Summary
Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.
Abstract
Mikrotübül ilişkili motor proteinlerinin kinesin süperailesi hem ATP hidrolizler ve mikrotübülleri bağlayan bir karakteristik motorlu etki alanını paylaşır. Kinesinler ATP ciro ve mikrotübül etkileşim hem süperailesinin genelinde farklılıklar gösterebilir. Bu farklılıkların, kargo taşımacılığı, Mikrotubullerin sürgülü, mikrotübül depolimerizasyona ve mikrotübül stabilizasyonu gibi çeşitli fonksiyonları belirli kinesinlerin terzi. Bir kinesin'in etki mekanizmasını anlamak için ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşimin mekanik döngüsü birleştiğinde nasıl anlamak önemlidir. ATP çevirme süresi incelemek için, bir yaklaşım; çevriminde tek tek adımları görselleştirmek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılmasıdır. ATP ciro döngüsündeki her bir nükleotid geçiş kinetiklerini belirlemek tam döngüsü tespit edilmesi için oran-sınırlayıcı aşama ya da aşamalara sağlar. Bir kinesin için, içerisinde, hız kesici aşama bilmek önemlidirkinesin mikrotübüller ile etkileşime girdiğinde mikrotübül yokluğu, bu adım, genel olarak birkaç bin kat olarak hızlanır. Mikrotübüllerin yokluğunda Bu daha sonra tamamen kinesin ATP çevirme süresi anlama mikrotübül mevcudiyetinde ile karşılaştırılır. Tek tek nükleotid geçişler kinetiği genellikle elle özellikle mikrotübül varlığında, reaktifleri, gözlenmek için çok hızlıdır. Hızlı bir karıştırma cihazının, kinetik bir kaç milisaniye gibi kısa bir zaman ölçeği içinde gözlemlenen sağlayan bir durdurmalı akış florimetresi olarak, bu tür geçiş izlemek için de kullanılabilir. Burada, durdu akışı ile hızlı karıştırma reaktiflerin bir kinesin ATP çevirme süresi incelemek için, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak kullanıldığı protokolleri açıklar.
Introduction
Kinesinler yüksek oranda korunan bir motor fonksiyonun 1 ile karakterize edilen bir protein süper-familyası vardır. Kinesin motor fonksiyonun bir nükleotid bağımlı bir şekilde mikrotübül ile etkileşime girer. Kinesin aile üyeleri mikrotübül dinamiklerini 2,3 düzenleyen olmayan translocating mikrotübül son bağlayıcı kinesinlerin Mikrotübüllerin boyunca yönlendirilmiş bir şekilde yük taşımak translocating kinesinlerin, fonksiyonları bir dizi görüntüler.
Kinesinler, 4-6 iskeleti mikrotübül ile etkileşimlerini düzenleyen adensosine-5'-trifosfat (ATP) ciro kullanın. ATP, ADP ADP.Pi ya da nükleotid bağlı olabilir (Şekil 1) için mikrotübül kinesin motor fonksiyonun ve dolayısıyla afinite konformasyonu, nükleotid durumuna göre değişir. Bir kinesin'in moleküler mekanizmasını anlamak için, ATP ciro ve mikrotübül etkileşim arasındaki ilişkinin bir anlayış gereklidir.refore, kinesin alanda önemli bir amacı, farklı nükleotid durumlarının fonksiyonel özellikleri ve mikrotübüllerin varlığında ve yokluğunda her ikisinin arasındaki geçişlere kinetiklerini nitelendirilmesidir.
Bir kinesin'in için basit ATP ciro döngüsü Şekil 1. Dört olası durumlar oluşur:. Nükleotid-free (Φ) dört geçişler her bir ileri ve bir ile karakterize, ADP.P i-bağlı, ATP bağlı ve ADP-bağlı Geriye hız sabiti (k x ve sırasıyla -x k).
ATP ciro kimyasal çevrim mikrotübül etkileşim mekanik döngüsüne bağlanmış anlamak için, bir kuru microtub yokluğunda sınırlayıcı ATP ciro döngüsünde hangi aşamasını belirlemek gerekirModüller, ve sonra çevrim mikrotübül varlığı ile değiştirilmektedir biçimini belirler. En basit ATP çevirme süresi dört ayrı kimyasal adımlardan oluşur: (1) ATP boş yere bağlanabilen (Φ ve boş, yani nükleotid içermeyen kinesin temsil eder); (2) ATP bölünmesi; (3) ayrışma fosfat ve (4) ADP ayrılma (Şekil 1). Oran-sınırlayıcı aşama tamamlandıktan ATP devir döngüsü için hız sabitini belirler. Bu nedenle, tek tek geçişler her ölçülmüş ve tam devir için hız sabiti ile karşılaştırılır sınırlayıcı oran olan adım belirlemek için. Yöntem burada açıklanmayan genel ATP çevirme süresi hızı sabitini ölçmek için değil Burada referans 7'de bulunabilir, tek tek kimyasal aşamalar için oran sabitleri belirlenebilir edildiği metotları da tarif eder. Bir nükleotid hidroliz proteinin çevirme süresi bireysel geçişleri çalışma mevcut yöntemler vardır. Burada sunulan yöntemler sunar advantagflorofor ile işaretlenmiş nükleotidlerin methylanthraniloyl özelliklerinin e 8 genellikle protein bağlanması üzerine, flüoresans yoğunluğunda bir değişme sergilemekte mant, olarak adlandırılır. Küçük boyutlu riboz (Şekil 2A) ile birleştirildiğinde, genellikle nükleotid bağlayıcı ya da hidroliz 9-12 kinetikleri üzerinde çok az ya da hiçbir etkisi yoktur, anlamına gelir, çünkü MANT grubu kullanılır. Burada, bir kinesin ATP ciro döngüsünde nükleotid bağlama ve ayrışma gözlenmesine imkan vermek için durdurmalı akış floresan ile bağlantılı olarak mant-işaretlenmiş nükleotidlerin kullanımını anlatan protokolleri sunuyoruz.
Protocol
Mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine floresans yoğunluğunu değiştirmek 1. belirlenmesi.
- Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 1 uM kinesin (nihai konsantrasyonlar) için 1 uM mant-etiketli bir nükleotit ekleyin. Tipik mikrotübül büyüme ve istikrarı faydaları bir tampon (tartışma) kullanılır. Yaygın olarak kullanılan bir tampon 80 mM piperazin-bis-2-etansülfonik asit (PIPES) içeren pH6.9, 1 mM MgCI2 ve 1 mM etilen glikol-bis-2, iminoeter-tetraasetik asit (EGTA).
Not: Tüm protokolde belirtilen kinesin konsantrasyonu, nükleotid bağlama bölgeleri (örneğin, motorlu etki) konsantrasyonu anlamına gelir. Farklı kinesinler monomerler, dimerler veya tetramerler olarak bulunur ve her bir molekül için birden fazla nükleotid bağlanma bölgesini içerebilir. - Bir kuluçka dönemine (1-3 dakika) ve standart bir florimetre kullanılarak sonra, MANT-işaretlenmiş nükleotid-kinesin kompleksi için emisyon spektrumunu ölçmek. 365nm bir eksitasyon dalga boyu ve kullanmaölçmek 1nm artışlarla 400-500 nm arasında ışığı yaydığı.
- Aşama 1.1 'de kullanılan aynı reaksiyon tampon maddesi içinde 1 mM bir çözeltisi mant olarak işaretlenmiş nükleotid olun.
- Daha önce açıklandığı gibi, tek bir nükleotid, MANT numune için emisyon spektrumunu ölçülür (bakınız Aşama 1.2).
- Bu değer ile bölünerek (kinesin kullanılmadan doğrudan) çözelti içinde mant nükleotid spektrumunda tepe floresan yoğunluğunun dalga boyunda sinyaline normalize spektrumları.
- (Örneğin, Şekil 2B) mantATP-bağlanmış ve / veya çözelti içinde mantADP bağlı kinesin ve mant nükleotid arasındaki floresans yoğunluğu farkları gözlemlemek için normalize spektrumları çizilir.
MantATP için birleşme ve ayrılma oranı Katsayıların 2. Ölçüm
- -ücretsiz Tamponu 2 + herhangi bir uygun Mg en fazla 20 uM kinesin (tartışma) içindeki bir çözeltisine, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20) içinde, 1 ekleyinmM (son konsantrasyon) etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 1 mM (son konsantrasyon) ditiyotreitol (DTT). Not: azaldıkça tampon Tween®20 ilavesi tavsiye edilir / tampon değişimi için kullanılan sütun üzerinde kinesin protein kaybını önler (Adımlar 2.3 ve 3.3)
- 15 dakika boyunca 25 ° C'da, çözelti inkübe edin.
- (Malzemelerin listesine bakınız) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre bir yerçekimi akışlı, G-25 Sephadex jel filtrasyon kolonu kullanılarak kinesin ayırın ihtiva etmeyen nükleotid ve EDTA ihtiva eder.
- Uygun bir Mg +2 tamponu -ücretsiz en az 3 sütun hacmi ile sütun dengeye (Basamak 2.1). Kolona kinesin-içeren çözelti yükleyin. Magnezyum klorürün son konsantrasyonu kinesin çözeltisi toplanmasından sonra 1 mM olacak şekilde, boş tüp, 100 mM, magnezyum klorür çözeltisinin uygun bir hacmi ilave bir toplama tüpü hazırlayın. Magnezyum klorürün ilavesi anında yardımcı olur dayanıklılıknükleotid içermeyen kinesin se.
- Uygun bir Mg 2 + -ücretsiz tampon kullanarak kinesin Zehir. Hızlı çalışmak için zaman önemlidir bu yüzden nükleotid ücretsiz Kinesinler kararsızdır. Buz üzerinde nükleotid-serbest Kinezin'e saklayın ve 1-2 saat içinde kullanın.
- Sırasında ya da öncesinde nükleotid içermeyen kinesin hazırlanmasına nükleotid içermeyen kinesin nihai çözelti ile aynı tampon maddesi içinde bir reaksiyon mantATP konsantrasyon geliştirilmesidir. 0.1 ila 50 uM (adım 2.5 ve tartışmaya bakınız) arasında değişen tipik bir dizi kinesin mevcut konsantrasyonuna göre gerekli mantATP konsantrasyonlarının aralığı belirler.
- Nükleotid-serbest kinesin'in bir konsantrasyon dizi hazırlayın. MantATP her bir konsantrasyonu (2.4 adım) için, nükleotid içermeyen kinesin bir konsantrasyon, MANT-işaretlenmiş nükleotid kinesin nükleotid bağlayıcı siteler üzerinde 5-10 kat molar fazla olacak şekilde hazırlanmalıdır.
- Durdu-flo üzerinde dalgaboyu ayarlayın365 nm florimetrede w ve uzun geçişli filtre kullanılarak> 400 nm ışık yaydığı toplamak.
- Durdurulan bir akış florimetresi (Şekil 3A ve 3B Ankastre) kullanılarak 1 hacim / hacim oranı: mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlayarak, 1 nükleotid içermeyen kinesin uygun bir konsantrasyonu ile mantATP karıştırın. Not: Reaksiyona giren maddeler karıştırma üzerine% 50 oranında seyreltilir. Karışıklığı önlemek için nükleotid konsantrasyon öncesi ve sonrası karıştırma (örneğin, 3.0 / 1.5 mM) not edin.
- MANT grup, ışıkla hesaba üstel fonksiyon ayrıca sürekli olumsuz bir eğim hattına mantATP her konsantrasyonunda ölçülen floresan yoğunluğundaki değişim monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (M =. T + 0 genliği, c) k gözlenen hız sabitidir ve T,) Şekil 3B ve açıklamalara bakın zamandır. Bu krizleri bir tespitmantATP her konsantrasyonunda sabiti (k, obs) oranı. Her bir K atıl bir birleşme ve ayrılma oranı sabiti (Şekil 1, k, 1 ve k-1) olan bir evrişim.
- (Örneğin, Şekil 3C) mantATP konsantrasyonuna karşı taslak haline getirilmesi suretiyle k, atıl, birleşme ve ayrılma oranı sabitleri Deconvolve. Degrade ve y-ekseni kesişim elde etmek için doğrusal bir fonksiyonu (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) bu verileri uygun. Gradyan birimlerinin M-1 s-1 ile ilişkili mantATP (Şekil 1, k, 1) için oran sabiti temsil eder. Kesişim s-1 (tartışmaya bakınız) birimleri ile ayrılma oranı sabitesinin (Şekil 1, k-1) temsil etmektedir. Bu yaklaşım, aynı zamanda, ADP, birleşme ve ayrılma belirlemek için uygulanabilir: Notnükleotid olarak mantADP kullanılarak oran sabitleri (Şekil 1, k, k -4 4).
MantADP için ayrışma oranı 3. Sabit ölçüm
- Uygun bir reaksiyon tampon maddesi içinde 2 uM kinesin eden bir çözeltiye, (örneğin, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA,% 0.1 Tween 20), 50 uM mantADP (nihai konsantrasyon) ilave edilir.
- 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
- G-25 Sephadex kolonu kullanılarak, seçilen reaksiyon tampon maddesi içine kinesin alışverişi tamponu ile aşırı mantADP ve diğer serbest nükleotid kaldır, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzemelerin listesine bakınız). Kinesin Motor alanı şimdi mantADP yüklü olmalıdır.
- 365 nm durdu akış florimetrede dalgaboyu ayarlayın ve uzun geçişli filtre kullanılarak> 400 nm ışık yaydığı toplamak.
- 50 katı veya daha büyük olan Mola mantADP.kinesin kompleksi (~ 1 uM) karıştırındurdurulan bir akış florimetre (Şekil 4A ve 4B, Ankastre) kullanılarak 1 h / h oranında bir 1 etiketlenmemiş ATP r fazla.
- Tek bir üstel fonksiyon artı MANT grubunun ışıkla ağartma açıklamak için sürekli negatif bir eğim hattı zamanla gözlenen floresan yoğunluğundaki azalma monte (örneğin, floresan, bir 0 .exp (atıl .T k) + (m.t + = Bir 0 genliği, burada c), k gözlenen hızı sabittir ve t, zamandır,) Şekil 4B ve tartışmaya bakınız. Bu uyum tespit K atıl s-1 (tartışmaya bakınız) birimleriyle ADP (Şekil 1, k 4) ayrılması için oranı sabitidir.
Representative Results
MANT grubunun, flüoresans yoğunluğunda bir artış tipik olarak kinesin için mant olarak işaretlenmiş nükleotid bağlanması üzerine gözlenmiştir. Bununla birlikte, böyle bir sinyal değişikliğin büyüklüğü, söz konusu olan kinesin bağlıdır. Bu nedenle, bu kinetik deneyler için ilerlemeden önce bir flüoresan yoğunluğu değişim varlığını ve büyüklüğünü hem de teyit etmek için denge ölçümlerini gerçekleştirmek için yararlıdır. MantATP ve mantADP için tipik floresan spektroskopisi, ve kinesin-13, MCAK ile kompleks hem de Şekil 2B'de gösterilmiştir. Bu veriler MCAK bağlanması üzerine mantATP ve mantADP her ikisi tarafından gösterilen floresan yoğunluğu artışı vurgulamaktadır. Bir kinesin'in için mant nükleotid bağlanması üzerine floresan yoğunluğundaki değişim dernek ve ATP ve ADP hem dissosiasyonuna bildirmek için kullanılır (Bölüm 2 ve 3). MCAK durumunda, bir flüoresan yoğunluğu bir fark mantATP.kinesin ve mantADP.kinesin arasında görülmektedir Şekil 3 A, nükleotid içermeyen kinesin ile mantATP karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Kinesin-13'e mantATP bağlanması * ile oluşan floresan yoğunluğundaki artışı gösteren Örnek bilgileri, MCAK Şekil 3B'de gösterilmiştir. Şekil 3B'de gösterilen tipte veri mantATP bir konsantrasyon aralığında toplanır. MantATP konsantrasyonuna karşı belirlenen hız sabitleri (K gözlenen) bir grafiği Şekil 3C 'de gösterilmiştir. Bir doğrusal bir fonksiyonu bu verileri takılması (yani, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) atıl (2.8 Adım) k katkıda hız sabitleri dekonvulasyon sağlar. Bu nedenle, esas ve mantATP için ayrışma oranı sabiti hem belirlenmesini sağlayan (Şekil 1, k, 1 ve k, Şekil 4A, etiketlenmemiş ATP fazlası ile mantADP.kinesin karıştırma üzerine cereyan eden, reaksiyon göstermektedir. Şekil 4B'de veriler kinesin-13, MCAK ayrıldıktan sonra mantADP için gözlenen floresan yoğunluğu azalmayı göstermektedir. MantADP ayrılması için (adım 3.6), bir üstel fonksiyon için hız sabitini bu verileri uydurularak doğrudan belirlenir. 
Fluorofor methylanthraniloyl (mant) ile etiketlenmiş nükleotidler Şekil 2. ATP çevirme süresi bireysel adımları izole etmek için kullanılır. Riboz üzerindeki yerine 2 'veya 3' ya da konjüge MANT fluorofor konumunu gösteren mantATP (A) yapısı. (B) çözeltisi (mAXP) olarak mantATP ve mantADP Normalize floresan spektrumu ve bir mantATPkinesin'in MCAK (MATP + MCAK ve mADP + MCAK) ile kompleksi d mantADP. MantATP spektrumu çözelti içinde mantADP için azami floresan normalize çözelti içinde mantATP için azami floresans ve mantADP spektrumları için normalize edilir bulunmaktadır. MCAK ile karıştırılmış, MANT nükleotidlerin spektrumları 1 dakika karıştırma sonrası toplanır. Olarak protokolde açıklanan reaktifler ve florimetrenin ayarları konsantrasyonu 1.1 ve 1.2 adımları. 
MantATP arasında, bağlantı oranı sabitinin Şekil 3. ölçümü. (A) durdu-akış ile yer mesaja karıştırma alır tepkiyi gösteren şematik: mantATP (MATP) nükleotid-free Kinezin'e bağlanır. Proteinine bağlanması üzerine, MANT grubu artar floresans yoğunluğu. (B) 'Flüoresan sinyali, değişiklik (siyah) MCAK ile mantATP (25 M) (5 M nu karıştırma üzerine gözlenencleotide içermeyen). Bu veri (tartışma) mant floroforun ışıkla hesapları tek bir üstel fonksiyonu artı sabit negatif eğim bir çizgi, sığdırma (kesik kırmızı) Ankastre:. Önce durdu akış florimetrede karıştırma şırınga içeriği. nükleotid içermeyen MCAK ile mantATP reaksiyonu için hesaplanmış bir (C) hız sabitleri (K atıl) mantATP konsantrasyonu ile karşılaştırıldı. Bu grafik, M-1 s birimleri ile, bağlantı oranı sabitinin (Şekil 1, k, 1) olan gradyanı -1 ve y-dinleme ayrılma oranı sabit kalır (Şekil 1, k-1) ile olan bir doğrusal bölgesine sahip olacaktır s birimleri -1. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. MantADP ile yüklenmiş kinesin etiketlenmemiş ATP fazla bir katma seyreltilir: mantADP için ayrışma oranı sabiti Şekil 4 ölçümü (A) şematik akış durduruldu-sonrası karıştırma yer alan reaksiyon görünümüdür. Böylece ayrıştırma mantADP mantADP Birliği (tartışmaya bakınız) arka reaksiyonunu önlemek, etiketlenmemiş ATP ile değiştirilir. MANT grubunun flüoresan yoğunluğu, proteinin ayrıldıktan sonra azalmaktadır. Kinesin MCAK gelen mantADP dissosiye üzerine gözlenen (B) Floresans bir azalma. Floresan sinyali (siyah) (tartışma) mant grubun ışıkla hesabını tek bir üstel artı sürekli olumsuz bir eğim çizgisine uygun (kesikli kırmızı) 'dir. Belirlenen hız sabiti mantADP (Şekil 1, k ayrılması için hız sabitidir4) Ankastre:.. Durdurulmuş akış florimetrede karıştırma önce şırınga içeriği bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada, bir kinesin'in için nükleotid devletler arasındaki geçişlerin kinetik gözlem ve analiz için protokolleri sunuyoruz. Bu protokoller, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ile bağlantılı olarak hızlı karıştırma yöntemi durdu akışı kullanmaktadır. Bu tip yöntem kinesinlerin 9-11,13-16 çeşitli nükleotid bağlanma ve ayrılma incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Fosfat serbest (Şekil 1, Aşama 3) gözlenmesini izin vermez açıklanan yöntemler. Bununla birlikte, durdurmalı akış bir floresan yoğunluğu değişim 17 bağlanması için fosfat üretimini fosfat algılama proteini kullanarak, bu geçiş gözlemlemek için kullanılabilir. Proteine bağlanan genel olarak, flüoresans yoğunluğunda bir artış sergiler küçük flüorofor methylanthraniloyl (mant) kullanımı ile etiketlenmiş nükleotitler, sunulan yöntemler. Ayrıca, MANT florofor zaman R 2 'veya 3' pozisyon ya da konjügeibose, genellikle 9-12 nükleotid bağlanma, çözünme veya hidroliz üzerine çok az veya hiç etkisi yoktur. Mant-etiketli nükleotidler ticari kaynaklardan (malzemelerin listesine bakınız) kolayca elde edilebilir ve tek bir izomer 8 için saflaştınrken hızla yeniden dengeye olarak, 2 've 3' konjügat karışımları olarak sağlanmıştır. Mant-etiketli nükleotidler nükleotid bağlama ve ayrışma kinetikleri görülebildiği ile mükemmel bir bildirici molekül oluşturmak.
, Floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin kullanılması tarif edilen deneyler üzerinden flüoresans yoğunluğunda bir gerçek zaman değişikliği okumak olduğu anlamına gelir. Bu reaktifler, hızlı karıştırma ve daha sonraki reaksiyon ile bağlantılı floresan değişikliklerin gerçek zamanlı gözlem sağlar durdurmalı akış floresan, bu deneyler, ideal hale getirir. Saptama yöntemi olarak karıştırma tekniği ve floresan gibi durdu akışı araya gelmesi göreceli olarak örnek EF bir sistem üretirficient. Örneğin, 0.8 gerektirir Şekil 3C'de gösterilen veri elde etmek için - saflaştırılmış kinesin-13 1.0 mg, MCAK ve Şekil 4B'de gösterilen veri elde etmek için, saflaştırılmış ~ kinesin-13, 0.3 mg MCAK gerektirir. Bir florofor olarak mant kullanımının bir dezavantajı, ışıkla eğilimli olmasıdır. Bu durdu-akış, kinesin yokluğunda, reaksiyon tampon maddesi ile mant olarak işaretlenmiş nükleotid ihtiva eden bir çözelti karıştırma ile reaksiyon kinetiği kinesin ayrı olarak görülmektedir. MANT grubu ağartılmış olduğunda, flüoresans yoğunluğunda bir yavaş azalması gözlenmektedir. MANT grubunun photobleaching tarif edilen protokollere kullanılan çizelgesinin aralığı üzerinde iyi bir doğrusal fonksiyonu ile tarif edilmektedir. Bu yüzden, ışıkla ağartma için veri düzeltmek için, basit bir şekilde tek bir parametre ile tarif edilen bir doğrusal fonksiyonu (örneğin, mt + c) 'yerine daha sık yassı bir temel hat ile tarif edilen bir taban içeren bir üstel fonksiyon için uygun etmektir.
mantATP bağlama
MantATP arasında Birleşme ve ayrışmaya ilişkin oran sabitleri mikrotübül yokluğunda kinesin nükleotid bağlanma yeri ile bağlantılı olarak kalır (Kısım 2) ADP ölçülürken, çıkarılmalıdır. Bu mantATP, birleşme ve ayrılma (Şekil 1, aşama 1) ADP ayrışma ayrı olarak görülmektedir sağlar. Bu kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin (2.1 adım) üzerinden EDTA en az 50-kat fazlası ile inkübe edilir elde etmek. EDTA Mg 2 + iyonları nükleotid 11 salınımına neden nükleotid-bağlayıcı cebinden, uzaklaşmak için Mg 2 + neden tecrit. Yürütülmesi 2.1 adım Bu nedenle, - 2.3, bu Mg +2 ücretsiz tampon kullanmak hayati önem taşımaktadır. Nükleotid-serbest kinesin protein tampon ücretsiz nükleotid gelen ve EDTA hem ayırmak için alışverişinde olduğunu. Bu ayrılık, bir tek yerçekimi akışı ge gerçekleştirmek içinl filtrasyon kolon yeterlidir basit ve (malzemelerin listesini görmek) kullanmak için hızlıdır. Nükleotid serbest kinesin ile mantATP etkileşimi, birleşme ve ayrılma oranı sabiti (2.8 aşamasının) kıvrım giderme sağlamak için mantATP konsantrasyonda (Basamak 2.4) aralığında gerçekleştirilir. Bu tip deney arkasındaki teori, ayrıca tek mantATP en düşük konsantrasyonu ile başlar, bu deneyler içinde referans 18'de açıklanmaktadır. Bu, farklı konsantrasyonları arasında yıkama aşamasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Büyük olasılıkla mantATP konsantrasyonu arttıkça durdu akış florimetrede hassasiyetini ayarlamak için gerekli olacaktır. MantATP konsantrasyonu her zaman sözde birinci dereceden koşulları sağlamak için kinesin nükleotid bağlanma sitelerinin konsantrasyonuna göre en az 5 kat fazla olmalıdır. MantATP konsantrasyonu artar Bununla birlikte, sinyal değişimi düşüşler kinesin bağlanan nükleotid fraksiyonu olarak gömülmek hale gelir. Therefo, kinesin konsantrasyonu da mantATP her yeni konsantrasyonu artırılır, bu tür yeniden mantATP konsantrasyonu, nükleotid bağlanma sitelerinin (2.6 adım) fazla 10 kat molar fazlalık daha asla daha fazladır.
mantADP Ayrılma
MantADP için birleşme ve ayrılma oranı sabitleri mantATP (Kısım 2) için tarif edilen aynı yöntemle belirlenebilir açabilir. Bir kinesin ADP ayrışması doğrudan mantADP.kinesin kompleks, etiketlenmemiş ATP (adım 3.5) fazlası ile karıştırılır mantADP (Aşama 3.1-3.3) nükleotid bağlanma sitesi önyüklemeyle gözlenebilir. Fazla etiketsiz ATP kinesin'in için mantADP yeniden bağlanmasının önler ve böylece mantADP örgütlenme ayrı olarak uyulması gereken ayrışma reaksiyonu (Şekil 1, k 4) verir. Bu tahlilde, etiketlenmemiş ATP konsantrasyonu nuc en azından bir 50 kat fazla mol olmalıdırbağlanma yeri oligonükleotid. Bu deneyde arkasındaki teori de bu doğrudan yöntem, Aşama 2.8 'de tarif edilen Y-eksenine göre sabit bir ekstrapolasyon ayrışma hızı için daha doğru bir değer verir referans 18'de açıklanmaktadır.
Mikrotübüller İçerme
Açıklanan yöntemler aynı zamanda mikrotübül mevcudiyetinde nükleotid bağlama ve ayrışma kinetiklerini belirlemek için kullanılabilir. Mikrotübüller önce durdu-akış karıştırma nükleotid ihtiva eden bir şırıngaya konur: Şekil 3B ve 4B alt şırınga (Insets). Bu mikrotübülleri, uygun olarak, bu yapılandırmada, kinesin aynı zamanda nükleotid karşılayacaktır. Stabilize mikrotübüller tübülin polimerin ömrü, stabilize edici kimyasal ya kullanımı ile uzatılmış olduğu, kullanılan örneğin 'guanosin-5 gibi taksol veya nonhydrolysable GTP analoğu gibi - [(α, β) -methyleno] trifosfat (GMPCPP, malzeme listesine bakınız). Bu sıvı azot 9,19 birçok ay boyunca saklanabilir mikrotübülleri yapmak GMPCPP sahip tübülin polimerizasyonu iki çevrim kullanmak mümkündür. Önceden hazırlanmış mikrotübül kullanılması nedeniyle, bu tahliller yapmak için pratik güçlüklerle azaltır. Tahlillerinde mikrotübül dahil etmek için, bir mikrotübül stabilite için uygun olan bir reaksiyon tamponu kullanılması önemlidir. Tercih tamponu (BRB80 olarak da bilinir), 80 mM PIPES pH 6.9, 1 mM MgCI2, 1 mM EGTA 20,21 ihtiva eden en yaygın olarak kullanılan tampon madde ile, borularla vardır.
Açıklanan yöntemler kinesinlerin ile kullanımı sınırlı değildir, ancak uyarlanmış herhangi bir nükleotid bağlayıcı proteine uygulanabilir. Örneğin, benzer yöntemlerin moleküler motorlar 12,22 arasında miyozin ailesi ve mant etiketli guanozin nükleotitlerin kullanılması daha uzun ve üyelerinin ATP devir döngüsü uygulanmıştırBu tip yöntemler, proteinleri, GTP ye hidrolize 23,24.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC), Royal Society ve Nottingham Üniversitesi tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate | Jena Biosciences | # NU-202 | mantATP |
| 2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate | Jena Biosciences | # NU-201 | mantADP |
| Mg-ATP | Roche | # 10519979001 | The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC. |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120-500 | 0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled. |
| Dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | 1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin. |
| NAP-5 column | GE Healthcare | # 17-0853 | G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column |
| GMPCPP | Jena Biosciences | # NU-405 | nonhydrolysable analogue of GTP |
| Stopped-flow fluorimeter | Applied Photophysics | SX20 | A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored. |
References
- Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. Structures of kinesin motor proteins. Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).
- Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).
- Friel, C. T., Howard, J. Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines. J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).
- Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase. EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).
- Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules. Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).
- Kikkawa, M., et al. Switch-based mechanism of kinesin motors. Nature. 411, 439-445 (2001).
- Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors. Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).
- Bagshaw, C. ATP analogues at a glance. J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).
- Friel, C. T., Howard, J. The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization. EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).
- Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. Nature. 373, 671-676 (1995).
- Sadhu, A., Taylor, E. W. A kinetic study of the kinesin ATPase. J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).
- Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes. Biochemistry. 30, 422-430 (1991).
- Hackney, D. D. Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity. Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).
- Lockhart, A., Cross, R. A. Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor. Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).
- Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke. J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).
- Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin. Biochemistry. 37, 800-813 (1998).
- Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase. Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).
- Goodrich, J. A., Kugel, J. F. Chapter 4. Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring, NY. 69-97 (2006).
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).
- Olmsted, J. B., Borisy, G. G. Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro. Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).
- Brinkley, W. Microtubules: a brief historical perspective. J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).
- Ostap, E. M., Pollard, T. D. Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase. J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).
- Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism. Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).
- Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins. Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).
