Protocol
BEMÆRK: Animal håndtering og eksperimenter blev udført som godkendt af Göttingen Universitet Komité for Etik i Dyreforsøg.
1. Fremstilling af instrumenter og Pipette Fabrication
- Sørg for, at elektroporation setup består af et stereomikroskop med stor arbejdsafstand og er udstyret med fluorescerende belysning og filtrer sæt til den anvendte farvestof.
- For elektroporation bruge enten en dedikeret enkelt celle elektroporator eller en generisk firkantet pulsgenerator knyttet til et oscilloskop. Tilslut elektroporator udgange til en pipette indehaveren og et bad elektrode. Forbind den positive terminal af impulsgeneratoren til mikropipette indehaveren, og den negative terminal til badet elektrode. Både sikre pipette holder og vandbadet elektrode indeholder sølvtråde belagt med et tyndt lag af sølvchlorid.
- Montere pipette holderen på en mikromanipulator at tillade nøjagtig positionering. Fabrikere elektroporeringsteknikker mikropipetter af borsilikatglas kapillærer med intern glødetråd.
- Brug en horisontal mikropipette aftrækker og anvende en modificeret protokol til fremstilling af pipetter til patch clamp-forsøg som beskrevet af bestman et al. 13.
- Tilpasse parametre for at fremstille længere skaft og en mindre spids åbning resulterer i en højere pipette modstand på omkring 15-20 MOhm til enkelt-celle elektroporation. Pipetten resistens bør være lavere, fx 3-4 MOhm, for mærkning af grupper af celler.
- Mål pipette modstand enten direkte med en dedikeret enkelt celle elektroporator eller beregne det med Ohms lov efter måling strøm med et oscilloskop efter anvendelse af en defineret spænding puls.
2. Fremstilling af Elektroporation Solution
- Opløs fluorofor-koblede dextran i frog Ringer (98 mM NaCl, 2 mM KCI, 1 mM CaCl2, 2 mM MGCl 2, 5 mM glucose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, indstillet til pH 7,8, osmolaritet var 230 mOsmol / l) ved en koncentration på 3 mM. Cellerne kan ikke så klart mærkes, hvis der anvendes lavere farvestofkoncentrationer. Forbered et stort volumen stamopløsning og opdele det i små portioner. Fryse dem til opbevaring (stabil i måneder).
BEMÆRK: Dextraner fås i forskellige størrelser og en bred vifte af emission / excitationsspektre (f.eks Alexa 488-dextran 10 kD, Alexa 546-dextran 10 kD, Alexa 568-dextran 10 kD, Alexa 594-dextran 10 kD, TMR-dextran 3 kD.). - Efterfylde mikropipette med en aflang pipettespids med et lille volumen af dextranopløsning (1-5 pi). Flick omhyggeligt mikropipette med fingeren for at fjerne resterende luftbobler fra pipettespidsen.
- Montere mikropipette i pipette holder. Sørg for at sølvtråd inde pipetten er i kontakt med farveopløsning.
3. Udvælgelse af Larve X. laevis </ Em>
- Brug albino larver af X. laevis for eksperimenterne. Vildtype dyr besidder pigment fyldt melanoforerne der viser autofluorescens emission under konfokal / multifoton billeddannelse og er derfor ikke egnet til de beskrevne eksperimenter.
- Stage premetamorphotic haletudser efter Nieuwkoop og Faber 14. Vælg haletudser af trin 45-53 for eksperimenterne.
4. Elektroporation af fluorofor-koblede Dextraner
- Placere et lille stykke væv i en petriskål og dække det med et lille volumen vand, der indeholder 0,02% tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat-methansulfonat, indstillet til pH 7).
- Bedøve haletudser i vand indeholdende 0,02% tricaine. Efter nogle minutter dyrene ophøre bevægelse. Bekræft ordentlig anæstesi ved at røre haletudser. De skal være ikke-lydhør.
- Overføre omhyggeligt haletudse fra bedøvelsesmiddel til væv dækket petriskål.
- Sørg for, at badet elektrode lukker elektroporation kredsløb. Sikre, at elektroden er i kontakt med det våde væv; en direkte kontakt til haletudse er ikke nødvendig.
- Placer mikropipettespidsen tæt lugteorganet vha mikromanipulator.
- Trænge ind i huden, der dækker lugteorganet med pipettespidsen og forsigtigt fremføre spidsen i den centralt beliggende sensorisk neuron lag af de vigtigste lugteepitel eller vomeronasal epitel.
- Udløse positive square spændingsimpulser til at overføre farvestof i sensoriske neuroner. Påfør en enkelt spænding puls (f.eks., 25 V, puls længde 25 ms) eller tog med flere impulser (f.eks., 50 V, puls længde 300 usek, 400 ms serievarighed ved 200 Hz).
BEMÆRK: bestemme optimale spænding puls parametre for det ønskede omfang af mærkning. Reducere spændingsimpuls amplitude, varighed og antallet af gentagelser til at sænke antallet af mærkede celler. Anvend højere spænding puls amplitude, varighed og antallet af pulses for en mere udbredt mærkning. - Visualiser succesfulde farvestof ekstrudering og elektroporation ved udløste impulser ved hjælp af fluorescerende belysning af stereomikroskop. Farvestoffet spredes hurtigt i cellen kroppen og dendritceller efter vellykket elektroporering.
- Gentag trin 4,5-4,9 for anden lugteorganet af haletudse.
- Overfør haletudse i et bæger fyldt med frisk vand til nyttiggørelse. Efter ca. 5 min haletudserne vågne fra bedøvelsen og starte normale svømning bevægelser.
- Efter 24 timer den elektroporerede farvestof spreder i de sensoriske neuroner og i sidste ende når frem lugtekolben via axonal transport.
5. Montage Dyr til In Vivo Visualisering af celler og axonal Processer
- Bedøve haletudser i vand indeholdende 0,02% tricaine.
- Overfører omhyggeligt haletudser i et billeddannende kammer, fx en lille silicium gummi dækket petriskål med en haletudse-sized fordybning. </ Li>
- Skær et lille rektangel i en stribe af Parafilm. Dæk haletudse med Parafilm, forlader forreste telencephalon eksponeret gennem udskæringen vindue. Fastgør Parafilm med nåle på fad uden at skade den haletudse.
- Sørg haletudse er nedsænket i tilstrækkeligt vand indeholdende 0,02% tricaine.
- Monter afbildningskammeret på scenen af en opretstående multiphoton mikroskop eller konfokalmikroskop.
- Erhverve en tredimensionel stak af billeder af lugtekolben. Sørg for, at billeddannelse procedure er så kort som muligt og ikke overstiger 10-15 min.
- Returnere haletudse i normal vand i en separat tank og forhindre udsættelse for lys. Efter 5 minutter haletudse vågner fra anæstesi.
- Gentag trin 5,1-5,7 efter angivne tidsintervaller, f.eks., Hver dag.
6. Montage Dyr til Ex Vivo Visualisering af celler og axonal Processer
- Alternativt § 5af protokollen, skal du bruge en udskåret præparat hjerne til at visualisere de mærkede sensoriske neuroner.
- Bedøve og dræbe haletudse ved overskæring af hjernen ved overgangen til rygmarven. Udskære en blok af væv indeholdende de olfaktoriske organer, olfaktoriske nerver og den forreste telencephalon.
- Overfør vævsblokken til frog Ringer-opløsning og fjerne bindevæv med fine saks for at eksponere den ventrale side af hjernen.
- Overfør vævet blok til en afbildningskammeret og ordne det med en platin stel strengeinstrumenter med nylontråde.
- Monter afbildningskammeret på scenen af et konfokalt / multiphoton mikroskop.
- Erhverve en tredimensionel stak af billeder af lugtekolben.
7. Image Processing and Data Evaluation
- Optimere og anvende ikke-lokale midler til filtrering til at forbedre billedkvaliteten og visualisering af neuronale strukturer som beskrevet af Coupé, P. et al. 15.
BEMÆRK: Data fra billeddannelse eksperimenter i dybere væv lag af levende enheder er ofte støjende. - Skabe maksimal intensitet fremskrivninger af billedstakke for et overblik.
- For time-lapse screene imaging eksperimenter datasæt for enlige entydigt identificerbare axoner af sensoriske neuroner.
- Rekonstruere cellulær morfologi via software-assisteret sporing af neuronale processer som beskrevet af Peng et al. 16.
Representative Results
Den beskrevne protokol kan med held anvendes til elektroporation og in vivo visualisering af axonale processer af sensoriske neuroner i det olfaktoriske system bedøvede X. laevis, ved hjælp af konfokal laser-scanning eller multiphoton mikroskopi (figur 1).
Elektroporation tillader fluoroformærkede-koblede dextraner at indtaste og til hurtigt at sprede sig inde i cellerne i lugteorganet. Det er nyttigt at anvende fluorescerende belysning til at kontrollere en vellykket mærkning efter udløsning af spænding impulser. Afhængigt af elektroporation parametre, f.eks., Pipette modstand, grupper af celler (figur 2A, B) eller enkelte celler (figur 2C) af lugteorganet mærkes. Axoner af mærkede sensoriske neuroner kan visualiseres i lugtenerven (figur 2D) og axonale processer kan også observeret i lugtekolben, som regel 24 timer efter vellykket elektroporering(Figur 3). Elektroporering af grupper af sensoriske neuroner tillader visualisere de grove forbindelsesmønstre i lugtekolben (figur 3A). Enkelt celle elektroporation kan anvendes til at undersøge individuelle axonale projektion mønstre axonale bifurkationer og tilslutningsmuligheder til glomerulære strukturer i lugtekolben (figur 3C-E).
Gennemsigtige albino haletudser af X. laevis tilladelse in vivo konfokal eller multiphoton billeddannelse af mærkede sensoriske neuroner i den intakte hjerne bedøvet haletudse. Udviklingen af axonal vækstmønstre kan spores over flere dage / uger ved gentagen in vivo visualisering af samme mærkede sensorisk neuron (figur 4). Afhængig af modenhed sensorisk neuron på det tidspunkt af elektroporation Axon mønster i lugtekolben kan variere betydeligt. Modne neuroner allerede har kunstfærdige axonale grene, at funktionen toted områder forbundet til glomeruli. Den axonal vækst mønster af modne neuroner er temmelig stabil, men forlængelsen af Axon filialer og finpudsninger af glomerulære totter er observerbare (figur 4A-E). Sensoriske neuroner kan observeres in vivo i længere perioder, f.eks., Mere end tre uger (Figur 4F-I). På den anden side, axoner umodne neuroner stadig er i færd med indledende vækst, ikke besidder tuftede arborizations og er endnu ikke forbundet til deres endelige glomerulære mål. Den eksperimentelle protokol tillader sporing udviklingen af disse neuroner under modning, f.eks., Axonforlængelse, bifurkationer og etablering af tuftede arborizations (figur 4J-L). For flere eksempler se også Hassenklöver og Manzini 12.
Figur 1. Skematisk oversigt over forsøgsprotokol. (A) Sensoriske neuroner i hovedsagen lugteepitel (MOE) eller vomeronasal organ (VNO) af lugteorganet af bedøvede X. laevis larver mærkes via elektroporation under anvendelse af en glaspipette fyldt med fluorescerende dextran opløsning. Axoner af mærkede neuroner kan følges gennem lugtenerven (ON), og til sidst nå lugtekolben (OB). (B) Den haletudse er bedøvet, og de mærkede neuroner er gentagne gange undersøgt ved hjælp af en konfokal eller multiphoton mikroskop i bestemte tidsintervaller. (C) Den yderligere udvikling af axonale vækstmønstre mærkede celler kan følges over tid spænder af dage til uger.
Figur 2. Electroporation af sensoriske neuroner i lugteorganet. (A) Elektroporering med lav modstand pipetter fører til mærkning af flere celler i lugteorganet. I dette repræsentativt eksempel flere olfaktoriske receptor neuroner (ORNs, fyldt pilespidser) og to søjleformede-formede understøttende celler (SCS, skjult) blev plettet. Stiplede linjer afgrænse grænser lugteepitelet (OE). (B) Raffinering elektroporationen parametre, f.eks., Hvilket øger pipette modstand, begrænser antallet af mærkede celler. I dette eksempel blev en enkelt sensorisk neuron (udfyldte pilespidser) og en tilstødende støtte celle (asterisk) farves efter elektroporering. Bemærk enkelt Axon forlader lugteepitelet (åbne pilespidser). (C) Vellykket enkelt celle elektroporation fører til eksklusiv mærkning af en individuel sensorisk neuron (fyldt pilespids) og dens tilsluttede Axon (åbne pilespidser) i det olfaktoriske epitel. 
Figur 3. Visualisering olfaktoriske Axon fremskrivninger i det udskårne lugtekolben. (A) Den grove topologi axonale fremskrivninger af sensoriske neuroner i lugtekolben kan visualiseres ved hjælp af lavere modstand elektroporeringsteknikker pipetter. En lugtekolbe halvkugle og dens tilhørende lugtenerveimpuls (ON) er afbildet. Fire dextraner er koblet til forskellige fluoroforer blev elektroporeret ved fire fjerntliggende steder af lugteorganet: lateral (grøn), intermediære (gul), mediale MOE (rød) og VNO (orange). Dette gør det muligt at visualisere tilbehøret lugtekolben (AOB) og de tre vigtigste projektion områder af de vigtigste lugtekolben (MOB). 
Figur 4. In vivo time-lapse billeddannelse af enkelte olfaktoriske neuron axoner. (AE)Efter vellykket enkelt celle elektroporation det mærkede axon kan gentagne gange visualiseres i lugtekolben (OB). Dette eksempel viser en enkelt axon, der blev undersøgt for en uge. Den overordnede morfologi ændrer ikke betydeligt, og to store forgreningspunkterne kan identificeres (åbne pilespidser). Bemærk, at over tidsforløbet, en glomerulær tot gennemgår løbende reduktion (fyldt pilespids), mens de to andre glomerulære totter forblive stabile (stjerne). (FI) Dette repræsentativt eksempel viser levedygtigheden af langsigtede observationer som denne specifikke Axon blev undersøgt i mere end tre uger. Ingen tilsyneladende ændring af sin vækst mønster kan påvises. (JL) Et eksempel på en umoden sensorisk axon i processen med vækst er afbildet. Det har endnu ikke tilsluttet glomeruli og karakteristiske glomerulære totter mangler. Efter 5 dage axonale grene er aflange, Axon tvedelt flere gange og fine arborizations eretableret.
Discussion
Den eksperimentelle fremgangsmåde er beskrevet her tillader mærkning af sensoriske neuroner i lugteorganet af larvernes X. laevis ved elektroporering af fluorofor-koblede dextraner og efterfølgende visualisering af sensorisk axon vækst i levende dyr. Ved at variere parametrene for in vivo elektroporation er det muligt at kontrollere antallet af mærkede sensoriske neuroner. Det er derved muligt at mærke store grupper af neuroner af en sensorisk epithel meget få eller endda enkelte celler.
At sikre den ønskede forlænge af neuronal mærkning er det vigtigt at være særlig forsigtig mikropipetten egenskaber og elektroporation impulser. Højere pipette modstand og reduktion af spænding puls amplitude, varighed og antal gentagelser kan reducere mængden af mærkede celler, hvorimod faldende pipette modstand og højere spænding impulsamplitude, varighed og antal impulser kan føre til mere udbredt mærkning. The brug af fluorescerende dextraner for elektroporation giver øjeblikkelig visuel feedback, hvis de anvendte indstillinger er passende. Vær forsigtig, at bruge parametre for amplitude, varighed og antal pulser, der overskrider de værdier, der er fastsat i protokollen, kan potentielt føre til celleskader eller endda celledød 17. Tilstoppede eller knækkede tips af mikropipetter kan også hindre vellykket elektroporation.
In vivo elektroporation i lugteorganet af X. laevis er begrænset til larvestadier siden hud postmetamorphotic frøer er hårdere og ikke let kan gennemtrænges med en mikropipette. In vivo visualisering af neuronale processer kan hindres ved spredning af excitation / emission lys i dybere områder i hjernen eller ved blodkar. Dette problem bliver særlig tydelig i højere larvestadier på grund af en større hjerne og kan føre til støjende signaler gør klar identifikation af fine axonale processer vanskeligere.
Anvendelsen af protokollen er ikke begrænset til olfaktoriske sensoriske neuroner, men kan også anvendes til at studere andre celletyper, f.eks., Stamceller / progenitorceller af neurogene områder af hjernen eller udvikle mitral celler i lugtekolben. Derudover kan også anvendes påvises teknik i kombination med calcium følsomme dextraner eller injiceres membran-permeable calcium farvestoffer til at få funktionel information om det mærkede neuron og / eller den tilsluttede kredsløb 7,19. Tilgængeligheden af en bred vifte af fluoroforer koblet til dextraner tillader mærkning af flere individuelle celler eller populationer med forskellige farver. Også plasmid-DNA-opløsning, for eksempel koder for fluorescerende proteiner, er egnet til elektroporation og kan yderligere forbedre versatility og nytten af teknikken 6. Protokollen kan yderligere forbedret, så den kombinerede elektroporation af dextraner og DNA eller opladede morpholinos at manipulere genekspression 13,17.
Den beskrevne fremgangsmåde bestemt repræsenterer et nyt værktøj til at undersøge komplekse og endnu ikke fuldt forstået processer, der regulerer axonal vejledning i hvirveldyr olfaktoriske system.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
