Protocol
MERK: Animal håndtering og eksperimenter ble utført som godkjent av Göttingen universitet komité for etikk i forsøk med dyr.
1. Utarbeidelse av Instrumenter og Pipette Fabrication
- Sørg for at elektroporeringsmetoden oppsettet består av et stereomikroskop med stor arbeidsavstand og er utstyrt med fluorescerende belysning og filtersett for brukte fargestoff.
- For elektroporering bruke enten en dedikert enkelt celle electroporator eller et generisk firkantet puls generator festet til et oscilloskop. Koble electroporator utganger til en pipette holder og et bad elektrode. Koble den positive terminalen av pulsgeneratoren til mikropipette holderen og den negative terminalen til badelektroden. Sikrer både pipetten holderen og badekaret elektroden inneholder sølvtråder som er belagt med et tynt lag av sølvklorid.
- Monter pipette holderen på en micromanipulator å tillate presis posisjonering. Dikte electroporation mikropipetter fra borsilikatglass kapillærer med intern filament.
- Bruk en horisontal mikropipette avtrekker og anvende en modifisert protokoll for fabrikasjon av pipetter for patch clamp eksperimenter som beskrevet av Bestman et al., 13.
- Tilpasse parametrene for å frembringe et lengre skaft og en mindre spissåpning som resulterer i en høyere pipette motstand på omkring 15 til 20 MOhm for enkelt celle elektroporering. Pipetten motstand bør være lavere, for eksempel 3-4 MOhm, for merking av grupper av celler.
- Mål pipette motstand enten direkte med en dedikert encellet electroporator eller beregne den med Ohms lov etter måling strømmen med et oscilloskop etter påføring av et definert spenningspuls.
2. Utarbeidelse av Electroporation Solution
- Oppløse fluorophore-coupled dekstran i frosk ringe (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM MGCl 2, 5 mM glukose, 5 mM Na-pyruvat, 10 mM HEPES, regulert til pH 7,8, ble osmolariteten 230 mOsmol / l) ved en konsentrasjon på 3 mM. Cellene kan ikke bli så sterkt merket hvis lavere fargestoff konsentrasjoner brukes. Forbered et stort volum stamløsning og del den i små porsjoner. Fryse dem for lagring (stabil i måneder).
MERK: Dekstraner er tilgjengelige i forskjellige størrelser og en rekke utslipps / eksitasjon spektra (f.eks Alexa 488-dekstran 10kD, Alexa 546-dekstran 10kD, Alexa 568-dekstran 10kD, Alexa 594-dekstran 10kD, TMR-dekstran 3KD.). - Fylle mikropipette med en langstrakt pipettespissen med et lite volum av dekstranoppløsningen (1-5 ul). Flick nøye mikropipette med fingeren for å fjerne rester av luftbobler fra pipettespissen.
- Monter mikropipette i pipetten holderen. Pass på at sølvtråden inne i pipetten er i kontakt med fargeløsning.
3. Valg av Larve X. laevis </ Em>
- Bruk albino larver av X. laevis for eksperimentene. Villtype dyr besitter pigmentfylte Melanophores som viser autofluorescence utslipp under confocal / multiphoton bildebehandling og er derfor ikke egnet for de beskrevne eksperimenter.
- Iscenesette premetamorphotic rumpetroll etter Nieuwkoop og Faber 14. Velg rumpetroll av trinn 45-53 for forsøkene.
4. Electroporation av fluorophore-koblede Dekstraner
- Plassere et lite stykke vev i en petriskål og dekker den med et lite volum vann inneholdende 0,02% Tricaine (Etyl-3-aminobenzoat metansulfonat, justert til pH 7).
- Anesthetize rumpetrollene i vann som inneholder 0,02% Tricaine. Etter noen minutter dyrene slutte å bevege seg. Bekreft skikkelig anestesi ved å berøre rumpetroll. De bør være ikke-responsive.
- Overføre nøye rumpetroll fra narkosen til vevet dekket petriskål.
- Kontroller at badekaret elektrode lukker elektroporering krets. Sikre at elektroden er i kontakt med den våte vev; direkte kontakt til rumpetroll er ikke nødvendig.
- Plasser mikropipette spissen nær lukteorganet ved hjelp av micromanipulator.
- Trenge gjennom huden dekker lukte orgel med pipettespissen og forsiktig fremme tuppen inn i sentralt beliggende sensoriske nevron lag av hoved olfactory epitel eller Vomeronasale epitel.
- Utløse positive kvadratspenningsimpulser å overføre fargestoff inn sensoriske nerveceller. Påfør en enkelt spenningspuls (f.eks., 25 V, pulslengde 25 msek) eller tog i flere pulser (f.eks., 50 V, pulslengde 300 usek, 400 msek tog varighet på 200 Hz).
MERK: Bestem optimale spenningspulsparametere for ønsket forlengelse av merking. Redusere spenningspuls amplitude, varighet og antall repetisjoner for å redusere antall merkede celler. Påfør høyere spenning puls amplitude, varighet og antall pulses for en mer utbredt merking. - Visualisere vellykket fargestoff ekstrudering og elektroporering ved utløst pulser bruker fluorescerende belysning av stereomikroskopet. Fargestoffet sprer seg raskt inn i cellen kroppen og dendrite etter vellykket elektroporering.
- Gjenta trinn 4.5 til 4.9 for den andre lukteorgan rumpetroll.
- Overfør rumpetroll i et beger fylt med ferskvann for å bli frisk. Etter ca. 5 min rumpetrollene våkner fra narkose og begynne normale svømmebevegelser.
- Etter 24 timer på elektroporert fargestoff sprer seg i de sensoriske nerveceller og til slutt når frem til luktelappen via aksonal transport.
5. Monterings Dyr for In Vivo Visualisering av celler og aksonal Prosesser
- Anesthetize rumpetrollene i vann som inneholder 0,02% Tricaine.
- Nøye overføre rumpetroll i en avbildning kammer, for eksempel, dekket en liten silikongummi petriskål med en rumpetroll-sized fordypningen. </ Li>
- Skjær et lite rektangel i en stripe av Parafilm. Dekk til rumpetroll med Parafilm, forlater anterior telencephalon eksponert gjennom cut-out window. Fest Parafilm med nåler på fatet uten å skade rumpetroll.
- Sørg for at rumpetroll er neddykket i tilstrekkelig vann som inneholder 0,02% Tricaine.
- Monter bildekammeret på scenen av en oppreist multiphoton mikroskop eller konfokal mikroskop.
- Anskaffe en tredimensjonal stabel med bilder av luktelappen. Kontroller at avbildningsprosedyren blir så kort som mulig og ikke overskrider 10 til 15 min.
- Returner rumpetroll i vanlig vann i en egen tank og hindre eksponering for lys. Etter 5 min, våkner rumpetroll fra anestesi.
- Gjenta trinn 5.1 til 5.7 etter angitte tidsintervaller, f.eks., Hver dag.
6. Montering Dyr for Ex Vivo Visualisering av celler og aksonal Prosesser
- Alternativt § 5av protokollen, kan du bruke en utskåret hjernen forberedelse til å visualisere de merkede sensoriske nerveceller.
- Bedøve og drepe rumpetroll ved tran av hjernen ved overgangen til ryggmargen. Skjære en blokk med vev som inneholder olfactory organer, olfactory nerver og fremre telencephalon.
- Overfør vevsblokk til frosk ringe løsning og fjerne bindevev med fine saks for å eksponere ventral side av hjernen.
- Overfør vevet blokk til en avbildningskammeret og fikse det med en platina ramme strenge med nylontråder.
- Monter bildekammeret på scenen av en confocal / multiphoton mikroskop.
- Anskaffe en tredimensjonal stabel med bilder av luktelappen.
7. bildebehandling og data evaluering
- Optimalisere og bruke ikke-lokale hjelp av filtrering for å forbedre bildekvaliteten og visualisering av nevrale strukturer som beskrevet av Coupé, P. et al. 15.
MERK: Data fra bildebehandling eksperimenter i dypere vev lag av levende eksemplarer er ofte støyende. - Lag maksimal intensitet projeksjoner av bildestakker for en oversikt.
- For time-lapse bildebehandling eksperimenter skjermen datasett for enkelt entydig identifiserbare aksoner av sensoriske nerveceller.
- Rekonstruere cellulær morfologi via software-assistert sporing av nevronale prosesser som beskrevet av Peng et al. 16.
Representative Results
Den beskrevne protokollen kan med hell brukes for elektroporering og in vivo visualisering av aksonale prosesser av sensoriske nerveceller i luktesystemet bedøvet X. laevis, ved hjelp av konfokal laser-scanning eller multiphoton mikroskopi (figur 1).
Electroporation tillater fluoroforpar-coupled dekstraner å gå inn og raskt spre seg inne i cellene i lukteorganet. Det er nyttig å bruke fluoriserende belysning for å verifisere vellykket merking etter utløsning av spenningsimpulser. Avhengig av electroporation parametre, f.eks., Pipette motstand, grupper av celler (figur 2A, B) eller enkeltceller (figur 2c) i det olfaktoriske organ er merket. Aksoner av merkede sensoriske nevroner kan visualiseres i det olfaktoriske nerve (figur 2D) og aksonale prosesser kan observeres også i luktelappen, vanligvis 24 timer etter elektroporering vellykket(Figur 3). Electroporation grupper av sensoriske nevroner lar visualisere de grove ledningsmønstre i luktelappen (figur 3A). Enkelt celle elektroporering kan brukes til å undersøke individuelle aksonale projeksjon mønstre, aksonale bifurcations og tilkobling til glomerulær strukturer i luktelappen (Figur 3C-E).
Transparente albino rumpetroll av X. laevis tillatelse in vivo konfokal eller multiphoton avbildning av merket sensoriske nerveceller i den intakte hjerne bedøvet rumpetroll. Utviklingen av aksonal vekst mønstre kan spores over flere dager / uker etter gjentatt in vivo synliggjøring av det samme som er merket sensorisk neuron (figur 4). Avhengig av modenhet av sensoriske nervecellen på tidspunktet for elektroporering axon mønster i luktelappen kan variere betydelig. Modne nevroner allerede har forseggjort aksonale grener som har tufted områder knyttet til glomeruli. Nervevekstmønster av modne nevroner er ganske stabil, men forlengelse av axon grener og avgrensninger av glomerulær dusker er observerbare (figur 4A-E). Sensoriske nevroner kan observeres in vivo i lengre tidsperioder, f.eks., Mer enn tre uker (figur 4F-I). På den annen side, aksoner av umodne neuroner fremdeles er i ferd med innledende vekst, ikke besitter tuftede arborizations og har ennå ikke er koplet til sine endelige glomerulær mål. Den eksperimentelle protokollen tillater sporing utviklingen av disse nevronene under modning, f.eks., Axon forlengelse, bifurcations og etablering av tuftede arborizations (figur 4J-L). For flere eksempler se også Hassenklöver og Manzini 12.
Figur 1. Skjematisk oversikt over forsøksprotokollen. (A) Sensoriske neuroner i hoved olfaktoriske epitel (MOE) eller vomeronasal organ (VNO) av det olfaktoriske organ for bedøvet X. laevis larver er merket via elektroporering ved anvendelse av en glass-pipette fylt med fluorescerende dekstran-løsning. Aksonene av merket nevroner kan følges gjennom luktenerven (ON) og til slutt komme til luktelappen (OB). (B) Den rumpetroll er bedøvet og merket nevroner er gjentatte ganger undersøkt ved hjelp av en confocal eller multiphoton mikroskop i bestemte tidsintervaller. (C) Den inkrementell utvikling av aksonale vekstmønstre merkede celler kan følges over tid spenn av dager til uker.
Figur 2. Electroporation av sensoriske nevroner i lukteorganet. (A) Electroporation med lav motstand pipetter fører til merking av flere celler i lukteorganet. I dette representativt eksempel flere olfactory reseptor nevroner (Orns, fylt pilspisser) og to søyleformede støtte celler (SCS, stjerner) ble farget. Stiplede linjer markere grensene til olfactory epitel (OE). (B) Raffinering electroporation parametre, f.eks., Øker pipette motstand, begrenser antall merkede celler. I dette eksempel ble en enkelt sensorisk neuron (fylte pilspisser) og en tilstøtende støttecelle (asterisk) farget etter elektroporering. Legg merke til enkelt axon forlater olfactory epitel (åpne pilspisser). (C) Vellykket enkelt celle elektroporering fører til eksklusiv merking av en enkelt sensorisk nevron (fylt pilspiss) og dens tilkoblede axon (åpne pilspisser) i olfactory epitel. 
Figur 3. Visualisering olfactory axon anslagene i utskårede luktelappen. (A) Den grove topologien av aksonale projeksjoner av sensoriske nevroner i luktelappen kan visualiseres ved hjelp av lavere motstand electroporation pipetter. En luktelappen halvkule og dens tilhørende luktenerven (ON) er avbildet. Fire dekstraner koblet til forskjellige fluoroforene ble elektroporert på fire fjerne steder av lukteorganet: lateral (grønn), middels (gul), mediale MOE (rød) og VNO (oransje). Dette gjør det mulig å visualisere tilbehøret luktelappen (AOB) og de tre viktigste projeksjon felt av hovedluktelappen (MOB). 
Figur 4. In vivo time-lapse avbildning av enkeltlukte nevroner aksoner. (AE)Etter vellykket enkelt celle elektroporering den merkede axon gjentatte ganger kan visualiseres i luktelappen (OB). Dette eksempel akson viser et individ som ble undersøkt etter en uke. Den generelle morfologi endrer ikke vesentlig og to store forgreningspunkter kan identifiseres (åpne pilspisser). Legg merke til at over tid selvfølgelig, gjennomgår en glomerulær tuft kontinuerlig reduksjon (fylt pilspiss), mens de andre to glomerulære dusker forbli stabile (skjult). (FI) Dette representativt eksempel viser levedyktighet av langsiktige observasjoner som denne spesifikke axon ble undersøkt i mer enn tre uker. Ingen tydelig forandring av sin vekstmønster kan detekteres. (JL) Et eksempel på en umoden sensorisk axon i prosessen med vekst er avbildet. Det har ennå ikke koblet til glomeruli og karakteristiske glomerulær dusker mangler. Etter fem dager aksonale grenene er langstrakte, axon bifurcated flere ganger og fine arborizations eretablert.
Discussion
Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her tillater merking av sensoriske neuroner av det olfaktoriske organ over larve-X. laevis ved elektroporering av fluoroforen-koplet dekstraner og påfølgende visualisering av sensorisk axon vekst i levende dyr. Ved å variere parametrene av in vivo elektroporering er det mulig å kontrollere antallet av merkede sensoriske nevroner. Det er dermed mulig å merke store grupper av nerveceller av en sensorisk epitel, svært få eller til og med enkeltceller.
For å sikre den ønskede forlengelse av neuronal merking er det viktig å være spesielt forsiktig med mikropipette egenskaper og electroporation pulser. Høyere motstandsverdier pipettes og reduksjon av spenningspuls amplitude, varighet og antall repetisjoner kan redusere mengden av merkede celler, mens avtagende pipettesmotstander og høyere spenningspuls amplitude, varighet og antall pulser som kan føre til mer utbredt merking. The bruk av fluorescerende dekstraner for elektroporering gir umiddelbar visuell tilbakemelding hvis de anvendte innstillingene er riktige. Vær forsiktig at bruk av parametere for amplitude, varighet og antall pulser som overstiger verdiene gitt i protokollen kan potensielt føre til celleskade eller celledød 17. Tette eller ødelagte tips av mikropipetter kan også hindre vellykket elektroporering.
In vivo elektroporering i lukteorganet i X. laevis er begrenset til larvestadier siden huden av postmetamorphotic frosker er tøffere og kan ikke være lett penetrert med en mikropipette. Den in vivo synliggjøring av neuronale prosesser kan bli hindret ved spredning av eksitasjon / emisjon lys i dypere områder av hjernen eller ved blodkar. Dette problemet blir spesielt tydelig i høyere larvestadier som følge av et større hjernen og kan føre til støysignaler som gjør den klar identifikasjon av fine aksonale prosesser vanskeligere.
Anvendelsen av protokollen er ikke begrenset til olfaktoriske sensoriske neuroner, men kan også anvendes for å studere andre celletyper, f.eks., Stilk / progenitorceller av de nevrogene soner av utviklingen av hjernen eller mitral celler av luktelappen. I tillegg er det demonstrert teknikken kan også anvendes i kombinasjon med kalsiumfølsomme dekstraner eller injisert membran-gjennomtrengelige kalsiumsfargestoffer for å få funksjonell informasjon om den merkede nevroner og / eller den tilkoplede kretser 7,19. Tilgjengeligheten av et bredt spekter av fluoroforer koplet til dekstraner tillater merking av flere enkeltceller eller populasjoner med forskjellige farger. Også plasmid-DNA-oppløsning, for eksempel som koder for fluorescerende proteiner, er egnet for elektroporering og kan ytterligere forbedre versatiliTy og nytten av teknikken 6. Protokollen kan ytterligere bli forbedret slik at den kombinerte dekstraner og elektroporering av DNA eller ladede morpholinos å manipulere genekspresjon 13,17.
Den beskrevne metoden representerer sikkert et nytt verktøy for å undersøke det komplekse og fortsatt ikke fullt ut forstått prosesser som regulerer aksonal veiledning i virveldyr luktsystemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
- Huard, J. M., Youngentob, S. L., Goldstein, B. J., Luskin, M. B., Schwob, J. E. Adult olfactory epithelium contains multipotent progenitors that give rise to neurons and non-neural cells. J. Comp. Neurol. 400 (4), 486-4810 (1998).
- Schwob, J. E. Neural regeneration and the peripheral olfactory system. Anat. Rec. 269 (1), 33-49 (2002).
- Leung, C. T., Coulombe, P. A., Reed, R. R. Contribution of olfactory neural stem cells to tissue maintenance and regeneration. Nat. Neurosci. 10 (6), 72-726 (2007).
- Lodovichi, C., Belluscio, L. Odorant receptors in the formation of the olfactory bulb circuitry. Physiology (Bethesda. 27 (4), 212-2110 (2012).
- Mori, K., Sakano, H. How is the olfactory map formed and interpreted in the mammalian brain). Annu. Rev. Neurosci. 34, 467-499 (2011).
- De Vry, J., et al. In vivo electroporation of the central nervous system: a non-viral approach for targeted gene delivery. Prog. Neurobiol. 92 (3), 227-244 (2010).
- Hovis, K. R., Padmanabhan, K., Urban, N. N. A simple method of in vitro electroporation allows visualization, recording, and calcium imaging of local neuronal circuits. J. Neurosci. Methods. 191 (1), 1-10 (2010).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Med. Biol. Eng. Comput. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation. 70 (4-5), 148-154 (2002).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), (2008).
- Gliem, S., et al. Bimodal processing of olfactory information in an amphibian nose: odor responses segregate into a medial and a lateral stream. Cell. Mol. Life Sci. 70 (11), 1965-1984 (2013).
- Hassenklöver, T., Manzini, I. Olfactory wiring logic in amphibians challenges the basic assumptions of the unbranched axon concept. J. Neurosci. 33 (44), 17252-1710 (2013).
- Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. -L., Cline, H. T. In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules. Nat. Protoc. 1 (3), 1272-1210 (2006).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Publishing, Inc. New York and London. (1994).
- Coupé, P., Munz, M., Manjón, J. V., Ruthazer, E. S., Collins, D. L. A CANDLE for a deeper in vivo insight. Med. Image Anal. 16 (4), 849-864 (2012).
- Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nat. Biotechnol. 28 (4), 348-353 (2010).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Nezlin, L. P., Schild, D. Individual olfactory sensory neurons project into more than one glomerulus in Xenopus laevis tadpole olfactory bulb. J. Comp. Neurol. 481 (3), 233-239 (2005).
- Nagayama, S., et al. In vivo simultaneous tracing and Ca2+ imaging of local neuronal circuits. Neuron. 53 (6), 789-803 (2007).
