Summary
وتتميز Kinesins بواسطة التفاعل تعتمد على النوكليوتيدات مع ميكروتثبول: دورة من دوران ATP بالإضافة إلى دورة التفاعل أنيبيب. هنا، نحن تصف بروتوكولات لتحليل حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين باستخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى ومضان توقف تدفق.
Abstract
الفصيلة كينيسين من البروتينات المرتبطة أنيبيب محرك تشترك مجال السيارات المميزة التي تتحلمأ كل من ATP ويربط الأنابيب الدقيقة. عرض Kinesins الخلافات عبر الفصيلة سواء في دوران ATP والتفاعل أنيبيب. هذه الاختلافات خياط kinesins محددة لمختلف المهام مثل نقل البضائع، أنيبيب انزلاق، أنيبيب التحلل والاستقرار أنيبيب. لفهم آلية عمل لكينيسين من المهم أن نفهم كيف يقترن دورة الكيميائية ATP دوران لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب. لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين، نهج واحد هو استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتصور الخطوات الفردية في الدورة. تحديد حركية كل انتقال النوكليوتيدات في دورة دوران ATP يسمح الحد من معدل خطوة أو خطوات لدورة كاملة لتحديدها. لكينيسين، فمن المهم أن نعرف الخطوة معدل الحد، فيغياب الأنابيب الدقيقة، وهذه الخطوة تتسارع بشكل عام عدة آلاف أضعاف عندما يتفاعل مع كينيسين الأنابيب الدقيقة. دورة في غياب الأنابيب الدقيقة ثم يتم مقارنة ذلك بحضور الأنابيب الدقيقة لنفهم تماما ATP دورة دوران لكينيسين ل. حركية التحولات النوكليوتيدات الفردية عادة ما تكون سريعة جدا لمراقبة عن طريق خلط المواد المتفاعلة يدويا، وخصوصا في وجود الأنابيب الدقيقة. جهاز الخلط السريع، مثل مقياس التألق توقف تدفق، والذي يسمح حركية التي يتعين مراعاتها في فترات زمنية أقل قدر من أجزاء قليلة من الثانية، ويمكن استخدامها لرصد هذه التحولات. هنا، نحن تصف البروتوكولات التي تستخدم في خلط السريع من الكواشف التي توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى لتشريح دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.
Introduction
وkinesins هي الفصيلة من البروتينات التي تتميز مجال السيارات حفظا للغاية 1. يتفاعل المجال كينيسين المحرك مع ميكروتثبول بطريقة تعتمد على النوكليوتيدات. أعضاء الأسرة كينيسين عرض مجموعة من الوظائف من translocating kinesins التي تحمل البضائع بطريقة موجهة على طول الأنابيب الدقيقة، لkinesins ملزم نهاية غير translocating أنيبيب، التي تنظم ديناميات أنيبيب 2،3.
Kinesins استخدام دوران adensosine-5'-ثلاثي الفوسفات (ATP) لتنظيم تفاعلها مع أنيبيب الهيكل الخلوي 4-6. التشكل المجال كينيسين المحرك وبالتالي لها تقارب للأنيبيب يعتمد على الدولة النوكليوتيدات لها: ATP، ADP، ADP.Pi أو النوكليوتيدات لا يمكن ربط (الشكل 1). لفهم الآلية الجزيئية لكينيسين، مطلوب فهم العلاقة بين دوران ATP والتفاعل أنيبيب. وrefore، هدفا رئيسيا في مجال كينيسين هو لوصف الخصائص الفنية للدول النوكليوتيدات مختلفة وحركية التحولات بين لهم على حد سواء في وجود وغياب الأنابيب الدقيقة.
يتكون الشكل 1. أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين لكينيسين من أربع ولايات المحتملة: (Φ) خالية من النوكليوتيدات، ATP محددة، ADP.P ط -bound ومتجهة الى ADP ويتميز كل من التحولات الأربعة إلى الأمام و. متخلف ثابت معدل (ك س و ك -x على التوالي).
لفهم كيفية يقترن دورة الكيميائي للدوران ATP لدورة ميكانيكية التفاعل أنيبيب، لا بد من تحديد أي خطوة في دورة دوران ATP هو معدل الحد في غياب microtubules ومن ثم تحديد كيفية تغيير دورة من خلال وجود الأنابيب الدقيقة. وتتكون أبسط دورة دوران اعبي التنس المحترفين من أربع خطوات فردية المواد الكيميائية: (1) ATP ملزم لموقع فارغ (Φ يدل الموقع فارغة، أي خالية من النوكليوتيدات كينيسين). (2) الانقسام ATP. (3) التفكك الفوسفات و (4) التفكك ADP (الشكل 1). في خطوة تحد من معدل تحدد معدل ثابت للدوران دورة كاملة للاعبي التنس المحترفين. لذلك، لتحديد الخطوة هو الحد من معدل كل من التحولات الفردية يجب قياس ومقارنة مع معدل ثابت لدورة كاملة. أساليب لقياس لا توصف هنا ثابت معدل دوران ATP دورة العام لكن يمكن العثور عليها في إشارة 7. هنا، نحن تصف الأساليب التي يمكن من خلالها تحديد الثوابت معدل للخطوات الكيميائية الفردية. هناك عدد من الطرق المتاحة لدراسة التحولات الفردية في دورة دوران البروتين النوكليوتيدات hydrolyzing. الأساليب المقدمة هنا تأخذ الميزه(ه) من خصائص النيوكليوتيدات المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore، يشار اليها عادة باسم MANT، التي تعرض تغير في كثافة مضان عليها ملزمة لبروتين 8. يتم استخدام مجموعة MANT لأن حجمه صغير يعني، عندما يقترن إلى الريبوز (الشكل 2A)، ولها عموما تأثير ضئيل أو لا على حركية النوكليوتيدات ملزمة أو التحلل 9-12. هنا، نقدم بروتوكولات واصفا استخدام النيوكليوتيدات المسمى MANT، بالتزامن مع مضان توقف تدفق، للسماح مراقبة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في دورة دوران اعبي التنس المحترفين من كينيسين.
Protocol
1. تحديد من شدة الإسفار تغيير على تجليد مانت المسمى النوكليوتيدات.
- إضافة 1 ميكرومتر المسمى MANT النوكليوتيدات إلى 1 ميكرومتر كينيسين (تركيزات النهائي) في وجود مخزن مؤقت رد الفعل المناسب. وعادة ما تستخدم عازلة يفيد النمو والاستقرار أنيبيب (انظر المناقشة). يحتوي عازلة تستخدم عادة 80MM ببيرازين مكرر-2-ethanesulfonic حمض (أنابيب) pH6.9، 1MM MgCl 2 و 1MM جلايكول الإثيلين مكرر-2-aminoether tetraacetic حمض (EGTA).
ملاحظة: تركيز كينيسين ورد في جميع البروتوكولات يشير إلى تركيز النوكليوتيدات ملزمة المواقع (أي المجالات الحركية). توجد kinesins مختلفة كما أحادية، dimers أو tetramers وهكذا يمكن أن تحتوي على أكثر من موقع واحد ملزم النوكليوتيدات في الجزيء. - بعد فترة الحضانة (1-3 دقيقة) وباستخدام مقياس التألق القياسية، وقياس طيف الانبعاث للمجمع كينيسين النوكليوتيدات المسمى MANT. استخدام الطول الموجي 365nm من الإثارة ومقياس انبعاث الضوء 400-500 نانومتر بزيادات 1nm.
- جعل حل 1MM النوكليوتيدات MANT المسمى في نفس رد فعل العازلة المستخدمة في الخطوة 1.1.
- قياس طيف الانبعاث للعينة الوحيدة MANT النوكليوتيدات، كما هو موضح سابقا (انظر الخطوة 1.2).
- تطبيع الأطياف إلى إشارة في الطول الموجي للكثافة مضان الذروة من الطيف من النوكليوتيدات MANT في الحل (أي بدون كينيسين) بقسمة من خلال هذه القيمة.
- رسم أطياف تطبيع (على سبيل المثال، الشكل 2B) لمراقبة كثافة مضان الخلافات بين mantATP ملزمة و / أو متجهة الى mantADP كينيسين وMANT النوكليوتيدات في الحل.
2. القياس من الثوابت النقابية والتفكك السعر لmantATP
- في حل ما يصل إلى 20 ميكرومتر كينيسين (انظر المناقشة) في أي المغنيسيوم المناسب 2+ عازلة خالية (على سبيل المثال، 80MM أنابيب pH6.9، 1MM EGTA، 0.1٪ Tween20)، إضافة 1ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (التركيز النهائي) (EDTA) و1 ملم (التركيز النهائي) dithiothreitol (DTT). ملاحظة: من المستحسن إضافة Tween20 إلى المخزن المؤقت لأنه يقلل / يمنع فقدان البروتين كينيسين على عمود يستخدم لتبادل عازلة (خطوات 2.3 و 3.3)
- احتضان الحل عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- النوكليوتيدات منفصلة حرة وEDTA من كينيسين باستخدام عمود تدفق الجاذبية G-25 باستخدام Sephadex هلام الترشيح وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر قائمة المواد).
- تتوازن مع العمود لا يقل عن 3 مجلدات عمود من المغنيسيوم 2+ عازلة خالية المناسب (انظر الخطوة 2.1). تحميل حل كينيسين تحتوي على العمود. إعداد أنبوب جمع بإضافة حجم مناسب من محلول كلوريد المغنيسيوم 100MM إلى أنبوب فارغ، مثل أن تركيز النهائي من كلوريد المغنيسيوم هو 1 ملم بعد جمعها من الحل كينيسين. بالإضافة الفورية من كلوريد المغنيسيوم يساعد stabiliحد ذاتها كينيسين خالية من النوكليوتيدات.
- أزل كينيسين باستخدام المغنيسيوم 2+ عازلة خالية المناسب. Kinesins غير مستقرة عندما خالية من النوكليوتيدات ولذلك فمن المهم العمل بسرعة. تخزين كينيسين خالية من النوكليوتيدات على الجليد واستخدام في غضون 1-2 ساعة.
- أثناء أو قبل إعداد خالية من النوكليوتيدات كينيسين، وإعداد سلسلة تركيز mantATP في نفس رد فعل العازلة باعتبارها الحل النهائي خالية من النوكليوتيدات كينيسين. تحديد مجموعة من تركيزات mantATP المطلوبة وفقا لتركيز متاح من كينيسين مع سلسلة نموذجية تتراوح 0،1 حتي 50 ميكرومتر (انظر الخطوة 2.5 والمناقشة).
- إعداد سلسلة تركيز خالية من النوكليوتيدات كينيسين. لكل تركيز mantATP (الخطوة 2.4)، ينبغي إعداد تركيز خالية من النوكليوتيدات كينيسين بحيث النوكليوتيدات المسمى MANT هي في 5 إلى 10 أضعاف الزيادة الضرس عبر مواقع الربط كينيسين النوكليوتيدات.
- تعيين الطول الموجي الإثارة على فلو توقفتث مقياس التألق إلى 365 نانومتر، وجمع ينبعث الضوء في> 400 نانومتر باستخدام فلتر تمريرة طويلة.
- بدءا من أدنى تركيز mantATP، خلط mantATP مع التركيز المناسب من خالية من النوكليوتيدات كينيسين في نسبة 1: 1 ت / ت باستخدام مقياس التألق توقف تدفق (الشكل 3A و 3B أقحم). ملاحظة: يتم تخفيفه المواد المتفاعلة بنسبة 50٪ عند الخلط. الحفاظ على تركيز علما النوكليوتيدات كلا قبل وبعد الخلط (أي 3.0 / 1.5 ميكرومتر) لتفادي الخلط.
- تناسب التغير في كثافة مضان قياس في كل تركيز mantATP إلى الدالة الأسية بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (أي الإسفار = A 0 .exp (ك. تي OBS) + (م. ر + ج)، حيث A 0 هو السعة، ك OBS هو ثابت معدل وt غير الوقت، انظر الشكل 3B والمناقشة). من هذه النوبات تحديدمعدل ثابت (ك OBS) في كل تركيز mantATP. كل ك OBS هو التفاف على وجود ارتباط والتفكك معدل ثابت (الشكل 1، ك 1 و ك -1).
- Deconvolve الجمعية ومعدل التفكك الثوابت التي كتبها ك OBS بالتآمر ضد تركيز mantATP (على سبيل المثال، الشكل 3C). تناسب هذه البيانات لدالة خطية (أي OBS ك = ك 1 [mantATP] + ك -1) للحصول على التدرج والمحور ص اعتراض. يمثل التدرج ثابت معدل للجمعية mantATP (الشكل 1، ك 1) مع وحدات M -1 ق -1. يمثل اعتراض ثابت معدل التفكك (الشكل 1، ك -1) مع وحدات من ق -1 (انظر المناقشة). ملاحظة: هذا النهج يمكن أن تطبق أيضا لتحديد ارتباط ADP والتفككالثوابت معدل (الشكل 1، ك -4 وك 4) باستخدام mantADP كما النوكليوتيدات.
3. القياس من التفكك معدل ثابت للmantADP
- إلى حل من 2 ميكرومتر كينيسين في منطقة عازلة رد فعل مناسب (على سبيل المثال، 80 ملم أنابيب pH6.9، 1MM MgCl 2، 1MM EGTA، 0.1٪ Tween20)، إضافة 50 ميكرومتر mantADP (التركيز النهائي).
- احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- mantADP إزالة الزائدة وغيرها من النوكليوتيدات مجانا عن طريق تبادل عازلة كينيسين في المخزن المؤقت رد فعل المختار باستخدام عمود باستخدام Sephadex G-25 (انظر قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ينبغي الآن تحميلها المجال كينيسين المحرك مع mantADP.
- تعيين الطول الموجي الإثارة على مقياس التألق توقف تدفق إلى 365 نانومتر، وجمع ينبعث الضوء في> 400 نانومتر باستخدام فلتر تمريرة طويلة.
- مزيج مجمع mantADP.kinesin (~ 1μM) مع 50 أضعاف أو أكثر مولاص تتجاوز الخالي من الملصقات ATP في نسبة 1: 1 ت / ت باستخدام مقياس التألق توقف تدفق (الشكل 4A و 4B أقحم).
- تناسب انخفاض في كثافة مضان لوحظ مع مرور الوقت إلى الدالة الأسية واحدة بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (أي الإسفار = A 0 .exp (ك. تي OBS) + (+ m.t ج)، حيث A 0 هو السعة، ك OBS هو ثابت معدل و t هو الوقت، انظر الشكل 4B و المناقشة). وOBS ك تحديد من يصلح هذا هو ثابت سرعة تفكك ADP (الشكل 1، ك 4) مع وحدات من ق -1 (انظر المناقشة).
Representative Results
وعادة ما يلاحظ زيادة في كثافة مضان من مجموعة MANT على ربط المسمى MANT النوكليوتيدات إلى كينيسين. ومع ذلك، فإن ضخامة مثل هذا التغيير إشارة يعتمد على كينيسين معين في السؤال. ولذلك، فمن المفيد إجراء قياسات التوازن لتأكيد كلا وجود وحجم التغيير كثافة مضان قبل التقدم لفحوصات الحركية. أطياف مضان التمثيلي للmantATP وmantADP، سواء في حل وفي مجمع مع كينيسين-13، MCAK ترد، في الشكل 2B. تبرز هذه المعطيات الزيادة كثافة مضان عرض من قبل كل من mantATP وmantADP عليها ملزمة لMCAK. ويستخدم التغير في كثافة مضان على ربط MANT النوكليوتيدات إلى كينيسين أن يقدم تقريرا عن الجمعيات والتفكك كل من ATP و ADP (الأقسام 2 و 3). في حالة MCAK، لوحظ اختلاف كثافة مضان بين mantATP.kinesin وmantADP.kinesin الشكل 3A يصور رد الفعل الذي يحدث عند خلط mantATP مع خالية من النوكليوتيدات كينيسين. بيانات تمثيلية توضح الزيادة في كثافة مضان الذي يحدث على ربط mantATP إلى كينيسين-13، هو مبين في الشكل 3B MCAK. بيانات من النوع هو موضح في الشكل 3B يتم جمعها في مجموعة من تركيزات mantATP. ويرد مؤامرة من الثوابت معدل (ك OBS) تحديد مقابل تركيز mantATP في الشكل 3C. تركيب هذه البيانات لدالة خطية (أي OBS ك = ك 1 [mantATP] + ك -1) يسمح deconvolution من الثوابت التي تساهم في معدل ك OBS (الخطوة 2.8). وبالتالي، تمكن من تحديد كل من الجمعيات وثابت معدل التفكك لmantATP (الشكل 1، ك 1 و ك الشكل 4A يصور رد الفعل الذي يحدث عند خلط mantADP.kinesin مع وجود فائض من ATP الخالي من الملصقات. تظهر البيانات في الشكل 4B انخفاض كثافة مضان لوحظ mantADP على التفكك من كينيسين-13، MCAK. عن طريق تركيب هذه البيانات إلى الدالة الأسية (الخطوة 3.6) إلى ثابت سرعة تفكك mantADP يتحدد مباشرة. gether.within الصفحات = "دائما"> 
وتستخدم الرقم 2. النيوكليوتيدات المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore (MANT) لعزل الخطوات الفردية في دورة دوران اعبي التنس المحترفين. (A) هيكل mantATP تبين الموقف من fluorophore MANT مترافق إما إلى 2 "أو 3" موقف بشأن الريبوز. (B) أطياف مضان تطبيع للmantATP وmantADP في الحل (mAXP) وmantATP ود mantADP في مجمع مع كينيسين MCAK (mATP + MCAK وmADP + MCAK). أطياف mantATP لا تطبيع للمضان في أقصى لmantATP في الحل والأطياف mantADP وتطبيع مضان في أقصى لmantADP في الحل. يتم جمع أطياف من النيوكليوتيدات MANT مختلطة مع MCAK في 1 دقيقة آخر الاختلاط. تركيز الكواشف وإعدادات مقياس التألق وكما هو موضح في الخطوات من بروتوكول 1.1 و 1.2. 
الرقم 3. قياس ثابت معدل رابطة mantATP. (A) تخطيطي تصور رد الفعل الذي يأخذ مكان آخر بواسطة خلط توقف تدفق: mantATP (mATP) بربط خالية من النوكليوتيدات كينيسين. لاحظت كثافة مضان من الزيادات على مجموعة MANT ملزمة للبروتين. (B) تغيير إشارة الإسفار (أسود) عند خلط mantATP (25 M) مع MCAK (5 M نو الحرة cleotide،). هذه البيانات يصلح (أحمر متقطع) إلى الدالة الأسية واحدة بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر، الذي يمثل ل photobleaching من fluorophore MANT (انظر المناقشة) أقحم: محتويات الحقن قبل الاختلاط على مقياس التألق توقف تدفق. (C) الثوابت معدل (ك OBS) لتحديد رد فعل mantATP مع خالية من النوكليوتيدات MCAK تآمر ضد تركيز mantATP. وهذه المؤامرة لديها المنطقة الخطية مع التدرج كونها ثابت معدل تكوين الجمعيات (الشكل 1، ك 1) مع وحدات من M -1 ق -1 والتقاطع y يجري معدل ثابت التفكك (الشكل 1، ك -1) مع وحدات من ق -1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
. الشكل 4. قياس ثابت التفكك لmantADP معدل (A) تخطيطي تصور رد الفعل الذي يأخذ مكان آخر بواسطة خلط توقف تدفق: يتم تخفيف كينيسين مسبقة مع mantADP إلى وجود فائض من توضيحها ATP. يتم استبدال النأي mantADP بواسطة الخالي من الملصقات ATP، وبالتالي منع رد الفعل الخلفي للجمعية mantADP (انظر المناقشة). كثافة مضان من مجموعة MANT تنخفض على التفكك من البروتين. انخفاض (B) الإسفار وحظ على تفكك mantADP من كينيسين MCAK. إشارة مضان (أسود) يصلح (أحمر متقطع) إلى واحد الأسي بالإضافة إلى خط الانحدار السلبي المستمر لحساب ل photobleaching المجموعة MANT (انظر المناقشة). ثابت معدل العزم هو ثابت سرعة تفكك mantADP (الشكل 1، ك4) أقحم:. محتويات الحقن قبل الاختلاط على مقياس التألق توقف تدفق يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا، نقدم بروتوكولات للمراقبة وتحليل حركية التحولات بين الدول النوكليوتيدات لكينيسين. هذه البروتوكولات السريع الاستفادة من طريقة خلط توقف تدفق بالتزامن مع النيوكليوتيدات fluorescently المسمى. وقد استخدمت أساليب من هذا النوع على نطاق واسع لدراسة النوكليوتيدات ملزمة والتفكك لمجموعة متنوعة من kinesins 9-11،13-16. الأساليب المذكورة لا تسمح الملاحظة الإفراج الفوسفات (الشكل 1، الخطوة 3). ومع ذلك، مضان توقف تدفق يمكن استخدامها لمراقبة هذا التحول باستخدام الاستشعار عن البروتين الفوسفات لزوجين إنتاج الفوسفات إلى كثافة مضان التغيير 17. أساليب عرض النيوكليوتيدات استخدام المسمى مع methylanthraniloyl fluorophore صغيرة (MANT)، والتي تظهر عادة زيادة في كثافة مضان عندما بد أن البروتين. علاوة على ذلك، fluorophore MANT، عندما مترافق إما موقف 2 "أو 3" على صibose، وغالبا ما له تأثير ضئيل أو لا على ملزم، التفكك أو التحلل من النوكليوتيدات 9-12. هي النيوكليوتيدات MANT المسمى متاحة بسهولة من المصادر التجارية (انظر قائمة المواد) ويتم توفيرها في شكل خلائط من 2 "و 3" المترافقة لأنها بسرعة إعادة تتوازن عند تخصيبه لايزومير واحد 8. النيوكليوتيدات المسمى MANT تجعل جزيئات مراسل الممتازة التي يمكن ملاحظتها حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك.
استخدام النيوكليوتيدات fluorescently المسمى يعني أن قراءة من المقايسات وصفها هو تغيير في الوقت الحقيقي في كثافة مضان. وهذا يجعل هذه المقايسات مثالية لمضان توقف تدفق، والذي يسمح خلط السريع الكواشف ومراقبة الوقت الحقيقي من التغيرات في مضان المرتبطة رد فعل لاحق. مزيج من توقف تدفق وتقنية خلط ومضان كأسلوب للكشف ينتج النظام الذي هو EF عينة نسبيا كافية من. على سبيل المثال، للحصول على البيانات هو مبين في الشكل 3C يتطلب 0،8-1،0 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK، والحصول على البيانات هو مبين في الشكل 4B يتطلب ~ 0.3 ملغ من تنقية كينيسين-13، MCAK. عيب واحد من استخدام MANT باعتباره fluorophore هو أنه عرضة للphotobleaching من. هذا يمكن ملاحظتها في العزلة من كينيسين حركية التفاعل عن طريق خلط محلول المسمى MANT النوكليوتيدات مع العازلة رد الفعل، في غياب كينيسين، في التدفق توقف. لوحظ انخفاض بطيء في كثافة مضان كما تصبح مجموعة MANT ابيض. على مجموعة من الجداول الزمنية المستخدمة في البروتوكولات المذكورة photobleaching من المجموعة MANT يوصف جيدا بواسطة دالة خطية. لذلك، طريقة بسيطة لتصحيح البيانات ل photobleaching هي لتناسب إلى الدالة الأسية مع خط الأساس وصفها دالة خطية (أي طن متري + ج) بدلا من خط الأساس مسطح أكثر شيوعا، التي وصفها معلمة واحدة.
الحمار = "jove_content"> mantATP ملزمة
عند قياس الثوابت معدل تكوين الجمعيات والتفكك من mantATP (القسم 2) ADP، والذي لا يزال يرتبط مع موقع النوكليوتيدات ملزم كينيسين في غياب الأنابيب الدقيقة، ويجب إزالتها. وهذا يسمح جمعية mantATP والتفكك (الشكل 1، الخطوة 1) التي يتعين مراعاتها في معزل عن التفكك ADP. لتحقيق وحضنت هذا كينيسين مع ما لا يقل عن 50 أضعاف الفائض من EDTA على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.1). وEDTA تعزل المغنيسيوم 2+ تسبب أيونات المغنيسيوم 2+ إلى فصل من جيب ملزمة النوكليوتيدات، مما يؤدي الى الافراج عن 11 النوكليوتيدات. ولذلك، عند تنفيذ الخطوات 2،1-2،3، من المهم جدا لاستخدام منطقة عازلة خالية من المغنيسيوم 2+. البروتين كينيسين خالية من النوكليوتيدات هو تبادل عازلة لفصلها كلا من النوكليوتيدات الحرة ومن EDTA. لتحقيق هذا الفصل، وهو المتاح خطورة تدفق جنرال الكتريكالعمود لتر الترشيح كافية وبسيط وسريع لاستخدام (انظر قائمة المواد). ويتم تفاعل مع mantATP النوكليوتيدات كينيسين مجانا من خلال مجموعة من تركيزات mantATP (الخطوة 2.4) لتمكين deconvolution الثوابت الجمعيات والتفكك معدل (الخطوة 2.8). النظرية وراء تجارب من هذا النوع يوصف أيضا في إشارة 18. في تنفيذ هذه التجارب واحد يبدأ مع أدنى تركيز mantATP. هذا يزيل ضرورة اتخاذ خطوات غسل بين تركيزات مختلفة. فمن المرجح أن يكون ضروريا لضبط حساسية مقياس التألق توقف تدفق وتركيز mantATP يزداد. يجب أن يكون تركيز mantATP دائما ما يزيد على الأقل 5 أضعاف خلال تركيز المواقع ملزمة كينيسين النوكليوتيدات للحفاظ على الأوضاع الزائفة من الدرجة الأولى. لكن، وكما تركيز mantATP يزداد، فإن التغيير يمكن أن تصبح إشارة اغراق باعتبارها جزء من النوكليوتيدات التي تربط لكينيسين الانخفاضات. Therefoإعادة، ويزداد أيضا تركيز كينيسين لكل تركيز جديد من mantATP مثل أن تركيز mantATP أبدا أكبر من المولي يزيد 10 أضعاف على مواقع الربط النوكليوتيدات (الخطوة 2.6).
mantADP التفكك
على الرغم من أن الجمعيات ومعدل التفكك الثوابت لmantADP يمكن تحديده من خلال نفس الأسلوب وصفها لmantATP (القسم 2). تفكك ADP من كينيسين يمكن ملاحظة مباشرة من قبل تحميلها مسبقا في الموقع، النوكليوتيدات ملزمة مع mantADP (خطوات 3،1-3،3) ثم يتم خلط مجمع mantADP.kinesin مع وجود فائض من توضيحها ATP (الخطوة 3.5). والخالي من الملصقات ATP الزائد يمنع إعادة الربط من mantADP إلى كينيسين ويسمح رد الفعل التفكك (الشكل 1، ك 4) لوحظ في معزل عن رابطة mantADP بذلك. في هذا الاختبار يجب أن يكون تركيز ATP الخالي من الملصقات على الأقل فائض المولي 50 أضعاف من مجلس التوحيد الوطنىleotide مواقع الربط. النظرية وراء هذا الاختبار يوصف جيدا في إشارة 18. هذه الطريقة المباشرة يعطي قيمة أكثر دقة لمعدل التفكك المستمر من استقراء إلى المحور ص هو موضح في الخطوة 2.8.
إدراج ميكروتثبول
ويمكن أيضا أن تستخدم الأساليب المذكورة لتحديد حركية النوكليوتيدات ملزمة والتفكك في وجود الأنابيب الدقيقة. يتم إدخال الأنابيب الدقيقة لالنوكليوتيدات تحتوي على حقنة قبل الاختلاط في التدفق توقف: انخفاض حقنة في الشكل 3B و 4B (إدراجات). في هذا التكوين، فإن كينيسين تلبية النوكليوتيدات في نفس الوقت لأنها تلبي الأنابيب الدقيقة. وتستخدم الأنابيب الدقيقة استقرت، حيث تم تمديد عمر البوليمر تويولين عن طريق استخدام إما الكيميائية الاستقرار، مثل التاكسول، أو GTP التناظرية nonhydrolysable، مثل غوانوزين-5 '- [(α، β) -methyleno] ثلاثي الفوسفات (GMPCPP، انظر قائمة المواد). فمن الممكن استخدام دورتين من تويولين البلمرة مع GMPCPP لجعل الأنابيب الدقيقة التي يمكن تخزينها لعدة أشهر في 9،19 النيتروجين السائل. استخدام الأنابيب الدقيقة المعدة مسبقا يخفف كثيرا من الصعوبات العملية في أداء هذه المقايسات. لتشمل الأنابيب الدقيقة في المقايسات، فمن المهم استخدام منطقة عازلة رد فعل مناسب للاستقرار أنيبيب. المخزن المؤقت الاختيار هو أساس أنابيب، مع المخزن المؤقت الأكثر شيوعا تحتوي على 80 ملي أنابيب درجة الحموضة 6.9، 1 ملم MgCl 2 و 1 ملي EGTA (المعروف باسم BRB80) 20،21.
الأساليب المذكورة لا تقتصر على استخدامها مع kinesins، ولكن يمكن تكييفها وتطبيقها على أي بروتين ملزمة النوكليوتيدات. على سبيل المثال، تم تطبيق أساليب مشابهة لدورة دوران ATP من أعضاء الأسرة الميوسين المحركات الجزيئية 12،22 واستخدام MANT المسمى النيوكليوتيدات غوانوزين تمتد أبعدأساليب من هذا النوع إلى GTP hydrolyzing البروتينات 23،24.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل من قبل التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية مجلس البحوث (BBSRC)، والجمعية الملكية وجامعة نوتنجهام.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E.
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al.
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W.
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
