och för att karakterisera makeup av virala och mikrobiella närvarande. Bredvid kvantifiera viral överflöd och mikrobiell förekomst och biomassa, avslöjar genomisk sekvensinformation deras samhällsstruktur och funktion. Alla metoder har utvecklats eller modifierats för att möjliggöra tillämpning i avlägsna fältplatser. Men avsaknaden av kontrollerade laboratoriemiljö skapar i sig en viss potential för fel. Här diskuterar vi några varningar i samband med var och en av de parametrar som bedöms. Bredvid risken för förorening vid provhantering vissa av parametrarna även ge möjligheter till fel i analysprocessen.
Löst organiskt kol
Förorening Kol kan förekomma under den urvalsmetod (provtagning nedströms, eller i närheten av en båt eller dykare) under provberedningen (förorening av utrustning eller oavsiktlig hantering), och till och med under lagring av provet (andra prover i frysen som innehåller organiskt lösningsmedel / flyktiga ämnen). För att undvika de olika föroreningskällor beteende så få hanteringssteg som möjligt, eftersom varje prov omlokalisering är ytterligare en källa till förorening. Provet bör inte komma i kontakt med något objekt som inte syratvättade eller förbränns. Slutligen kommer att utse ett förvarings frys enbart för prover som inte innehåller flyktiga organiska ämnen säkerställa integriteten av proverna under längre lagringsperioder. Om proverna inte kan förvaras fryst under en längre tidsperioden försurning av DOC prover med koncentrerad HCI (som beskrivet 38-41) kan vara ett tillämpligt alternativ. För att verifiera mätnoggrannheten DOC konsensusreferensmaterial bör användas regbundet under DOC mätningen körs. Speciellt djupa havet vatten (> 2000 m) referenser är värdefulla vid bedömningen av resultatet för den analytiska maskinen som den är mycket stabil i sin DOC halten 42.
Partikulärt organiskt material
Förutom att undvika organiska föroreningar kol, kräver POM provtagning särskild uppmärksamhet för att säkerställa riktigheten av den filtrerade volymen. Om den riktade volym av 500 ml bör avvika någon potentiell orsak detta måste påpekas att relatera mängden POM fångat på filtret till filtratet som den härleddes.
Oorganiska Näringsämnen
Som med provtagning organiskt kol, måste hänsyn tas till eventuella näringsförorening prov som genereras av olika källor som båtar eller avloppsutsläpp 12. Filter används för provtagning organiskt kol med en nominell porstorlek av 0,8 pm, får inte utesluta all mikrobiell biomassa och shOuld därför ändras till 0.2 um filter för filtreringssteg. Vidare, detektionsgränser utgöra ett problem med närings prover; speciellt i oligotrof ytvatten runt många korallrev platser (t.ex. Cotner et al. 43). Detektionsgränserna är ungefär runt 0,1, 0,2, och 0,1 | amol / l för ammonium, nitrat och nitrit, och orto-fosfat respektive (se 36,12,37)
Mikroskopi
Bredvid variationer i koncentrationen av prov bildanalys från mikroskopi glider vidare ger potential för fel. Till exempel, kan bilderna bli oskarp i vissa delar av synfältet, och i fokus i andra. Som ett högrent aluminiumoxidmatris filtret är en mycket styv filtertypen kan eventuellt skräp under filtret orsaka att hela filtret för att sitta på en vinkel till objektglaset. Som ett resultat, kan bilderna konsekvent bli oskarp i olika delar av synfältet för ett givet filter, reOAVSETT mikroskop uppriktning. Återmontering filter, se till undersidan av filtret är rent, kan lindra detta om det konstateras. Också, i vissa fall kan det finnas två fokalplan där virus och mikrober kan hittas. Detta är resultatet av färgade objekt lossnar från filtret vid montering, och som flyter upp till undersidan av täckremsa som kan göra räknas otillförlitliga. Därför är det alltid rekommenderat att kontrollera kvaliteten på proverna under processen.
Flödescytometri
Såsom med mikroskopi prover, kan det finnas naturligt förekommande skillnader mellan flödescytometri prover som kräver justeringar av den analytiska processen. Till exempel, beroende på känsligheten hos instrumentet, kan svagt fluorescerande Prochlorococcus celler vara under brusnivån och kommer inte kvantifieras. Pärlor fungerar som en intern kontrollprov (t.ex. för att bekräfta att instrumentets response till fluorescerande signaler är konsekvent från dag till dag (och förblir stabil under körningen i sig). Om tillsätts till provet vid kända koncentrationer, kan de också tjäna som en intern kontroll för att kontrollera provvolymen loppet. Det rekommenderas att alltid köra en alikvot av en tidigare fryst "standard" havsvattenprov som tinas och färgas tillsammans med prover av intresse att ge ytterligare en biologisk kontroll för provhantering mellan 96-brunnar körningar. Beroende på platsen, kan havsvattenprover se väldigt olika varandra. Sortering "representativa" populationer och sedan tittar under en epifluorescent mikroskop (EM) kan vara ett bra sätt att snabbt kontrollera växtplankton populationer antingen Synechococcus sp. Eller foto eukaryoter. Prochlorococcus celler är vanligtvis inte syns under EM eftersom de bleknar för fort. Förutom klorofyll a, Synechococcus sp. Även innehålla photopigment phycoeurythrin (PE), som emitterar ljus vid kortare våglängder (540-630 nm) än klorofyll A (660-700 nm). När Synechococcus celler exciteras med blått / grönt ljus (470-490 nm), visas de gyllene om det betraktas i ett emissionsfilter som tar bort alla våglängder av ljus under 510 nm. Som jämförelse kommer den eukaryota fraktionen ser rött, när den exciteras med samma våglängd av ljus.
Virala metagenomiken
Det är viktigt att notera att processen för VLP koncentration och lagring påverkar samhället återvinns. Viral partikelförlust kan förekomma vid varje steg i processen, och därmed kan valet av virala renings- och anrikningsprotokoll slutligen påverkar den observerade taxonomisk sammansättning och mångfald av de resulterande virala metagenomes 44,45,18. Koncentration av prov kan göras med TFF 19 eller kemisk baserade flock 20. Inom den kemiska baserade metoden, posittivt laddade järnjoner binder de naturligt negativt laddade viruspartiklar som bildar stora (> 8 ^ m) järnviral komplex som flockas ur lösningen och kan återvinnas med hjälp av 8 um filter. Därefter järn kelateras av de virala partiklarna och åter-upplöstes med användning av magnesium, askorbinsyra och EDTA, lämnar koncentrerade virala partiklar för nukleinsyra extraktion 20. Efter att ha jämfört dessa två aktuella metoder, drog vi slutsatsen att järnkloridmetoden är mindre tidskrävande än TFF viruskoncentration, men kan ge några varningar. Vi fann att dissociering och upplösning av järn viral kräver ett två-faldigt mer koncentrerade magnesium-askorbinsyra-EDTA-lösning än vad som rapporterats 20 för att upplösning fortgå innan askorbinsyran bryts ned. Bortsett från denna fråga, renar protokollet viruspartiklar genom storleksfraktione ensam, ta bort mikrobiella föroreningar som använder 0,2 pm filtrering. Stora virus inte passera genom filter (t.ex. Yang et al. 46) och kommer således inte att upptäckas i metagenome, medan vissa bakterier göra (McDole, opublicerade data). Detta resulterar i bakterieangrepp samtidigt diskriminera stora virus.
Den specifika frågan är dock också relevant för att avlägsna mikrober i samband med TFF koncentration. Eftersom kloroform behandling har visat att avlägsna kloroform känsliga virus med yttre lipidmembran 47 vissa studier antyder att 0,22 | im filtrering kan användas för att avlägsna huvuddelen av bakterier. Det bör också noteras att den presenterade metoden riktar sig främst bakteriofag, den mest förekommande bärare av genetiskt material i marina miljöer. Eftersom fager allmänhet tänkte inte ofta innehåller lipider 48 de är mer motståndskraftiga mot kloroform behandling. Såvitt vi känner till finns inte en "catch-all" -metod hittills. Den metod som presenteras här är anpassad från our erfarenhet från fältet under de senaste 10 åren i olika marina miljöer som spänner tropiska till arktiska system.
Mikrobiell metagenomiken
Konstruktionen av metagenomic bibliotek för mikrober (dvs bakterier och arkéer) är enklare än virala metagenomes eftersom det är lättare att alstra de minimala DNA-koncentrationer som krävs för bibliotek beredning. Linker förstärknings hagelgevär bibliotek (LASLs) 17,49,50 och hela genomet förstärknings baserade på flera förskjutning förstärkning (MDA) är de två vanligaste metoderna för att generera tillräckligt med DNA för sekvensering. Användningen av MDA att erhålla högre DNA-koncentrationer i mikrobiella metagenomes är ibland nödvändigt. Detta kan dock orsaka artefakter i sekvensdata, såsom overamplification av dinoflagellater minicircles. MDA metoder är kända för att företrädesvis förstärka enkelsträngat och cirkulärt DNA, vilket resulterar i icke-kvantitativa resultat 51,52. De optimerade LASLs närmar 50 kan således fungerar som ett bättre alternativ för att förstärka både mikrobiell och viral metagenomic DNA för sekvensering. Det är viktigt att notera att den LASLs tillvägagångssätt har flera steg, kräver sofistikerad utrustning, och är begränsad till dsDNA-mallarna. Vidare har vävnaden DNA-extraktion kit visats att extrahera DNA från både grampositiva och gramnegativa phyla, men det har inte verifierats att effektivt lysera motsträviga mikrobiell taxa eller deras associerade strukturer (t.ex. viss arkéer, endosporer, eller svampsporer) . En pärla stryk steg kan därför vara nödvändigt att erhålla DNA från vissa mikrober.
Dessa omfattande utvärderingar kommer att leda till en bättre förståelse av virus och mikrobiell ekosystemens funktion. Även om få studier har åtagit ansträngningen för att bedöma alla föreslagna parametrar, många har undersökt utvalda. Al., Nelson et 53 föreslog en anslutning between specifik rev livsmiljöer och uttömning i både DOC och Bakteriekoncentrationerna i förhållande till öppet hav. Dessa förändringar koncentrations åtföljdes av olika differentieringar av Bakterie samhällen. Et al. Dinsdale 5 visade att ökad mänsklig påverkan åtföljdes av 10x högre bestånd av mikrobiella celler och virusliknande partiklar. Mikrobiella samhällen i marina vatten som omger bebodda öar hade också större fraktioner av heterotrofa och potentiella patogener 5. Slutligen McDole et al. 4 visade, genom att införa microbialization poäng, att mänskliga aktiviteter flyttar energi till mikroberna, på bekostnad av de macrobes. Dessa studier, inriktade på särskilda mikrobiella och vattenkemiparametrar, tillhandahålla nya insikter i den biokemiska strukturen i de marina ekosystemen. Kombinera traditionella uppgifter i ekosystemens övervakningsinsatser - som temperatur och pH-värden, fiskbiomassa och diversifieringty, bentiska omslag, eller exponering för mänsklig påverkan - med vattenkemi och mikrobiella bedömningar, sannolikt kommer att leda till mer känsliga för miljöövervakning insatser, vilket kan leda till mer specifikt riktade bevarandeåtgärder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Niskin collection and processing units (Hatay Niskins) | Figure 1 | ||
| Filtration setup | Figure 1 | ||
| 32-36% Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Sci | A508-212 | |
| High-density polyethylene (HDPE) container | e.g., 5 Gallon HDPE UN Certified Pail with Snap-On Lid | ||
| Combustion oven (550 °C) | |||
| 60 ml HDPE vials | Fisher Sci | 02-896-2B | |
| 25 mm GF/F filter | Fisher Sci | 09-874-64 | |
| Forceps | Fisher Sci | XX62-000-06 | |
| Sterile, non-powdered gloves | Fisher Sci | 19-170-010B | |
| Bilge pump | e.g., Thirsty Mate 124PF | ||
| 20 L collapsible low-density polyethylene carboy | e.g., Reliance Fold A Carrier II | ||
| Tangential flow filter (TFF) ultrafiltration hollow fiber cartridges | Amersham | CFP-2-E-9A | |
| Platinum-cured silicon tubing for TFF | Cole Parmer | 96440-82 | |
| Hose clamps | Cole Parmer | P-68007-23 | |
| Peristaltic pump | Cole Parmer | EW-77410-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) solution | Electron Microscopy Sciences | 21162 | |
| 0.2 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-61 | |
| 8.0 µm Polycarbonate track-etched membrane filter | Fisher Sci | 09-300-57 | |
| 0.22 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVGP01050 | |
| 0.45 µm Polyvinylidene difluoride cylindrical filter | Fisher Sci | SVHV010RS | |
| Synthetic nylon mesh | Sefar | 03-125-37 | |
| 20 ml Plastic scintillation bottle | Fisher Sci | 03-341-72C | |
| Clean bucket (10-20 L) | |||
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15714 | |
| 25% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16220 | |
| Liquid nitrogen | |||
| 0.02 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6002 | |
| 0.2 µm High-purity alumina matrix filter with annular polypropylene support ring | Fisher Sci | 6809-6022 | |
| 10,000x SYBR Gold nucleic acid stain | Invitrogen | S11494 | |
| DAPI solution 25 µg/ml | Invitrogen | D1306 | |
| Molecular grade water | sigma aldrich | W-4502 | |
| Ascorbic acid | Fisher Sci | BP351-500 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Sci | BP399-500 | |
| Glycerol | Fisher Sci | G31-500 | |
| Microscope slide | Fisher Sci | 12-550-123 | |
| Coverslip | Fisher Sci | 12-548-5M | |
| Delicate task wipe | Fisher Sci | 06-666A | |
| Slide station with vacuum pump | Figure 3 | ||
| DNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.1 | Nucleospin tissue kit |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Lifetechnologies | AM2546 | |
| 200-proof Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15058 | |
| Red cap: Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler | Cole Parmer | EW-45503-88 | |
| Cesium chloride (CsCl) | Fisher Sci | bp1595-500 | |
| 60 ml Syringe | Fisher Sci | 13-6898 | |
| 0.02 µm Alumina matrix disposable syringe filter | Fisher Sci | O992613 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Ultra-swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 333790 | SW41 Ti Rotor |
| DNase I (100 units/µl) | Calbiochem | 260913 | |
| 0.5 M EDTA | Fisher Sci | BP2482-500 | |
| Formamide | Fisher Sci | BP228-100 | |
| Glycogen | sigma aldrich | G-1767 | |
| 1x Tris-EDTA (TE) pH 8.0 | Fisher Sci | BP2473-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Sci | 02674-25 | |
| 20 μg/ml Proteinase K | Fisher Sci | BP1700-500 | |
| Chloroform | Fisher Sci | BP1145-1 | |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | sigma aldrich | p3803 | |
| Isopropanol | Fisher Sci | BP2618-500 | |
| 50 ml Oak Ridge tube | Fisher Sci | 05-562-16B |
References
- Fuhrman, J. A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects. Nature. 399 (6736), 541-548 (1999).
- Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
- Huber, J. A., et al. Microbial population structures in the deep marine biosphere. Science. 318 (5847), 97-100 (2007).
- McDole, T., et al. Assessing coral reefs on a Pacific-wide scale using the microbialization score. PloS ONE. 7 (9), (2012).
- Dinsdale, E. A., et al. Microbial ecology of four coral atolls in the Northern Line Islands. PloS ONE. 3 (2), (2008).
- Nelson, C. E., et al. Coral and macroalgal exudates vary in neutral sugar composition and differentially enrich reef bacterioplankton lineages. The ISME Journal. 7 (5), 962-979 (2013).
- Haas, A. F., et al. Influence of coral and algal exudates on microbially mediated reef metabolism. PeerJ. 1, (2013).
- Smith, J. E., et al. Indirect effects of algae on coral: algae‐mediated, microbe‐induced coral mortality. Ecology Letters. 9 (7), 835-845 (2006).
- Burdige, D. J., Martens, C. S. Biogeochemical cycling in an organic-rich coastal marine basin: 10. The role of amino acids in sedimentary carbon and nitrogen cycling. Geochimica et Cosmochimica Acta. 52 (6), 1571-1584 (1988).
- Capone, D. G., Kiene, R. P. Comparison of microbial dynamics in marine and freshwater sediments: Contrasts in anaerobic carbon catabolism. Limnology and Oceanography. 33 (4), 725-749 (1988).
- Krom, M. D., Sholkovitz, E. R. Nature and reactions of dissolved organic matter in the interstitial waters of marine sediments. Geochimica et Cosmochimica Acta. 41 (11), 1565-1574 (1977).
- Grasshoff, K. Methods of sea-water analysis. Verlag Chemie. , Weinheim and New York. (1976).
- Strickland, J. D. Practical handbook of seawater analysis. Bulletin Fisheries Research Board of Canada. 167, (1968).
- Sharp, J. H., et al. Analyses of dissolved organic carbon in seawater: the JGOFS EqPac methods comparison. Marine Chemistry. 48 (2), 91-108 (1995).
- DeLong, E. F. Microbial population genomics and ecology. Current Opinion in Microbiology. 5 (5), 520-524 (2002).
- Hugenholz, P., Goebel, B. M., Pace, N. R. Impact of Culture-Independent Studies on the Emerging Phylogenetic View of Bacterial Diversity. Journal of Bacteriology. 180 (18), 4765-4774 (1998).
- Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
- Willner, D., Hugenholtz, P. From deep sequencing to viral tagging: Recent advances in viral metagenomics. BioEssays. 35, 436-442 (2013).
- Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4, 470-483 (2009).
- John, S. G., et al. A simple and efficient method for concentration of ocean viruses by chemical flocculation. Environmental Microbiology Reports. 3, 195-202 (2011).
- Lim, Y. W., et al. The Microbiome and Virome of CF. Pediatric Pulmonology. 47, 321-322 (2012).
- Kelly, L. W., et al. Black reefs: iron-induced phase shifts on coral reefs. The ISME Journal. 6 (3), 638-649 (2012).
- Bjornsen, P. K. Automatic determination of bacterioplankton biomass by image analysis. Applied Environmental Microbiology. 51, 1199 (1986).
- Simon, M., Azam, F. Protein content and protein synthesis rates of planktonic marine bacteria. Marine Ecology Progress Series. 51 (3), 201-213 (1989).
- Hara, S., Koike, I., Terauchi, K., Kamiya, H., Tanoue, E. Abundance of viruses in deep oceanic waters. Marine Ecology Progress Series. 145 (1), 269-277 (1996).
- Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
- Weinbauer, M. G., Brettar, I., Hofle, M. G. Lysogeny and virus-induced mortality of bacterioplankton in surface, deep, and anoxic marine waters. Limnology and Oceanography. 48 (4), 1457-1465 (2003).
- Clasen, J. L., Brigden, S. M., Payet, J. P., Suttle, C. A. Evidence that viral abundance across oceans and lakes is driven by different biological factors. Freshwater Biology. 53 (6), 1090-1100 (2008).
- Parada, V., Baudoux, A. C., Sintes, E., Weinbauer, M. G., Herndl, G. J. Dynamics and diversity of newly produced virioplankton in the North Sea. The ISME Journal. 2 (9), 924-936 (2008).
- Angly, F. E., et al. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biology. 4 (11), (2006).
- Hansell, D. A., Carlson, C. A. Deep ocean gradients in dissolved organic carbon concentrations. Nature. 263 (266), (1998).
- Carlson, C. A., et al. Dissolved organic carbon export and subsequent remineralization in the mesopelagic and bathypelagic realms of the North Atlantic basin. Deep Sea Research Part II: Topical Studies in Oceanography. 57 (16), 1433-1445 (2010).
- Sharp, J. H. Improved analysis for particulate organic carbon and nitrogen from seawater. Limnology and Oceanography. 19 (6), 984-989 (1974).
- Ehrhardt, M., Koeve, W. Determination of particulate organic carbon and nitrogen. Methods of Seawater Analysis. Third Edition, 437-444 (2007).
- Haas, A. F., et al. Organic matter release by coral reef associated benthic algae in the Northern Red Sea. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 389 (1), 53-60 (2010).
- Guildford, S. J., Hecky, R. E. Total nitrogen, total phosphorus, and nutrient limitation in lakes and oceans: Is there a common relationship. Limnology and Oceanography. 45 (6), 1213-1223 (2000).
- Allison, S. D., Chao, Y., Farrara, J. D., Hatosy, S., Martiny, A. C. Fine-scale temporal variation in marine extracellular enzymes of coastal southern California. Frontiers in Microbiology. 3, (2012).
- Van Duyl, F. C., Gast, G. J. Linkage of small-scale spatial variations in DOC, inorganic nutrients and bacterioplankton growth with different coral reef water types. Aquatic Microbial Ecology. 24 (1), 17-26 (2001).
- De Goeij, J. M., Van Duyl, F. C. Coral cavities are sinks of dissolved organic carbon (DOC). Limnology and Oceanography. 52 (6), 2608-2617 (2007).
- De Goeij, J. M., et al. Major bulk dissolved organic carbon (DOC) removal by encrusting coral reef cavity sponges. Marine Ecology Progress Series. 357, 139-151 (2008).
- Mueller, B., et al. Natural diet of coral-excavating sponges consists mainly of dissolved organic carbon (DOC). PLoS ONE. 9 (2), (2014).
- Carlson, C. A., Ducklow, H. W., Hansel, D. A. Organic carbon partitioning during spring phytoplankton blooms in the Ross Sea polynya and the Sargasso Sea. Oceanography. 43 (3), 375-386 (1998).
- Cotner, J. B., et al. Nutrient limitation of heterotrophic bacteria in Florida Bay. Estuaries. 23 (5), 611-620 (2000).
- Willner, D., et al. Metagenomic detection of phage-encoded platelet-binding factors in the human oral cavity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (1), 4547-4553 (2011).
- Hall, R. J., et al. Evaluation of rapid and simple techniques for the enrichment of viruses prior to metagenomic virus discovery. Journal of Virological Methods. 195, 194-204 (2013).
- Yang, S. Y., et al. Nanoporous membranes with ultrahigh selectivity and flux for the filtration of viruses. Advanced Materials. 18 (6), 709-712 (2006).
- Feldman, H. A., Wang, S. S. Sensitivity of various viruses to chloroform. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 736-738 (1961).
- Ackermann, H. W. The Bacteriophages., Second Edition. Calendar, R. , Oxford University Press. New York. 8-16 (2006).
- Henn, M. R., et al. Analysis of High-Throughput Sequencing and Annotation Strategies for Phage Genomes. PLoS ONE. 5 (2), (2010).
- Duhaime, M. B., Deng, L., Poulos, B. T., Sullivan, M. B. Towards quantitative metagenomics of wild viruses and other ultra-low concentration DNA samples: a rigorous assessment and optimization of the linker amplification method. Environmental Microbiology. 14 (9), 2526-2537 (2012).
- Yilmaz, S., Allgaier, M., Hugenholtz, P. Multiple displacement amplification compromises quantitative analysis of metagenomes. Nature Methods. 7 (12), 943-944 (2010).
- Kim, K. H., Bae, J. W. Amplification Methods Bias Metagenomic Libraries of Uncultured Single-Stranded and Double-Stranded DNA Viruses. Applied Environmental Microbiology. 77 (21), 7663-7668 (2011).
- Nelson, C. E., Alldredge, A. L., McCliment, E. A., Amaral-Zettler, L. A., Carlson, C. A. Depleted dissolved organic carbon and distinct bacterial communities in the water column of a rapid-flushing coral reef ecosystem. The ISME Journal. 5 (8), 1374-1387 (2011).
- Kelly, L. W., et al. Local genomic adaptation of coral reef-associated microbiomes to gradients of natural variability and anthropogenic stressors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (28), 10227-10232 (2014).
- Lim, Y. W., Haynes, M., Furlan, M., Robertson, C. E., Harris, J. K., Rohwer, F. Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples. J. Vis. Exp. , (2014).
