Summary
Кинезины характеризуются нуклеотидной зависит от взаимодействия с микротрубочками: цикл оборота АТФ, соединенный с циклом микротрубочек взаимодействия. Здесь мы описываем протоколы для анализа кинетики отдельных переходов нуклеотидных в СПС цикла оборота в кинезина используя флуоресцентно меченых нуклеотидов и флуоресценции остановил поток.
Abstract
Кинезин суперсемейство микротрубочек связаны моторных белков поделиться характерный домен двигателя, который как гидролизует АТФ и связывает микротрубочки. Кинезины отображения различия между суперсемейству как в АТР оборота и в микротрубочек взаимодействия. Эти различия адаптировать конкретные кинезинов для различных функций, таких как грузового транспорта, микротрубочки скольжения, деполимеризации микротрубочек и стабилизации микротрубочек. Чтобы понять механизм действия в кинезина важно понять, как химический цикл оборота АТФ соединен с механической цикла микротрубочек взаимодействия. Чтобы рассекать АТФ цикл оборота, один подход заключается в использовании флуоресцентно меченых нуклеотидов визуализировать отдельные шаги в цикле. Определение кинетики каждого нуклеотида перехода в цикле оборота АТФ позволяет ограничение скорости шаг или шаги для полного цикла, которые будут определены. Для кинезином, важно знать лимитирующей стадией вотсутствие микротрубочек, как этот шаг, как правило, ускоряется в несколько тысяч раз, когда кинезин взаимодействует с микротрубочками. Цикл в отсутствие микротрубочек затем сравнивается с, что в присутствии микротрубочек, чтобы полностью понять АТФ цикл оборота Kinesin в. Кинетика отдельных переходов нуклеотидных как правило, слишком быстро, чтобы наблюдать вручную смешения реагентов, в частности, в присутствии микротрубочек. Быстрое смесительное устройство, такое как флуориметра остановленного потока, что позволяет кинетики, чтобы наблюдать на шкале времени, как всего несколько миллисекунд, может быть использован для мониторинга таких переходов. Здесь мы описываем протоколы, в которых быстрое перемешивание реагентов по остановленного потока используется в сочетании с флуоресцентно меченых нуклеотидов препарировать АТФ цикл оборота в кинезина.
Introduction
В кинезины являются суперсемейством белков, характеризующихся высоко консервативный моторного домена 1. Домен кинезин двигатель взаимодействует с микротрубочками в нуклеотидной-зависимым образом. Члены семьи кинезина вывести диапазон функций от транслокации кинезинов, которые несут груз в ориентированном моды вдоль микротрубочек, в не-транслокации микротрубочек конечных связывания кинезинов, которые регулируют динамику микротрубочек 2,3.
Кинезины использовать оборот adensosine-5'-трифосфата (АТФ), чтобы регулировать их взаимодействие с микротрубочки цитоскелета 4-6. Конформации домена кинезин двигателя и, следовательно, его сродство для микротрубочки зависит от его нуклеотидной государства: ATP, ADP, ADP.Pi или нет нуклеотид может быть связан (Рисунок 1). Чтобы понять молекулярный механизм в кинезина, понимание взаимосвязи между оборота АТФ и микротрубочек взаимодействия требуется.refore, одной из основных целей в области кинезина является характеристика функциональных свойств различных нуклеотидных государств и кинетики переходов между ними как в присутствии и в отсутствие микротрубочек.
Рис.1 Простейшая ATP цикл оборота для кинезина состоит из четырех возможных состояний: нуклеотид-бесплатно (Φ), АТФ переплете, ADP.P я -связанного и ADP переплете Каждый из четырех переходов характеризуется вперед и. назад константа скорости (к х и К х соответственно).
Чтобы понять, как химический цикл АТФ оборота соединен с механической цикла микротрубочек взаимодействия, необходимо определить, какой этап в цикле оборота АТФ ограничение скорости в отсутствие microtubULES, а затем определить, как цикл изменяется в присутствии микротрубочек. Простейший ATP цикл оборота состоит из четырех отдельных этапов химических веществ: (1) связывание АТФ в пустую сайте (Φ обозначает пустое место, то есть, нуклеотид-бесплатно Kinesin); (2) ATP расщепление; (3) фосфат диссоциации и (4) АДФ диссоциации (фиг.1). Лимитирующей стадией устанавливает константу скорости полного АТФ цикла оборота. Поэтому, чтобы определить, какой этап является ограничивающим скорость каждого из отдельных переходов должна быть измерена, и по сравнению с постоянной скоростью в течение полного цикла. Методы измерения общего оборота АТФ константу скорости цикла, здесь не описываются, но можно найти в работе 7 Здесь мы опишем методы, с помощью которых константы скорости отдельных химических стадий могут быть определены. Есть несколько способов, доступных для изучения отдельных переходов в цикле оборота белка нуклеотид гидролиза. Методы, представленные здесь взять advantagэ свойств нуклеотидов, меченных флуорофора methylanthraniloyl, как правило, называют MANT, которые отображают изменение интенсивности флуоресценции при связывании с белком 8. Мант группа используется, потому что его небольшой размер означает, что, в сочетании с рибоза (Рисунок 2A), он обычно имеет небольшое или никакое влияние на кинетику нуклеотида связывания или гидролиза 9-12. Здесь мы представляем протоколы, описывающие использование MANT меченных нуклеотидов, в сочетании с флуоресценции остановленного потока, чтобы позволить наблюдение нуклеотида связывания и диссоциации в СПС цикла оборота в кинезина.
Protocol
1 Определение интенсивности флуоресценции изменению при связывании Mant-меченого нуклеотида.
- Добавить 1 мкм Mant-меченого нуклеотида до 1 мкм кинезином (конечные концентрации) в соответствующем буфере для реакции. Обычно буфер, который приносит пользу роста микротрубочек и стабильности используется (см обсуждение). Обычно используется буфер содержит 80mm пиперазин-бис-2-этансульфокислота (ТРУБЫ) pH6.9, 1 мМ MgCl 2 и 1 мМ этиленгликоль-бис-2 аминоэфир-тетрауксусной кислоты (EGTA).
Примечание: Концентрация кинезином указанного во всех протоколов относится к концентрации нуклеотидных сайтов связывания (то есть, моторные домены). Различные кинезины существовать в виде мономеров, димеров или тетрамеров и т.д. могут содержать более чем один нуклеотид-связывающий сайт в молекуле. - После инкубационного периода (1-3 мин) и с помощью стандартного флуориметра, измерить спектр излучения для нуклеотидной-кинезин комплекса MANT меченных. Используйте длины волны возбуждения 365 нм имера, излучаемый свет от 400-500 нм с шагом 1 нм.
- Сделать раствор 1 мМ MANT-меченых нуклеотидов в том же реакционном буфере, используемого на стадии 1.1.
- Измеряют спектр излучения для MANT нуклеотидной только образца, как описано выше (этап 1.2).
- Нормализация спектры к сигналу на длине волны пика интенсивности флуоресценции в спектре Mant нуклеотида в растворе (т.е. без кинезином) путем деления через на это значение.
- Участок нормализованное спектры (например, 2В) соблюдать различия интенсивности флуоресценции между mantATP переплете и / или mantADP связанного кинезина и MANT нуклеотида в растворе.
2 Измерение ассоциации и диссоциации константы скорости mantATP
- К раствору до 20 мкм кинезином (см обсуждение) в любой подходящей Mg2 + -Бесплатная буфера (например, 80 мм ТРУБЫ pH6.9, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween 20), добавить 1мМ (конечная концентрация) этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 1 мМ (конечная концентрация) дитиотреитола (ДТТ). Примечание: Добавление Твин 20 в буфер рекомендуется, поскольку это уменьшает / предотвращает потерю кинезина белка на колонки, используемой для буфера обмена (шаги 2,3 и 3,3)
- Выдержите раствор при 25 ° С в течение 15 мин.
- Отдельный бесплатно нуклеотидов и ЭДТА от кинезина использованием колонки фильтрации G-25 сефадекс гель самотеком в соответствии с инструкциями изготовителя (см список материалов).
- Равновесие столбец, по крайней мере 3 объема колонки, соответствующей Mg 2 + -свободных буфера (см Шаг 2,1). Загрузите Kinesin содержащих раствор на колонку. Готовят пробирку добавлением соответствующего объема 100 мМ раствора хлорида магния в пустую трубу, таким образом, что конечная концентрация хлорида магния составляет 1 мм после того, как коллекции кинезин раствора. Немедленное добавление хлорида магния помогает Stabiliсе нуклеотидной без кинезин.
- Элюции кинезин помощью соответствующего Mg 2 + -free буфер. Кинезины неустойчивы, когда бесплатно нуклеотида, поэтому важно работать быстро. Храните нуклеотида бесплатно кинезин на льду и использовать в течение 1-2 часов.
- Во время или до подготовки нуклеотидной без кинезина, подготовить серию концентрации mantATP в том же буфере реакции в качестве окончательного решения нуклеотидной без кинезина. Определить диапазон концентраций mantATP необходимых в соответствии с имеющейся концентрации кинезина с типичной серии от 0,1 до 50 мкм (см шаг 2,5 и обсуждение).
- Подготовьте концентрации серию нуклеотидной без кинезина. Для каждой концентрации mantATP (Шаг 2,4), концентрация свободной нуклеотидной кинезином должна быть подготовлена таким образом, что MANT-меченый нуклеотид в 5 до 10-кратного молярного избытка по кинезин нуклеотидных участков связывания.
- Установите длину волны возбуждения на остановленном-Floж флуориметре к 365 нм и собирают излучаемый свет в> 400 нм с использованием долгосрочной фильтр.
- Начиная с самой низкой концентрации mantATP, смешать с mantATP соответствующей концентрации свободных нуклеотидов кинезином в соотношении 1: 1, об / об соотношении с использованием флуориметра остановил поток (фиг.3А и 3В вставка). Примечание: Реагенты разбавляют на 50% при смешивании. Держите к сведению концентрации нуклеотидов как до и после смешивания (т.е., 3,0 / 1,5 мкм), чтобы избежать путаницы.
- Установите изменение интенсивности флуоресценции, измеренной при каждой концентрации mantATP к показательной функции плюс линии постоянного отрицательным наклоном к ответственности за фотообесцвечиванию из MANT группы (т.е. флуоресценции = A 0 .exp (K OBS .t) + (т. T + C), где 0 представляет собой амплитуду, к OBS является константа скорости и время T, рис 3B и обсуждение). Из этих припадков определитьконстанты скорости (к набл) в каждой концентрации mantATP. Каждый к набл есть свертка с постоянной ассоциации и диссоциации скорости (рис 1, к 1 и K -1).
- Деконволюции константы ассоциации и скорость диссоциации путем построения K набл против концентрации mantATP (например, рис 3C). Установите эти данные для линейной функции (то есть, к набл = к 1 [mantATP] + K -1) для получения градиента и по оси пересечения. Градиент представляет собой константу скорости mantATP ассоциации (рис 1, к 1) с подразделениями М -1 с -1. Перехват представляет собой константу скорости диссоциации (рисунок 1, K -1) с подразделениями с -1 (см обсуждение). Примечание: Этот подход также может быть применен для определения ассоциации и диссоциации ADPконстанты скорости (Рисунок 1, к -4 и K 4), используя mantADP как нуклеотида.
3 Измерение скорости диссоциации Константа для mantADP
- К раствору 2 мкм кинезином в подходящем реакционном буфере (например, 80 мм Трубы pH6.9, 1 мМ MgCl 2, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Tween 20), добавьте 50 мкм mantADP (конечная концентрация).
- Инкубируют при 25 ° С в течение 30 мин.
- Удалите излишки mantADP и другим свободным нуклеотид буфером обмена в кинезин в выбранной реакционного буфера, используя колонку G-25 SEPHADEX (см список материалов) в соответствии с инструкциями изготовителя. Домен кинезин двигатель должен теперь быть загружены с mantADP.
- Установите длину волны возбуждения на остановленного потока флуориметре к 365 нм и собирают излучаемый свет в> 400 нм с использованием долгосрочной фильтр.
- Смешайте комплекс mantADP.kinesin (~ 1 мкм) с 50-кратным или более молыR избыток немеченого АТФ в соотношении 1: 1, об / об с использованием флуориметра остановил поток (фиг.4А и 4В вставка).
- Установите уменьшение интенсивности флуоресценции наблюдается в течение долгого времени, чтобы одной экспонентой плюс линии постоянного отрицательным наклоном, чтобы учесть фотообесцвечивания в MANT группы (т.е. флуоресценции = A 0 .exp (K OBS .t) + (m.t + в), где 0 является амплитуда, к набл является постоянная скорость и т время, рис 4B и обсуждение). К набл определяется из этого подойдет является константа скорости диссоциации ADP (рис 1, к 4) с подразделениями с -1 (см обсуждение).
Representative Results
Увеличение интенсивности флуоресценции в Mant группы, как правило, наблюдается при связывании Mant-меченого нуклеотида в кинезином. Тем не менее, величина такого изменения сигнала зависит от конкретного кинезином о котором идет речь. Таким образом, это полезно для выполнения измерений равновесия, чтобы подтвердить, как наличие и величину изменения интенсивности флуоресценции перед переходом к Кинетические анализы. Представитель спектры флуоресценции для mantATP и mantADP, как в растворе и в комплексе с кинезина-13, MCAK, показаны на рисунке 2B. Эти данные подчеркивают увеличение интенсивности флуоресценции отображаемый как mantATP и mantADP при связывании с MCAK. Изменение интенсивности флуоресценции при связывании MANT нуклеотида к кинезина используется для сообщения об ассоциации и диссоциации как АТФ и АДФ (разделы 2 и 3). В случае MCAK, разница интенсивности флуоресценции наблюдается между mantATP.kinesin и mantADP.kinesin 3А изображает реакцию, которая происходит при смешивании mantATP с нуклеотидной без кинезина. Типичные данные, иллюстрирующие увеличение интенсивности флуоресценции, которое происходит при связывании mantATP к кинезином-13, MCAK показано на фигуре 3В. Данные типа, показанного на фигуре 3В собираются в диапазоне концентраций mantATP. Участок констант скоростей (к OBS), определяемых по сравнению с концентрацией mantATP показан на рисунке 3C. Установка этих данных к линейной функции (то есть, к набл = к 1 [mantATP] + K -1) позволяет деконволюцию констант скоростей, которые способствуют K набл (Шаг 2.8). Поэтому включение определения как ассоциации и константы скорости диссоциации для mantATP (Рисунок 1, к 1 и к Фиг.4А изображает реакцию, которая происходит при смешивании mantADP.kinesin с избытком немеченого АТФ. Данные на рисунке 4В показывает уменьшение интенсивности флуоресценции наблюдается для mantADP при диссоциации от кинезина-13, MCAK. Установив эти данные в экспоненциальной функцией (шаг 3.6) константа скорости диссоциации mantADP определяется непосредственно. 
Рисунок 2 нуклеотидов, меченных флуорофора methylanthraniloyl (MANT) используются для выделения отдельных шагов в СПС цикла оборота. (А) Структура mantATP, показывающий положение Mant флуорофора конъюгированных с либо 2 'или 3' положении на рибозы. (B), нормированные спектры флуоресценции для mantATP и mantADP в растворе (Maxp) и mantATPд mantADP в комплекс с кинезина MCAK (MATP + MCAK и MADP + MCAK). Спектры mantATP нормированы к флуоресценции при макс для mantATP в растворе и спектров mantADP нормализуются к флуоресценции при макс для mantADP в растворе. Спектры Mant нуклеотидов, смешанных с MCAK собираются в почтовом перемешивания 1 мин. Концентрация реагентов и Флуориметр настроек, как описано в протоколе шаги 1.1 и 1.2. 
Рисунок 3 Измерение скорости ассоциации постоянной mantATP. (А) Схематическое изображающая реакцию, которая происходит сообщению смешивание по остановленного потока: mantATP (MATP) связывается с нуклеотида без кинезин. Интенсивность флуоресценции из мант группе возрастает при связывании с белком. (B) изменение флуоресценции сигнал (черный) наблюдается при смешении mantATP (25 м) с MCAK (5 м нюcleotide-свободный,). Эти данные нужным (красный пунктир), чтобы одной экспонентой плюс линии постоянного отрицательным наклоном, на долю которого приходится фотообесцвечиванию из MANT флуорофором (см обсуждение) Врезка:. Содержание шприцы перед смешиванием на флуориметре остановленного потока. (C) Константы скорости (к набл), определяемых для реакции mantATP с нуклеотидной без MCAK заговор против концентрации mantATP. Этот участок будет иметь линейную область с градиентом, являющегося константы скорости ассоциации (рисунок 1, к 1) с единицами М -1 с -1 и у-перехват, являющегося константа скорости диссоциации (рис 1, K -1) с единиц с -1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рис.4 Измерение константы скорости диссоциации для mantADP (А) Схематическое изображающая реакцию, которая происходит сообщению смешивание по остановленного потока: кинезин с предустановленной mantADP разбавляют в избыток немеченого АТФ. Диссоциирующего mantADP заменяется немеченым АТФ, тем самым предотвращая обратной реакции mantADP ассоциации (см обсуждение). Интенсивность флуоресценции от Mant группы уменьшается при диссоциации от белка. (В) снижение флуоресценции наблюдается при диссоциации mantADP от кинезином MCAK. Сигнал флуоресценции (черный) является нужным (красный пунктир) к одной экспоненты плюс линии постоянной отрицательным наклоном для учета фотообесцвечиванию из MANT группы (см обсуждение). Константа скорости определяется является константа скорости диссоциации mantADP (рис 1, к4) Врезка:.. Содержание шприцы перед смешиванием на флуориметре остановленного потока Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Здесь мы представляем протоколы для наблюдения и анализа кинетики переходов между нуклеотидных государств для кинезина. Эти протоколы используют быстрый метод смешивания остановил поток в сочетании с флуоресцентно меченых нуклеотидов. Методы этого типа широко используются для изучения нуклеотидной связывания и диссоциации для различных кинезинов 9-11,13-16. Методы, описанные не позволяют наблюдать высвобождение фосфата (рис 1, этап 3). Тем не менее, флуоресценции остановили поток может быть использован, чтобы соблюдать этот переход с помощью белка фосфат чувствительный к пару производства фосфорных к изменению интенсивности флуоресценции 17. Методы, представленные использования нуклеотиды, меченные с небольшой флуорофором methylanthraniloyl (MANT), которые, как правило наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции при связывании с белком. Кроме того, MANT флуорофор, когда либо конъюгирован с 2 'или 3' положение на Ribose, часто имеет мало или вообще не влияет на связывания, диссоциации или гидролиза нуклеотида 9-12. MANT-меченых нуклеотидов легко доступны из коммерческих источников (список материалов) и представлены в виде смесей 2 'и 3' конъюгата, так как они быстро повторно в равновесие, когда очищен до одного изомера 8. MANT меченных нуклеотидов делают отличные молекулы репортера, с помощью которого можно наблюдать кинетика нуклеотида связывания и диссоциации.
Использование флуоресцентно меченых нуклеотидов означает, что считывать из анализов, описанных в реальное изменение времени в интенсивности флуоресценции. Это делает эти анализы идеально подходит для флуоресценции остановленного потока, что позволяет быстрое смешивание реагентов и наблюдение в реальном времени изменений в флуоресценции, связанных с последующей реакцией. Сочетание остановленного потока в смесительной техники и флуоресценции в качестве метода обнаружения производит систему, которая является относительно образца EFфициент. Например, чтобы приобрести данные, показанные на рисунке 3C требует 0,8 - 1,0 мг очищенного кинезина-13, MCAK, и приобрести данные, показанные на рисунке 4В требуется ~ 0,3 мг очищенного кинезина-13, MCAK. Один из недостатков использования Mant в качестве флуорофора в том, что он склонен к фотообесцвечиванию. Это можно наблюдать в отрыве от кинезин кинетики реакции при смешивании раствора Mant-меченого нуклеотида с реакционного буфера, в отсутствие кинезином, в остановленном потока. Медленное снижение интенсивности флуоресценции наблюдается как мант группа становится беленой. В диапазоне временных масштабов, используемых в протоколах, описанных фотообесцвечивание в MANT группы хорошо описывается линейной функцией. Поэтому, самый простой способ, чтобы исправить данные для фотообесцвечивания является подгонка к показательной функции с базовым описывается линейной функцией (т.е. мт + с), а не более общей плоской базовой, описанной одним параметром.
mantATP связывания
При измерении константы скорости ассоциации и диссоциации mantATP (раздел 2) ADP, который остается связанным с кинезина нуклеотид-связывающего сайта в отсутствие микротрубочек, должны быть удалены. Это позволяет mantATP ассоциации и диссоциации (Рисунок 1, стадия 1), которые должны соблюдаться в отрыве от ADP диссоциации. Для достижения этой цели кинезин инкубируют с по крайней мере 50-кратным избытком ЭДТА в течение нуклеотидных сайтов связывания (Шаг 2.1). ЭДТА изолирует Mg 2 + ионы Mg 2 + вызывает диссоциацию от нуклеотид-связывающего кармана, что приводит к высвобождению нуклеотида 11. Поэтому, при проведении шаги 2,1 - 2,3, то важно использовать буфер, свободный от Mg 2 +. Нуклеотид без кинезин белок заменен буфер, чтобы отделить его как от свободного нуклеотида и от ЭДТА. Для такого разделения, одноразовый безнапорное д ЕКолонка л фильтрации и достаточно проста и быстрое использование (см список материалов). Взаимодействие mantATP с нуклеотидной свободного кинезина осуществляется в диапазоне концентраций mantATP (Step 2.4) для того, чтобы деконволюцию констант ассоциации и диссоциации ставка (Шаг 2.8). Теория, лежащая экспериментов этого типа хорошо описано в ссылке 18 При выполнении этих экспериментов один начинается с самой низкой концентрацией mantATP. Это устраняет необходимость промывания между различными концентрациями. Это, вероятно, будет необходимо отрегулировать чувствительность флуориметре остановленного потока как концентрация mantATP увеличивается. Концентрация mantATP всегда должно быть по крайней мере в 5-кратном избытке по концентрации кинезин нуклеотидных участков связывания для поддержания псевдо условия первого порядка. Однако, как концентрация mantATP увеличивается, то изменение сигнала может стать завален как доля нуклеотида, который связывается с кинезин уменьшается. TherefoRe, концентрация кинезином также увеличивается для каждого нового концентрации mantATP таким образом, что концентрация mantATP никогда не больше, чем 10-кратного молярного избытка по нуклеотидных сайтов связывания (Шаг 2.6).
mantADP диссоциация
Хотя объединение и скорости диссоциации константы для mantADP можно определить по тому же методу, описанному для mantATP (раздел 2). Диссоциации АДФ от кинезином может быть непосредственным наблюдением с помощью предварительной загрузки нуклеотид-связывающего сайта с mantADP (шаги 3.1-3.3) Комплекс mantADP.kinesin затем смешивают с избытком немеченого АТФ (этап 3.5). Избыток немеченного АТФ предотвращает связыванию mantADP к кинезина и тем самым позволяет реакции диссоциации (рисунок 1, к 4), который должен соблюдаться в отрыве от ассоциации mantADP. В этом анализе концентрации немеченого АТФ должны быть по крайней мере 50-кратный молярный избыток NUCleotide сайты связывания. Теория, лежащая этом анализе хорошо описано в ссылке 18 Это прямой метод дает более точное значение константы скорости диссоциации, чем экстраполяции к оси у, описанной в шаге 2.8.
Включение микротрубочек
Способы, описанные, также могут быть использованы, чтобы определить кинетику нуклеотида связывания и диссоциации в присутствии микротрубочек. Микротрубочки знакомятся с нуклеотидной содержащий шприц перед смешиванием в остановленного потока: нижний шприц на фигуре 3В и 4В (Вставках). В этой конфигурации, кинезин встретится с нуклеотида, в то же время, как она отвечает микротрубочки. Стабилизированные микротрубочки используются, когда время жизни тубулина полимера увеличивается за счет использования либо стабилизирующий химической, таких как таксол или его негидролизуемого аналога ГТФ, таких как гуанозин-5 '- [(α, β) -methyleno] трифосфат (GMPCPP, увидеть список материалов). Можно использовать два цикла полимеризации тубулина с GMPCPP, чтобы сделать микротрубочки, которые можно хранить в течение многих месяцев в жидком 9,19 азота. Использование заранее подготовленных микротрубочек значительно снижает практические трудности в выполнении этих анализов. Чтобы включить микротрубочек в анализах, важно использовать буфер, подходящий для реакции стабильности микротрубочек. Буфер выбора является ТРУБЫ основе, с наиболее часто используемых буфере, содержащем 80 мм Трубы рН 6,9, 1 мМ MgCl 2 и 1 мМ EGTA (известный как BRB80) 20,21.
Методы, описанные здесь, не ограничены в использовании с кинезинов, но могут быть адаптированы и применены к любой нуклеотидной связывающего белка. Например, подобные методы были применены к циклу оборота АТФ членов миозина семейству молекулярных двигателей 12,22 и использование Mant помечены гуанозина нуклеотидов расширяетметоды этого типа в GTP гидролиз белков 23,24.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается биотехнологии и биологических наук Исследовательского Совета (BBSRC), Королевского общества и Университета Ноттингема.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E.
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al.
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W.
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
