Bruk av Stoppet-Flow fluorescens og merkede nukleotider Analyser ATP Omsetning Cycle of kinesins

Summary

Kinesins er karakterisert ved nukleotid-avhengig interaksjon med mikrotubuli: en syklus av ATP omsetning koplet til en syklus av mikrotubuli interaksjon. Her beskriver vi protokoller for å analysere kinetikken av individuelle nukleotid-overgangene i ATP omsetning syklus av en kinesin ved hjelp av fluorescensmerkede nukleotider og sluttet-strømnings fluorescens.

Abstract

Den kinesin superfamily av mikrotubulus forbundet motor proteiner dele en karakteristisk motor domene som både hydrolyserer ATP og binder mikrotubuli. Kinesins vise forskjeller mellom superfamily både i ATP omsetning og i microtubuli samhandling. Disse forskjellene skreddersy spesifikke kinesins til ulike funksjoner som cargo transport, mikrotubulus skyve, mikrotubuli depolymerization og microtubule stabilisering. For å forstå virkningsmekanismen av en kinesin er det viktig å forstå hvordan den kjemiske syklus av ATP omsetningen er koplet til den mekaniske syklus av mikrotubuli interaksjon. For å dissekere ATP omsetning syklus, er en metode for å utnytte fluorescensmerkede nukleotider for å visualisere de enkelte trinn i syklusen. Å bestemme kinetikken av hvert nukleotid-overgang i ATP omsetning syklusen lar det hastighetsbegrensende trinnet eller trinnene for den fullstendige syklus for å bli identifisert. For en kinesin, er det viktig å kjenne hastighetsbegrensende trinn, ifravær av mikrotubuli, da dette trinnet er generelt akselerert flere tusen ganger når kinesin samvirker med mikrotubuli. Syklusen i fravær av mikrotubuli blir deretter sammenlignet med det i nærvær av mikrotubuli til fullt ut å forstå en kinesin største ATP omsetning syklus. Kinetikken av individuelle nukleotid-overganger er generelt altfor fort for å observere ved manuelt å blande reaktantene, spesielt i nærvær av mikrotubuli. En hurtig blandeinnretning, slik som en sluttet strømning fluorimeter, noe som gjør det mulig for kinetikk som skal observeres på tidsskalaer på så lite som noen få millisekunder, kan brukes til å overvåke slike overganger. Her beskriver vi protokoller der hurtig omrøring av reagenser stoppet etter-strømning blir benyttet i forbindelse med fluorescensmerkede nukleotider å dissekere ATP omsetning syklus av en kinesin.

Introduction

De kinesins er en superfamilie av proteiner som er kjennetegnet ved en svært konservert motor domene ^1. Den kinesin motor domene kommuniserer med mikrotubuli i en nukleotid-avhengig måte. Medlemmer av kinesin familie vise en rekke funksjoner fra translocating kinesins, som bærer lasten i en rettet mote langs mikrotubuli, til ikke-translocating mikrotubulus end-bindende kinesins som regulerer mikrotubulidynamikk ^2,3.

Kinesins bruke omsetning på adensosine-5'-trifosfat (ATP) for å regulere deres interaksjon med microtubuli cytoskjelettet ^4-6. Den konformasjon av kinesin motor-domene og dermed dens affinitet for mikrotubulus avhenger av nukleotid-tilstand: ATP kan ADP, ADP.Pi eller ingen nukleotid være bundet (figur 1). For å forstå den molekylære mekanisme av en kinesin, er en forståelse av forholdet mellom ATP omsetning og mikrotubuli interaksjon nødvendig. Denrefore, et viktig mål på kinesin-feltet er å karakterisere de funksjonelle egenskaper av forskjellige nukleotid-stater og kinetikken av overgangene mellom disse både i nærvær og fravær av mikrotubuli.

Figur 1. Den enkleste ATP omsetning syklus for en kinesin består av fire mulige tilstander: nukleotid-fri (Φ), ATP-bundet, ADP.P _i -bound og ADP-bundet til hver av de fire overganger er kjennetegnet ved en frem og. bakover hastighetskonstant (k _x-x og k henholdsvis).

For å forstå hvordan den kjemiske syklus av ATP omsetningen er koplet til den mekaniske syklus av mikrotubulus interaksjon, må man bestemme hvilke trinn i ATP omsetning syklusen er hastighetsbegrensende i fravær av microtubules og deretter bestemme hvordan syklus er endret ved nærværet av mikrotubuli. Den enkleste ATP omsetning syklus består av fire individuelle kjemiske trinnene: (1) ATP-binding til det åpne området (Φ betegner det tomme område, dvs. nukleotid-fri kinesin); (2) ATP cleavage; (3) fosfat dissosiasjon og (4) ADP dissosiasjon (figur 1). Det hastighetsbegrensende trinn setter hastighetskonstanten for den fullstendige omsetning ATP syklus. Derfor, for å bestemme hvilke trinn er hastighetsbegrensende hver av de enkelte overgangene skal bli målt og sammenlignet med hastighetskonstanten for den fullstendige syklus. Metoder for å måle den samlede ATP omsetning syklus hastighetskonstanten er ikke beskrevet her, men kan finnes i referanse 7. Her beskriver vi metoder som hastighetskonstanter for individuelle kjemiske trinnene kan bestemmes. Det finnes en rekke metoder tilgjengelige for å studere enkelte overganger i omsetningen syklus av en nukleotid-hydrolyserende proteiner. De metodene som presenteres her tar advantage av egenskapene til nukleotider merket med fluorofor methylanthraniloyl, vanligvis referert til som mant, som viser en endring i fluorescens-intensiteten ved å binde seg til protein ^8.. Den mant gruppe brukes fordi dens lille størrelse vil si at, når koplet til ribose (figur 2A), vanligvis har det liten eller ingen effekt på kinetikken til nukleotid-bindende eller hydrolyse ^9-12. Her presenterer vi protokoller som beskriver bruken av mant-merkede nukleotider, i forbindelse med stoppet fluorescens-strømning, for å tillate observasjon av nukleotid-bindende og dissosiasjon i ATP omsetning syklus av en kinesin.

Protocol

1. Bestemmelse av fluorescensintensiteten Endring ved Binding av Mant-merket nukleotid.

1. Tilsett 1 pM mant-merket nukleotid til 1 pM kinesin (sluttkonsentrasjoner) i et egnet reaksjonsbuffer. Vanligvis en buffer som fordeler mikrotubulus vekst og stabilitet er brukt (se diskusjon). En vanlig brukt buffer inneholder 80mm piperazin-bis-2-etansulfonsyre (PIPES) pH6.9, 1 mM _MgCl2 og 1 mM etylenglykol-bis-2 aminoeterderivater-tetraeddiksyre (EGTA).
   Merk: Konsentrasjonen av kinesin angitt i alle protokoller refererer til konsentrasjonen av nukleotid-bindingsseter (dvs. motor domener). Forskjellige kinesins eksistere som monomerer, dimerer eller tetramerer og så kan inneholde mer enn ett nukleotid-bindingssete per molekyl.
2. Etter en inkubasjonsperiode (1-3 min) og ved hjelp av en standard fluorimeter, måle emisjonsspektrum for mant-merket nukleotid-kinesin kompleks. Bruk en eksitasjon bølgelengde på 365 nm ogTiltaket lyset 400-500 nm i 1nm trinn.
3. Gjør en oppløsning av 1 mM mant-merkede nukleotid i den samme reaksjonsbuffer som brukes i trinn 1.1.
4. Mål emisjonsspektrum for mant nukleotid bare prøven, som beskrevet tidligere (se trinn 1.2).
5. Normaliser spektrene til signalet ved bølgelengden for maksimal fluorescens intensitet av spekteret av mant nukleotid i løsning (dvs. uten kinesin) ved å dividere gjennom av denne verdi.
6. Plott den normaliserte spektra (f.eks, figur 2B) for å observere fluorescensintensitet forskjeller mellom mantATP-bundet og / eller mantADP-bundet kinesin og mant nukleotid i oppløsning.

2. Måling av foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanter for mantATP

1. Til en oppløsning på opp til 20 uM kinesin (se diskusjon) i en hvilken som helst hensiktsmessig Mg ^{2 +-fri} buffer (for eksempel 80 mm PIPES pH6.9, 1 mM EGTA, 0,1% Tween20), tilsett 1mM (sluttkonsentrasjon) etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 1 mM (sluttkonsentrasjon) ditiotreitol (DTT). Merk: Tilsetning av Tween20 til bufferen er anbefalt som det reduserer / forhindrer tap av kinesin protein på en kolonne som brukes for bufferutveksling (trinn 2.3 og 3.3)
2. Inkuber løsningen ved 25 ° C i 15 min.
3. Separat frie nukleotid og EDTA fra kinesin ved hjelp av et gravitasjonsstrømning G-25 Sephadex gelfiltreringskolonne i henhold til produsentens instruksjoner (se liste over materialer).
   1. Ekvilibrere kolonnen med minst 3 kolonnevolumer av en passende Mg ^{2 +-fri} buffer (se trinn 2.1). Laste kinesin holdige løsning på støtten. Tilbered en samling rør ved tilsetning av et passende volum av 100mM magnesium-klorid-oppløsning til det tomme rør, slik at den endelige konsentrasjon av magnesiumklorid er 1 mM etter oppsamling av kinesin løsning. Umiddelbar tilsetning av magnesiumklorid hjelper stabiliseringSE nucleotide frie kinesin.
   2. Eluer kinesin ved hjelp av en passende Mg ^{2 +-fri} buffer. Kinesins er ustabilt når fri for nucleotide så det er viktig å jobbe raskt. Oppbevar nucleotide frie kinesin på is og bruk innen 1-2 timer.
4. Under eller før fremstillingen av nukleotid-fri kinesin, forberede en mantATP konsentrasjon serie i den samme reaksjonsbuffer som den endelige løsning av nukleotid-fri kinesin. Bestem område av konsentrasjoner av mantATP som kreves i henhold til den tilgjengelige konsentrasjon av kinesin med en typisk serie området fra 0,1 til 50 pm (se trinn 2.5 og diskusjon).
5. Forbered en konsentrasjon rekke nucleotide frie kinesin. For hver konsentrasjon av mantATP (trinn 2.4), bør en konsentrasjon på nukleotid-fri kinesin fremstilles slik at mant-merket nukleotid-er i 5 til 10-ganger molart overskudd i forhold kinesin nukleotid-bindingsseter.
6. Sett eksitasjon bølgelengde på stoppet-flow fluorimeter til 365 nm og samle lyset ved> 400 nm ved hjelp av en lang-pass filter.
7. Fra og med den laveste konsentrasjon av mantATP, bland mantATP med en passende konsentrasjon av nukleotid-fri kinesin i et 1: 1 volum / volum-forhold ved hjelp av en sluttet strømning fluorimeter (figur 3A og 3B Innfelt). Merk: Reaktantene blir fortynnet med 50% ved blanding. Hold et notat av nucleotide konsentrasjon både før og etter blanding (dvs. 3,0 / 1,5 mikrometer) for å unngå forvirring.
8. Monter endring i fluorescens intensitet målt ved hver konsentrasjon av mantATP til en eksponentiell funksjon pluss en linje med konstant negativ helling å gjøre rede for fotobleking av mant gruppen (dvs. fluorescens = A ₀ .exp (k _obs .t) + (m. t + c), hvor A er amplituden _0, k er hastighetskonstanten _obs og t er tiden, se figur 3B og diskusjon). Fra disse passer bestemme enHastighetskonstanten _(kobs) ved hver konsentrasjon av mantATP. Hver k _obs er en konvolusjon av en forening og dissosiasjon hastighetskonstanten (Figur 1, k ₁ og k _-1).
9. Deconvolve foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanter ved å plotte k _obs mot mantATP konsentrasjon (for eksempel Figur 3C). Monter disse data til en lineær funksjon (dvs. _kobs = k ₁ [mantATP] + _k-1) for å oppnå gradient og y-aksen skjæringspunktet. Stigningen representerer hastighetskonstanten for mantATP forening (Figur 1, k ₁₎ med enhetene M ^{-1 -1.} Den skjærings representerer dissosiasjons hastighetskonstanten (Figur 1, _k-1) med enheter av s ^-1 (se diskusjon). Merk: Denne tilnærmingen kan også brukes til å bestemme ADP foreningen og dissosiasjonhastighetskonstanter (Figur 1, k og k _{-4 4)} ved hjelp av mantADP som nukleotid.

3. Måling av dissosiasjon hastighetskonstanten for mantADP

1. Til en oppløsning av 2 pM kinesin i et egnet reaksjonsbuffer (for eksempel 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM _MgCl2, 1 mM EGTA, 0,1% Tween20), tilsett 50 uM mantADP (sluttkonsentrasjon).
2. Inkuber ved ²⁵ ° C i 30 min.
3. Fjern overflødig mantADP og andre gratis nucleotide av buffer utveksling av kinesin til det valgte reaksjonsbuffer ved hjelp av en G-25 Sephadex kolonne (se liste over materialer) i henhold til produsentens instruksjoner. Den kinesin motor domenet skal nå være lastet med mantADP.
4. Sett eksitasjon bølgelengde på stoppet-flow fluorimeter til 365 nm og samle lyset ved> 400 nm ved hjelp av en lang-pass filter.
5. Bland mantADP.kinesin kompleks (~ 1 iiM) med en 50-ganger eller større molar overskudd av umerket ATP i et 1: 1 volum / volum-forhold ved hjelp av en sluttet strømning fluorimeter (figur 4A og 4B Innfelt).
6. Monter nedgang i fluorescens intensitet observert over tid til en enkelt eksponentiell funksjon pluss en linje med konstant negativ helling å gjøre rede for fotobleking av mant gruppen (dvs. fluorescens = A ₀ .exp (k _obs .t) + (m.t + c), hvor A er amplituden _0, k er hastighetskonstanten _obs og t er tiden, se figur 4B og diskusjon). Den _kobs bestemt fra denne form er hastighetskonstanten for dissosiering av ADP (figur 1, k ₄₎ med enheter av s ^-1 (se diskusjon).

Representative Results

En økning i fluorescensintensiteten av mant gruppen er vanligvis observert ved binding av mant-merket nukleotid til en kinesin. Imidlertid er graden av en slik signalendring avhengig av den spesielle kinesin aktuelle. Derfor er det nyttig å utføre likevekts målinger for å bekrefte både tilstedeværelse og størrelse av et fluorescens-intensitetsendring før videre til kinetiske undersøkelser. Representative fluorescensspektra for mantATP og mantADP, både i løsning og i kompleks med kinesin-13, MCAK, er vist i figur 2B. Disse data markere fluorescens intensiteten øker vises av både mantATP og mantADP ved binding til MCAK. Endringen i fluorescens intensitet på binding av mant nukleotid til en kinesin brukes til å rapportere om foreningen og dissosiasjon av både ATP og ADP (del 2 og 3). I tilfelle av MCAK, er en fluorescensintensitet forskjell observert mellom mantATP.kinesin og mantADP.kinesin

Figur 3A viser den reaksjon som oppstår ved blanding mantATP med nukleotid-fri kinesin. Representative data som illustrerer økningen i fluorescensintensiteten som oppstår ved binding av mantATP til kinesin-13, er MCAK vist i figur 3B. Data av den type som er vist i figur 3B er samlet på en rekke mantATP konsentrasjoner. Et plott av hastighetskonstantene _(kobs) bestemmes i forhold til mantATP konsentrasjonen er vist i figur 3C. Montering disse dataene til en lineær funksjon (dvs. k _obs = k ₁ [mantATP] + k _-1) kan deconvolution av hastighetskonstantene som bidrar til k _obs (trinn 2.8). Derfor, slik at fastsettelse av både foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanten for mantATP (Figur 1, k ₁ og k -1 henholdsvis).

Figur 4A viser den reaksjon som oppstår ved blanding mantADP.kinesin med et overskudd av umerket ATP. Dataene i Figur 4B viser fluorescens-intensiteten reduksjon observert for mantADP ved dissosiasjon fra kinesin-13, MCAK. Ved å montere disse dataene til en eksponentiell funksjon (trinn 3.6) hastighetskonstanten for dissosiasjon av mantADP bestemmes direkte.

Figur 2. Nukleotider merket med Fluoroforen methylanthraniloyl (mant) brukes til å isolere enkelte trinnene i ATP omsetning syklus. (A) struktur mantATP som viser posisjonen av mant fluoroforen konjugert til enten den 2 'eller 3' stilling på ribose. (B) Normalisert fluorescensspektra for mantATP og mantADP i løsning (maxp) og en mantATPd mantADP i komplekse med kinesin MCAK (mATP + MCAK og mADP + MCAK). Den mantATP spektra er normalisert til fluorescens ved maks for mantATP i løsning og mantADP spektra er normalisert til fluorescens ved _maks for mantADP i løsning. Den spektra av mant nukleotider blandet med MCAK oppsamles ved 1 min etter-blande. Konsentrasjonen av reagenser og fluorimeter innstillinger som beskrevet i protokollen trinn 1.1 og 1.2.

Figur 3. Måling av foreningen hastighetskonstanten av mantATP. (A) Skjematisk viser den reaksjon som finner sted etter-blande ved sluttet strømning: mantATP (mATP) binder seg til nukleotid-fri kinesin. Fluorescens-intensiteten av mant gruppen øker ved binding til proteinet. (B) Fluorescens signalendring (sort) observert ved blanding mantATP (25 M) med MCAK (5 M nucleotide-fri,). Denne informasjonen er passe (rød stiplet) til en enkelt eksponentiell funksjon pluss en linje med konstant negativ helling, som står for fotobleking av mant fluoroforen (se diskusjon). Innfelt: Innholdet i sprøytene før blanding på stoppet-flow fluorimeter. (C) hastighetskonstanter _(kobs) beregnet for omsetningen av mantATP med nukleotid-fri MCAK plottet mot konsentrasjonen av mantATP. Denne tomten vil ha en lineær regionen med gradient være foreningen hastighetskonstanten (Figur 1, k ₁₎ med enheter av M ^-1 s ^-1 og y-aksen er dissosiasjon hastighetskonstanten (Figur 1, k _-1) med enheter av s ^-1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

. Figur 4. Måling av dissosiasjon hastighetskonstanten for mantADP (A) Skjematisk viser den reaksjon som finner sted etter-blande ved sluttet strømning: kinesin forhåndslastet med mantADP er fortynnet i et overskudd av umerket ATP. Dissosieres mantADP er erstattet av umerket ATP, og forhindrer derved tilbake reaksjonen av mantADP krets (se diskusjon). Fluorescens-intensiteten av mant gruppen reduseres ved dissosiasjon fra proteinet. (B) Fluorescens reduksjon observert ved dissosiasjon av mantADP fra kinesin MCAK. Fluorescens signal (svart) er passe (rød stiplet) til en enkelt eksponentiell pluss en linje med konstant negativ helling å gjøre rede for fotobleking av mant gruppen (se diskusjon). Hastighetskonstanten bestemmes er hastighetskonstanten for dissosiasjon av mantADP (Figur 1, k_4). Innfelt:. Innholdet i sprøytene før det blandes på en stoppet-flow fluorimeter Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Her presenterer vi protokoller for observasjon og analyse av kinetikken av overganger mellom nucleotide statene for en kinesin. Disse protokoller utnytte den raske blandemetoden sluttet strømning i forbindelse med fluorescensmerkede nukleotider. Fremgangsmåter av denne type har vært brukt i stor utstrekning for å studere nukleotid-bindende og dissosiasjon for en rekke kinesins ^9-11,13-16. Metodene som beskrives ikke tillater observasjon av fosfat frigjøring (Figur 1, trinn 3). Imidlertid kan stoppes-strømnings fluorescens brukes til å observere denne overgang ved hjelp av en fosfatføle protein til par fremstilling av fosfat til et fluorescens-intensitet endring ^17. Metodene som presenteres bruk nukleotider merket med liten fluoroforen methylanthraniloyl (mant), som generelt utviser en økning i fluorescensintensiteten når bundet til protein. Videre mant fluorofor, når konjugert til enten den 2 'eller 3' posisjon på ribose, har ofte liten eller ingen effekt på binding, dissosiasjon eller hydrolyse av nukleotid ^9-12. Mant-merkede nukleotider er lett tilgjengelig fra kommersielle kilder (se liste over materialer) og er tilgjengelig som en blanding av 2 'og 3' konjugat som de raskt re-likevekts når renset til en enkelt isomer ^8.. Mant-merkede nukleotider er utmerkede reporter molekyler ved hvilken kinetikken av nukleotid-bindende og dissosiasjon kan observeres.

Bruken av fluorescensmerkede nukleotider betyr at lest ut av analysene som beskrives er et sanntids endring i fluorescens-intensitet. Dette gjør disse assays ideelle for-sluttet strømning fluorescens, noe som tillater hurtig blanding av reagenser og sanntids observasjon av endringer i fluorescens i forbindelse med den etterfølgende reaksjon. Kombinasjonen av-sluttet strømning som blandeteknikk og fluorescens som metode for påvisning gir et system som er relativt prøven efkelig. For eksempel, for å tilegne seg de data som vises i figur 3C krever 0,8 - 1,0 mg renset kinesin-13, MCAK, og å tilegne seg data vist i Figur 4B krever ~ 0,3 mg av renset kinesin-13, MCAK. En ulempe med bruken av mant som en fluorofor, er at det er utsatt for fotobleking. Dette kan observeres i isolasjon fra kinesin reaksjonskinetikk ved å blande en oppløsning av mant-merket nukleotid med reaksjonsbuffer, i fravær av kinesin, i sluttet strømning. En langsom nedgang i fluorescens intensitet er observert som mant gruppen blir bleket. Over rekken av tidsrammer som benyttes i protokollen beskrevet fotobleking av mant gruppen er godt beskrevet av en lineær funksjon. Derfor er en enkel måte å korrigere data for fotobleking for å passe til en eksponential-funksjon med en grunnlinje som er beskrevet av en lineær funksjon (det vil si, mt + c) i stedet for den mer vanlige flat grunnlinje, som er beskrevet av en enkelt parameter.

mantATP bindende

Ved måling av hastighetskonstantene for assosiasjon og dissosiasjon av mantATP (§ 2) den ADP, som forblir forbundet med kinesin nukleotid-bindende området i fravær av mikrotubuli, må fjernes. Dette gjør mantATP assosiasjon og dissosiasjon (figur 1, trinn 1) å bli observert i isolasjon fra ADP dissosiasjon. For å oppnå dette på kinesin inkuberes med minst en 50-gangers overskudd av EDTA i løpet av nukleotid-bindingsseter (trinn 2.1). Den EDTA sequesters Mg ^{2 +} ioner forårsaker Mg ^{2 +} for å dissosiere fra nukleotid-bindende lomme, noe som resulterer i frigjøring av ^{nukleotid-11.} Derfor, når du utfører trinn 02.01 til 02.03, er det viktig å bruke en buffer fri for Mg ^{2 +.} Nucleotide frie kinesin protein er buffer utveksles for å skille det fra både gratis nucleotide og fra EDTA. For å oppnå denne separasjon, en engangs gravitetssystem gel filtreringskolonnen er tilstrekkelig, og er enkel og rask å bruke (se liste over materialer). Samspillet av mantATP med nucleotide gratis kinesin er utført ved en rekke mantATP konsentrasjoner (trinn 2.4) for å aktivere deconvolution av foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanter (trinn 2.8). Teorien bak forsøk av denne type er godt beskrevet i referanse 18. Ved gjennomføring av disse forsøk man begynner med den laveste konsentrasjon av mantATP. Dette fjerner behovet for vasketrinn mellom forskjellige konsentrasjoner. Det vil sannsynligvis være nødvendig å justere følsomheten av-sluttet strømnings fluorimeter som mantATP konsentrasjonen økes. Den mantATP konsentrasjon må alltid være i det minste 5-ganger overskudd i forhold til konsentrasjonen av kinesin nukleotid-bindingsseter for å opprettholde pseudo første ordens forhold. Imidlertid, som konsentrasjonen av mantATP økes, signalendring kan bli overbelastet som brøkdel av nukleotid som binder seg til kinesin avtar. Therefore, er konsentrasjonen av kinesin også økt etter hver ny konsentrasjon av mantATP slik at konsentrasjonen av mantATP er aldri større enn 10-ganger molart overskudd i løpet av nukleotid-bindingsseter (trinn 2.6).

mantADP Dissosiasjon

Selv foreningen og dissosiasjon hastighetskonstanter for mantADP kan bestemmes ved den samme fremgangsmåten beskrevet for mantATP (seksjon 2). Dissosiasjon av ADP fra en kinesin kan observeres direkte ved forbelastning av nukleotid-bindingssete med mantADP (trinn 3.1 til 3.3) Den mantADP.kinesin kompleks blir deretter blandet med et overskudd av umerket ATP (trinn 3.5). Det overskytende umerkede ATP hindrer ny binding av mantADP til kinesin og dermed gjør at dissosiasjon reaksjon (Figur 1, k ₄₎ å bli observert i isolasjon fra foreningen av mantADP. I denne analysen er konsentrasjonen av umerket ATP må være minst en 50-ganger molart overskudd av nucleotide bindingssteder. Teorien bak denne analysen er godt beskrevet i referanse 18. Denne direkte fremgangsmåte gir en mer nøyaktig verdi for hastighetskonstanten for dissosiering enn ekstrapolering til y-aksen er beskrevet i trinn 2.8.

Inkludering av mikrotubuli

Metodene som beskrives kan også benyttes for å bestemme kinetikken for nukleotid-bindende og dissosiasjon i nærvær av mikrotubuli. Mikrotubuli blir introdusert til nukleotid inneholdende sprøyten før blanding i sluttet strømning: den nedre sprøyten i figur 3B og 4B (Insets). I denne konfigurasjon vil kinesin møte nukleotid samtidig som den oppfyller mikrotubuli. Stabiliserte mikrotubuli benyttes, hvor levetiden av tubulin polymeren er utvidet ved bruk av enten et stabiliserende kjemikalie, slik som taxol, eller et nonhydrolysable GTP analog, slik som guanosin-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, se liste over materialer). Det er mulig å bruke to sykluser av tubulin polymerisering med GMPCPP å foreta mikrotubuli som kan lagres i mange måneder i flytende nitrogen ^9,19. Bruken av pre-fremstilt mikrotubuli i vesentlig grad reduserer de praktiske vanskeligheter med å utføre slike analyser. For å inkludere mikrotubuli i assayene, er det viktig å benytte en reaksjonsbuffer egnet for mikrotubuli stabilitet. Bufferen av valget er RØR basert, med den mest brukte buffer som inneholder 80 mm rør pH 6,9, 1 mM _MgCl2 og 1 mM EGTA (kjent som BRB80) ^20,21.

Metodene som beskrives er ikke begrenset til bruk med kinesins, men kan tilpasses og brukes på en hvilken som helst nukleotid-bindende protein. For eksempel, har tilsvarende metoder blitt anvendt til ATP omsetning syklus av medlemmer av familien av myosin molekylære motorer ^12,22 og bruk av mant-merket guanosine nukleotider lenger strekkerfremgangsmåter av denne type, for å hydrolysere proteiner GTP ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate	Jena Biosciences	# NU-202	mantATP
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate	Jena Biosciences	# NU-201	mantADP
Mg-ATP	Roche	# 10519979001	The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP120-500	0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.
Dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015	1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.
NAP-5 column	GE Healthcare	# 17-0853	G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column
GMPCPP	Jena Biosciences	# NU-405	nonhydrolysable analogue of GTP
Stopped-flow fluorimeter	Applied Photophysics	SX20	A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored.