Uso de Nucleotídeos stopped-flow de fluorescência e rotulados para analisar o ciclo de rotatividade ATP de cinesinas

Summary

As cinesinas são caracterizados pela interacção dependente de nucleótido com microtúbulos: um ciclo de facturação ATP acoplado a um ciclo de interacção dos microtúbulos. Aqui, nós descrevemos protocolos para analisar a cinética da transição de nucleótidos individuais do ciclo de facturação de uma quinesina ATP utilizando nucleótidos marcados com fluorescência e fluorescência de fluxo parado.

Abstract

A superfamília de cinesina das proteínas de motor de microtúbulos associados compartilhar um domínio motor característica que ambas hidrolisa ATP e liga-se os microtúbulos. Kinesins mostrar as diferenças entre a superfamília, tanto em volume de negócios ATP e na interação dos microtúbulos. Estas diferenças adaptar kinesins específicos para diversas funções, tais como transporte de carga, microtúbulos deslizante, microtúbulos despolimerização e estabilização dos microtúbulos. Para compreender o mecanismo de acção de uma quinesina é importante para compreender a forma como o volume de ciclo de química ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos. Para dissecar o ciclo de facturação de ATP, uma abordagem consiste em utilizar os nucleótidos marcados com fluorescência para visualizar os passos individuais do ciclo. A determinação da cinética da transição de cada nucleótido no ciclo de facturação ATP permite que o passo limitante da velocidade ou passos para o ciclo completo para ser identificado. Para uma cinesina, é importante conhecer o passo limitante da taxa, ema ausência de microtúbulos, como este passo é geralmente acelerada vários milhares de vezes quando a cinesina interage com microtúbulos. O ciclo na ausência de microtúbulos é então comparado com o na presença de microtúbulos de compreender completamente ATP ciclo de facturação de uma cinesina. A cinética da transição de nucleótidos individuais são geralmente demasiado rápida para observar misturando manualmente os reagentes, particularmente na presença de microtúbulos. Um dispositivo de mistura rápida, tal como um fluorímetro de fluxo parado, o que permite que a cinética de ser observada em escalas de tempo de tão pouco como alguns milésimos de segundo, pode ser utilizado para monitorar tais transições. Aqui, nós descrevemos os protocolos em que a mistura rápida dos reagentes de stopped-flow é utilizado em conjunção com nucleótidos marcados com fluorescência para dissecar o ciclo de facturação de um ATP cinesina.

Introduction

As cinesinas são uma superfamília de proteínas caracterizada por um domínio altamente conservado do motor ^1. O domínio motora cinesina interage com microtúbulos de um modo dependente-nucleótido. Os membros da família kinesin exibir uma gama de funções de kinesins translocação, que transportam cargas de uma forma direcionada ao longo dos microtúbulos, a kinesins de ligação finais não translocação de microtúbulos, que regulam a dinâmica dos microtúbulos ^2,3.

Kinesins utilizar o volume de negócios de adensosine-5'-trifosfato (ATP) para regular a sua interação com o citoesqueleto de microtúbulos ^4-6. A conformação do domínio motora cinesina e, por conseguinte, a sua afinidade para a microtúbulos depende do seu estado de nucleótidos: de ATP, ADP, ADP.Pi ou não de nucleótidos podem ser ligados (Figura 1). Para compreender o mecanismo molecular de uma quinesina, é necessária uma compreensão da relação entre o volume de ATP e interacção dos microtúbulos. Aguinte, um importante objectivo no campo da cinesina é para caracterizar as propriedades funcionais de diferentes estados de nucleótidos e a cinética das transições entre ambos na presença e na ausência de microtúbulos.

Figura 1 O ciclo de facturação mais simples do ATP para uma cinesina consiste em quatro estados possíveis: (Φ) livre de nucleótido, o ATP-ligado, ADP.P _i -bound e ADP-bound Cada um dos quatro transições é caracterizada por um para a frente e. taxa constante para trás (k _{x k-x} e, respectivamente).

Para compreender como a química do ciclo de facturação ATP está acoplado ao ciclo de interacção mecânica microtúbulos, deve-se determinar qual o passo do ciclo de facturação ATP é limitante da taxa na ausência de microtubules e, em seguida, determinar a forma como o ciclo é alterado pela presença de microtúbulos. O ciclo de facturação simples ATP consiste em quatro passos químicos individuais: (1) ligação de ATP para o local vazio (Φ indica o local vazio, ou seja, livre de cinesina-nucleótido); (2) clivagem do ATP; (3) fosfato de dissociação e (4) dissociação ADP (Figura 1). O passo limitante de velocidade define a constante de velocidade para o ciclo completo volume de ATP. Portanto, para determinar qual é o passo limitante da velocidade de cada uma das transições individuais deve ser medido e comparado com a constante de velocidade para o ciclo completo. Os métodos para medir a constante de taxa de ciclo global rotatividade ATP não são descritos aqui, mas pode ser encontrado na referência 7 Descrevem-se métodos em que as constantes de velocidade para os passos químicos individuais podem ser determinados. Há um número de métodos disponíveis para estudar transições individuais do ciclo de facturação de uma proteína de nucleótidos de hidrólise. Os métodos aqui apresentados têm advantage das propriedades dos nucleótidos marcados com fluoróforo do methylanthraniloyl, geralmente referido como mant, que exibem uma alteração na intensidade de fluorescência após a ligação à proteína ^8. O grupo mant é usado porque o seu pequeno tamanho significa que, quando acoplado à ribose (figura 2A), que, geralmente, tem pouco ou nenhum efeito sobre a cinética de ligação de nucleótidos ou hidrólise ^9-12. Aqui, nós apresentamos os protocolos que descrevem a utilização de nucleótidos marcados com mant, em conjunto com a fluorescência de fluxo parado, para permitir a observação da ligação e dissociação de nucleótidos no ciclo de facturação de um ATP cinesina.

Protocol

1 Determinação da intensidade da mudança de fluorescência após ligação da Mant-marcado de nucleótidos.

1. Adicionar 1 uM marcado com mant nucleótido a cinesina 1 uM (concentração final) em tampão de reacção adequado. Normalmente, um tampão que beneficia o crescimento ea estabilidade dos microtúbulos é usado (ver discussão). Um tampão utilizada contém 80 mM de piperazina bis-2-etanossulfónico (PIPES), pH6.9, 1 mM de _MgCl2 e 1 mM de ácido etilenoglicol-bis-2-ácido aminoéter-tetracético (EGTA).
   Nota: A concentração de cinesina indicado em todos os protocolos, refere-se à concentração de sítios de ligação de nucleótidos (isto é, domínios de automóveis). Diferentes cinesinas existir como monómeros, dímeros ou tetrâmeros e assim pode conter mais do que um local de ligação de nucleótidos, por molécula.
2. Após um período de incubação (1-3 min) e utilizando um fluorímetro padrão, medir o espectro de emissão para o complexo-cinesina nucleótido marcado com mant. Use um comprimento de onda de excitação de 365 nm emedida a luz emitida 400-500 nm em incrementos de 1 nM.
3. Adicione uma solução de 1 mM de nucleótidos mant-rotulado no mesmo tampão de reacção usado no Passo 1.1.
4. Medir o espectro de emissão para o mant nucleotídica única amostra, como descrito anteriormente (ver Passo 1.2).
5. Normalizar o espectro com o sinal de comprimento de onda no pico de intensidade de fluorescência do espectro de nucleótido mant em solução (isto é, sem quinesina), dividindo esse valor por meio.
6. Traçar o espectro normalizado (por exemplo, a Figura 2B) para observar as diferenças de intensidade de fluorescência entre o mantATP-bound e / ou mantADP-bound kinesina e mant nucleotídeo em solução.

2 Medição das constantes de associação e dissociação da taxa para mantATP

1. A uma solução de até 20 uM cinesina (ver discussão) em qualquer Mg ^{2 +} tampão apropriado -free (por exemplo, 80mm pH6.9 PIPES, 1 mM de EGTA, 0,1% de Tween 20), adicionar 1mM de ácido etilenodiaminotetracético (concentração final) (EDTA) e 1 mM (concentração final), ditiotreitol (DTT). Nota: A adição de Tween 20 para o buffer é recomendado, pois reduz / impede a perda de proteína kinesina na coluna usado para troca de tampão (Passos 2.3 e 3.3)
2. Incubar a solução a 25 ° C durante 15 min.
3. Independente de nucleótidos e de EDTA livre da cinesina usando uma coluna de fluxo por gravidade de filtração de gel G-25 Sephadex de acordo com as instruções do fabricante (ver lista de materiais).
   1. Equilibrar a coluna com pelo menos 3 volumes de um tampão apropriado -free Mg ^{2 +} de coluna (ver Passo 2.1). Carregar a solução contendo a cinesina na coluna. Preparar um tubo de recolha por adição de um volume adequado de solução de cloreto de magnésio 100 mM para o tubo vazio, de tal forma que a concentração final de cloreto de magnésio é 1 mM após a recolha da solução de cinesina. Além imediata de cloreto de magnésio ajuda estabilizaSE, o kinesin sem ação.
   2. Eluir a kinesina usando um tampão -free apropriado Mg ^{2 +.} Kinesins são instáveis ​​quando livre de nucleotídeo por isso é importante trabalhar rapidamente. Guarde o kinesina sem ação no gelo e usar dentro de 1-2 horas.
4. Durante ou antes da preparação de cinesina livre de nucleótido, preparar uma série de concentração mantATP no mesmo tampão da reacção como a solução final de cinesina livre de nucleótido. Determinar a gama de concentrações de mantATP necessárias de acordo com a concentração de cinesina disponíveis com uma série típico que varia de 0,1 a 50 um (ver passo 2.5 e discussão).
5. Prepara-se uma série de concentrações de cinesina livre de nucleótido. Para cada concentração de mantATP (Passo 2.4), uma concentração de cinesina livre-de nucleótidos devem ser preparadas de modo a que o nucleótido marcado mant-se em 5 a 10 vezes de excesso molar, mais locais de ligação de nucleótidos de cinesina.
6. Defina o comprimento de onda de excitação no-flo paradow fluorímetro a 365 nm e recolhem a luz emitida a> 400 nm usando um filtro de passagem longa.
7. Começando com a concentração mais baixa de mantATP, misturar o mantATP com uma concentração adequada de cinesina livre de nucleótido em uma proporção de 1: 1 v / v utilizando um fluorímetro de fluxo interrompido (Figura 3A e 3B Inserção). Nota: Os reagentes são diluídos em 50% durante a mistura. Manter uma nota da concentração de nucleotídeos no pré e pós de mistura (ou seja, 3,0 / 1,5 M) para evitar confusão.
8. Montar a alteração na intensidade da fluorescência medida para cada concentração de mantATP a uma função exponencial, mais uma linha de declive negativo constante para explicar a fotodegradação do grupo mant (isto é, ₀ = A fluorescência .exp (k .t _obs) + (m. t + c), em que A é a amplitude de _{0, kobs} é a constante de velocidade e t é o tempo, ver Figura 3B e discussão). A partir destes ajustes determinar umtaxa constante (k _obs) para cada concentração de mantATP. Cada _obs k é uma convolução de uma constante de associação e de dissociação taxa (Figura 1, k ₁ e _k-1).
9. Deconvoluir da associação e da taxa de dissociação constantes traçando k _obs contra concentração mantATP (por exemplo, a Figura 3C). Monte estes dados a uma função linear (isto é, k _obs = k ₁ [mantATP] + _k-1) para obter o gradiente e do eixo y intercepção. O gradiente representa a constante de velocidade para a associação mantATP (Figura 1, k _1), com M ^-1 s unidades ^-1. A intersecção representa a constante de velocidade de dissociação (Figura 1, _k-1), com unidades de ^s-1 (ver discussão). Nota: Esta abordagem também pode ser aplicado para determinar a associação e dissociação do ADPAs constantes de velocidade (figura 1, k e k _{-4 4)} usando mantADP como as sequências de nucleótidos.

3 Medição da dissociação Constante para mantADP

1. A uma solução de 2 uM cinesina num tampão de reacção adequado (por exemplo, 80 mM PIPES pH6.9, 1 mM de MgCl _2, 1 mM de EGTA, 0,1% de Tween 20), adicionar 50 uM mantADP (concentração final).
2. Incubar a ²⁵ ° C por 30 min.
3. Remover o excesso de mantADP e outro nucleótido livre por troca de tampão a cinesina no tampão de reacção escolhido usando uma coluna de Sephadex G-25 (ver a lista de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. O domínio motor kinesin agora deve ser carregado com mantADP.
4. Definir o comprimento de onda de excitação no fluorímetro de fluxo parado para 365 nm e recolhem a luz emitida a> 400 nm usando um filtro de passagem longa.
5. Misture o complexo mantADP.kinesin (~ 1 | iM) com uma dobra em 50 ou maior do molar excesso não marcado de ATP em uma relação de 1: 1 v / v utilizando um fluorímetro de fluxo interrompido (Figura 4A e 4B Inserção).
6. Coloque a diminuição da intensidade de fluorescência observado ao longo do tempo a uma única função exponencial além de uma linha de constante inclinação negativa para explicar fotodegradação do grupo mant (ie, Fluorescência = A ₀ .exp (k .t _obs) + (+ m.t c), em que A é a amplitude de _{0, kobs} é a constante de velocidade e t é o tempo, ver Figura 4B e discussão). O k _obs determinada a partir desta forma é a constante de velocidade para a dissociação de ADP (Figura 1, k ₄₎ com as unidades de ^s-1 (ver discussão).

Representative Results

Um aumento na intensidade de fluorescência do grupo mant é tipicamente observado após a ligação de nucleótido marcado, mant a uma cinesina. No entanto, a magnitude de uma tal mudança de sinal é dependente da cinesina particular em questão. Por isso, é útil para realizar medições de equilíbrio para confirmar a presença e grandeza de uma alteração da intensidade de fluorescência antes de progredir para ensaios cinéticos. Os espectros de fluorescência e representativas para mantATP mantADP, tanto em solução como no complexo com a cinesina-13, MCAK, são apresentados na Figura 2B. Estes dados ilustram o aumento de intensidade da fluorescência exibida por ambos mantATP mantADP e após ligação a MCAK. A mudança na intensidade de fluorescência após a ligação de mant nucleotídeo para um kinesin é usado para informar sobre a associação e dissociação de ambos ATP e ADP (pontos 2 e 3). No caso de MCAK, uma diferença de intensidade de fluorescência é observado entre mantATP.kinesin e mantADP.kinesin

A Figura 3A descreve a reacção que ocorre durante a mistura com a cinesina mantATP livre de nucleótido. Os dados representativos que ilustram o aumento da intensidade de fluorescência que ocorre após ligação de mantATP a cinesina-13, MCAK é mostrado na Figura 3B. Dados do tipo mostrado na Figura 3B é recolhido a uma gama de concentrações mantATP. Um gráfico das constantes de velocidade (k) _obs determinadas em função da concentração mantATP é mostrado na Figura 3C. Ajustando estes dados a uma função linear (isto é, k _obs = k ₁ [mantATP] + _k-1) permite desconvolução das constantes de velocidade, que contribuem para k _obs (Passo 2.8). Assim, permitindo a determinação de ambos a associação e a constante de velocidade de dissociação para mantATP (Figura 1, k ₁ e k 1, respectivamente).

A Figura 4A representa a reacção que ocorre durante a mistura mantADP.kinesin com um excesso de ATP não marcado. Os dados na Figura 4B mostra a diminuição da intensidade de fluorescência observada para mantADP mediante dissociação da cinesina-13, MCAK. Ao ajustar os dados para uma função exponencial (Passo 3.6) a constante de velocidade para a dissociação de mantADP é determinada directamente.

Figura 2. nucleótidos etiquetados com o methylanthraniloyl fluoróforo (mant) são usadas para isolar diferentes etapas do ciclo de volume de ATP. (A) Estrutura do mantATP mostrando a posição do fluoróforo mant conjugado a qualquer um dos 2 'ou 3' da ribose em posição. (B) os espectros de fluorescência e normalizado para mantATP mantADP em solução (PMAX) e uma mantATPd mantADP em complexo com o kinesina MCAK (MATP + MCAK e MADP + MCAK). Os espectros mantATP são normalizados para a fluorescência no máximo de mantATP em solução e os espectros mantADP são normalizados para a fluorescência _máxima para mantADP em solução. Os espectros dos nucleotídeos mant misturados com MCAK são coletados em 1 min pós mistura. A concentração dos reagentes e as configurações fluorímetro são como descrito no protocolo de passos 1.1 e 1.2.

Figura 3 Medição da constante de velocidade de associação de mantATP. (A) Diagrama esquemático que descreve a reacção que tem lugar pela mistura de pós de fluxo parado: mantATP (MATP) se liga ao nucleótido-livre cinesina. A intensidade de fluorescência do grupo mant aumenta aquando da ligação à proteína. (B) mudança do sinal de fluorescência (preto) observada após a mistura mantATP (25 M) com MCAK (5 M nulivre-cleotide,). Este é o ajuste dos dados (tracejado vermelho) para uma função exponencial, mais uma linha de inclinação negativa constante, o qual representa a fotodegradação do fluoróforo mant (ver discussão) Inserção:. Sumário das seringas antes da mistura no fluorímetro de fluxo parado. (C) constantes de velocidade (k _obs) determinados para a reação de mantATP com MCAK sem ação conspiraram contra concentração de mantATP. Este terreno terá uma região linear com o gradiente sendo a constante de velocidade de associação (Figura 1, k ₁₎ com unidades de M ^-1 s ^-1 e a intercepção y ser a constante de velocidade de dissociação (Figura 1, _k-1) com unidades de s ^-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

. Figura 4 Medição da constante de velocidade de dissociação para mantADP (A) esquemática que descreve a reacção que tem lugar pela mistura de pós de fluxo parado: cinesina pré-carregado com mantADP é diluída em um excesso de ATP não marcado. Dissociando mantADP passa a ATP não marcado, impedindo desse modo a reacção de associação para trás mantADP (ver discussão). A intensidade de fluorescência do grupo mant diminui mediante a dissociação da proteína. Redução (B) A fluorescência observada mediante a dissociação de mantADP da cinesina MCAK. O sinal de fluorescência (preto) é a conta para a fotodegradação do grupo mant (ver discussão) apto (tracejado vermelho) a uma única exponencial além de uma linha de inclinação negativa constante. A constante de velocidade determinada é a constante de velocidade para a dissociação de mantADP (Figura 1, k₄₎ Inset.:. Índice das seringas antes da mistura em um fluorímetro de fluxo interrompido por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Aqui, apresentamos os protocolos de observação e análise da cinética de transições entre os estados de nucleotídeos para um kinesin. Estes protocolos utilizam o método de mistura stopped-flow rápido em conjunto com nucleótidos marcados com fluorescência. Métodos deste tipo têm sido amplamente utilizados para o estudo de ligação de nucleótidos e de dissociação para uma variedade de cinesinas ^9-11,13-16. Os métodos descritos não permitem a observação de libertação de fosfato (Figura 1, Passo 3). No entanto, a fluorescência de fluxo interrompido pode ser usada para observar a esta transição, utilizando uma proteína de detecção de fosfato para a produção de pares de fosfato para uma mudança de intensidade de fluorescência ^17. Os métodos apresentados uso nucleótidos marcados com o pequeno methylanthraniloyl fluoróforo (mant), que geralmente apresentam um aumento na intensidade de fluorescência quando ligados à proteína. Além disso, o fluoróforo mant, quando conjugado com ou em 2 'ou 3' em posição o ribose, muitas vezes, tem pouco ou nenhum efeito sobre a ligação, a dissociação ou a hidrólise do nucleótido ^9-12. Mant-nucleótidos marcados estão prontamente disponíveis a partir de fontes comerciais (ver lista de materiais) e são fornecidos como uma mistura dos 2 'e 3' do conjugado uma vez que rapidamente se equilibram novamente, quando purificado com um único isómero ^8. Nucleótidos marcados com Mant fazer moléculas repórter excelentes pelo que a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos podem ser observadas.

A utilização de nucleótidos marcados com fluorescência significa que a leitura dos ensaios descritos é uma mudança no tempo real da intensidade de fluorescência. Isto faz com que estes ensaios ideal para a fluorescência de fluxo parado, o que permite uma mistura rápida dos reagentes e da observação de alterações de fluorescência associada com a reacção subsequente em tempo real. A combinação de de fluxo parado como a técnica de mistura e de fluorescência como o método de detecção produz um sistema que é relativamente amostra efficiente. Por exemplo, para adquirir os dados apresentados na Figura 3C requer 0,8-1,0 mg de cinesina-13 purificada, MCAK, e para adquirir os dados apresentados na Figura 4B requer ~ 0,3 mg de cinesina-13 purificada, MCAK. Uma desvantagem do uso de mant como um fluoróforo é que é propenso a fotobranqueamento. Isto pode ser observado no isolamento de cinesina cinética de reacção por mistura de uma solução de nucleótido marcado com mant com tampão de reacção, na ausência de cinesina, no de fluxo parado. A lenta redução na intensidade de fluorescência é observado como o grupo mant torna branqueada. Ao longo da gama de escalas de tempo utilizados nos protocolos descritos fotobranqueamento do grupo mant está bem descrita por uma função linear. Portanto, uma forma simples de corrigir os dados de fotobranqueamento é para se ajustar a uma função exponencial com uma linha de base descrita por uma função linear (isto é, mt + c), em vez da linha de base plana mais comum, descrito por um único parâmetro.

ligação mantATP

Ao medir as constantes de velocidade de associação e de dissociação da mantATP (Secção 2) o ADP, o qual permanece associado com o sítio de ligação de nucleotídeo cinesina na ausência de microtúbulos, devem ser removidos. Esta associação permite mantATP e de dissociação (figura 1, passo 1) para ser observado no isolamento a partir de dissociação ADP. Para conseguir isto, a cinesina é incubado com pelo menos um excesso de 50 vezes de EDTA sobre os locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.1). O EDTA sequestra iões Mg ^{2 +} Mg ^{2 +} causando a dissociar-se do bolso de ligação ao nucleótido, o que resulta na libertação do nucleótido ^11. Portanto, ao realizar as etapas de 2,1-2,3, é fundamental a utilização de um tampão livre de Mg ^{2 +.} A proteína isenta de cinesina nucleótido é trocada de tampão para separá-lo tanto do nucleótido livre e de EDTA. Para realizar essa separação, uma descartável ge de fluxo por gravidadecoluna l filtração é suficiente e é simples e rápido de usar (ver lista de materiais). A interacção de mantATP com quinesina de nucleótidos livres é realizada a uma gama de concentrações mantATP (Passo 2.4) para permitir desconvolução das constantes de associação e de dissociação da taxa (Passo 2.8). A teoria por detrás experiências deste tipo é bem descrito na referência 18 Na realização destas experiências uma começa com a concentração mais baixa de mantATP. Isso elimina a necessidade de etapas de lavagem entre diferentes concentrações. Provavelmente será necessário para ajustar a sensibilidade do fluorímetro de fluxo parado como a concentração mantATP é aumentada. A concentração mantATP devem estar sempre em excesso pelo menos de 5 vezes em relação à concentração de sítios de ligação de nucleótidos de cinesina para manter as condições de pseudo-primeira ordem. No entanto, como a concentração de mantATP é aumentada, a alteração de sinal pode tornar-se inundado como a fracção de nucleótidos que se liga a cinesina diminui. Therefore, a concentração da cinesina também é aumentado para cada nova concentração de mantATP de tal modo que a concentração de mantATP nunca é maior do que um excesso molar de 10 vezes em relação a locais de ligação de nucleótidos (Passo 2.6).

mantADP dissociação

Apesar da taxa de associação e dissociação para as constantes mantADP pode ser determinada pelo mesmo método descrito para mantATP (Secção 2). A dissociação de ADP a partir de uma quinesina pode ser directamente observada por pré-carregar o local de ligação do nucleótido com mantADP (Passos 3,1-3,3) O complexo mantADP.kinesin é então misturado com um excesso de ATP não marcado (passo 3.5). O excesso não marcado ATP impede a religação da mantADP a cinesina e assim permite que a reacção de dissociação (Figura 1, k ₄₎ para ser observado no isolamento da associação de mantADP. Neste ensaio, a concentração de ATP não marcado deve ser, pelo menos, um excesso molar de 50 vezes de nucleotide sítios de ligação. A teoria por detrás deste ensaio é também descrito na referência 18 Este método directa dá um valor mais preciso para a taxa constante de dissociação do que a extrapolação para o eixo y descrito no Passo 2.8.

Inclusão de microtúbulos

Os métodos descritos podem também ser utilizados para determinar a cinética de ligação e de dissociação de nucleótidos na presença de microtúbulos. Os microtúbulos são introduzidos para as sequências de nucleótidos contendo uma seringa antes da mistura no fluxo parou: a seringa inferior na Figura 3B e 4B (Inserções). Nesta configuração, a cinesina irá satisfazer o nucleótido ao mesmo tempo que satisfaz os microtúbulos. Microtúbulos estabilizados são utilizados, em que o período de vida do polímero tubulina é alargado através da utilização de uma substância química ou de estabilização, tal como o taxol ou um análogo de GTP nonhydrolysable, tais como a guanosina-5 '- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, veja a lista de materiais). É possível utilizar dois ciclos de polimerização da tubulina com GMPCPP fazer microtúbulos que podem ser armazenados durante vários meses em ^9,19 de azoto líquido. O uso de microtúbulos pré-preparados reduz significativamente as dificuldades práticas para a realização do ensaio. Para incluir microtúbulos nos ensaios, é importante o uso de um tampão de reacção adequado para a estabilidade dos microtúbulos. O tampão de escolha é baseado TUBOS, com o tampão mais comumente usado contendo 80 mM de PIPES pH 6,9, 1 mM de _MgCl2 e 1 mM de EGTA (conhecido como BRB80) ^20,21.

Os métodos descritos não se restringem a utilização com cinesinas, mas pode ser adaptada e aplicada a qualquer proteína de ligação de nucleótido. Por exemplo, métodos semelhantes têm sido aplicadas para o ciclo de facturação ATP de membros da família de miosina de motores moleculares ^12,22 e a utilização de nucleótidos marcados mant guanosina estende-se aindamétodos deste tipo a GTP hidrolisar proteínas ^23,24.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’triphosphate	Jena Biosciences	# NU-202	mantATP
2’/3’-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5’-diphosphate	Jena Biosciences	# NU-201	mantADP
Mg-ATP	Roche	# 10519979001	The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100 mM in 100 mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260 nm (e = 15,400 M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20 oC.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	BP120-500	0.5 M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.
Dithiothreitol (DTT)	Melford	MB1015	1 M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.
NAP-5 column	GE Healthcare	# 17-0853	G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column
GMPCPP	Jena Biosciences	# NU-405	nonhydrolysable analogue of GTP
Stopped-flow fluorimeter	Applied Photophysics	SX20	A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1 - 100 sec to be monitored.