Protocol
HINWEIS: Animal Handling und Experimente wurden durchgeführt, wie durch die Universität Göttingen Kommission für Ethik in Tierversuchen bestätigt.
1. Herstellung der Instrumente und Pipette Fabrication
- Stellen Sie sicher, dass die Elektroporation Setup besteht aus einem Stereomikroskop mit großen Arbeitsabstand und mit Fluoreszenzbeleuchtung und Filtersätze für das verwendete Farbstoff ausgestattet.
- Zur Elektroporation verwenden entweder eine dedizierte Einzelzelle Elektroporator oder eine generische Rechteckimpulsgenerator an ein Oszilloskop angeschlossen. Schließen Sie die Elektroporator Ausgänge in einen Pipettenhalter und einem Bad Elektrode. Den Pluspol des Impulsgenerators an die Mikropipette Halter und dem negativen Anschluß zu dem Bad Elektrode. Sorgen sowohl der Pipettenhalter und die Badelektrode enthalten Silberdrähte mit einer dünnen Schicht von Silberchlorid überzogen ist.
- Montieren Sie den Pipettenhalter auf einem Mikromanipulator zur exakten Positionierung ermöglichen. Fabrizieren Elektroporation Mikropipetten aus Borosilikatglas Kapillaren mit Innen Filament.
- Verwenden eine horizontale Pipettenziehvorrichtung und Anwendung einer modifizierten Protokoll für die Herstellung von Pipetten für Patch-Clamp-Experimente wie Bestman et al. 13 beschrieben.
- Parameter anzupassen, um einen längeren Schaft und einen kleineren Spitzenöffnung, was zu einer höheren Pipettenwiderstand von ca. 15-20 MOhm für Einzelzelle Elektroporation herzustellen. Die Pipettenwiderstand niedriger sein sollte, beispielsweise, 3-4 MOhm, zur Beschriftung von Gruppen von Zellen.
- Messung der Pipettenwiderstand entweder direkt mit einer eigenen Einzelzell -Elektroporator oder berechnen sie mit dem Ohmschen Gesetz nach Messen des Stromflusses mit einem Oszilloskop nach dem Anlegen eines Spannungsimpulses definiert.
2. Herstellung der Lösung Electroporation
- Löse Fluorophor-gekoppelten Dextran in Frosch Rufton (98 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM CaCl 2, 2 mM MgCll 2, 5 mM Glucose, 5 mM Na-Pyruvat, 10 mM HEPES, pH 7,8 eingestellt, Osmolarität betrug 230 mOsmol / l) bei einer Konzentration von 3 mM. Die Zellen können nicht so hell markierten niedrigeren Farbstoffkonzentrationen verwendet werden. Bereiten Sie ein großes Volumen Stammlösung und teilen sie in kleine Aliquots. Frieren Sie sie für die Lagerung (über Monate stabil).
HINWEIS: Dextrane sind in verschiedenen Größen und einer Vielzahl von Emissions / Anregungsspektren (zB Alexa 488-Dextran 10kD, Alexa 546-Dextran 10kD, Alexa 568-Dextran 10kD, Alexa 594-Dextran 10kD, TMR-Dextran 3 kD liegen.). - Verfüllung der Mikropipette mit einem langgestreckten Pipettenspitze mit einem kleinen Volumen von Dextran-Lösung (1-5 ul). Sorgfältig Fingern an die Mikropipette mit dem Finger, um Restluftblasen aus der Pipettenspitze zu entfernen.
- Montieren Sie die Mikropipette in der Pipettenhalter. Stellen Sie sicher, dass der Silberdraht in der Pipette ist in Kontakt mit der Farbstofflösung.
3. Auswahl der Larven X. laevis </ Em>
- Verwenden Albino Larven von X. laevis für die Experimente. Wildtyp-Tiere besitzen Pigment gefüllten Melanophoren, die Autofluoreszenzemission während konfokalen / Multiphotonen-Bildgebung zeigen und daher nicht geeignet für den beschriebenen Experimenten.
- Inszenieren premetamorphotic Kaulquappen nach Nieuwkoop und Faber 14. Wählen Kaulquappen der Stufen 45-53 für die Experimente.
4. Elektroporation von Fluorophor-gekoppelten Dextrane
- Legen Sie ein kleines Stück Gewebe in einer Petrischale und decken Sie es mit einer kleinen Menge Wasser, das 0,02% Tricaine (Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat, auf pH 7 eingestellt).
- Anesthetize die Kaulquappen im Wasser, das 0,02% Tricaine. Nach einigen Minuten werden die Tiere nicht mehr bewegt. Überprüfen Sie die Narkose durch Berühren Kaulquappen. Sie sollten nicht reagiert werden.
- Die Kaulquappe aus der Narkose vorsichtig in das Gewebe abgedeckt Petrischale.
- Stellen Sie sicher, das Bad elektrOde schließt die Elektroporation Kreis. Sicherzustellen, dass die Elektrode in Kontakt mit dem Feuchttuch; ein direkter Kontakt mit der Kaulquappe ist nicht erforderlich.
- Positionieren Sie den Mikropipettenspitze in der Nähe des Riechorgan mit Hilfe der Mikromanipulator.
- Durchdringen die Haut, welche die Riechorgan mit der Pipettenspitze und vorsichtig voran die Spitze in der zentral gelegenen sensorischen Neuronenschicht des Haupt Riechepithel oder vomeronasalen Epithel.
- Auslösen positive quadratische Spannungsimpulse an Farbstoff in sensorischen Neuronen übertragen. Anwendung einer einzigen Spannungspuls (z. B. 25 V, Impulslänge 25 msec) oder Zügen von mehreren Impulsen (z. B. 50 V, Pulslänge von 300 & mgr; s, 400 ms Folgedauer bei 200 Hz).
HINWEIS: Bestimmen Sie die optimale Spannungspulsparameter für den gewünschten Umfang der Kennzeichnung. Spannung verringern Impulsamplitude, Dauer und Anzahl der Wiederholungen, die Zahl der markierten Zellen zu senken. Anwendung höherer Spannung die Impulsamplitude, Dauer und Anzahl von pulses für eine breitere Markierung. - Visualisieren erfolgreiche Farbstoff Extrusion und Elektroporation von ausgelösten Impulse mit Fluoreszenzbeleuchtung des Stereomikroskops. Der Farbstoff breitet sich schnell in Zellkörper und Dendriten nach erfolgreicher Elektroporation.
- Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,9 für den zweiten Riechorgan der Kaulquappe.
- Übertragen Sie die Kaulquappe in einen Becher mit frischem Wasser für die Wiederherstellung gefüllt. Nach ca. 5 min die Kaulquappen aufwachen aus der Narkose und starten normalen Schwimmbewegungen.
- Nach 24 Stunden das elektroporierte Farbstoff Spreads in den sensorischen Neuronen und erreicht den Riechkolben über axonalen Transport schließlich.
5. Montage Tiere für die in vivo Visualisierung von Zellen und Nervenbahnen steuert Prozesse
- Anesthetize die Kaulquappen im Wasser, das 0,02% Tricaine.
- Sorgfältig übertragen Kaulquappen in eine Abbildungskammer, zB, überdachte ein kleines Silikongummi Petrischale mit einer Kaulquappe großen Aussparung. </ Li>
- Schneiden Sie ein kleines Rechteck in einem Streifen Parafilm. Decken Sie die Kaulquappe mit dem Parafilm, so dass die vordere Telenzephalon durch die ausgeschnittenen Fenster belichtet. Befestigen Sie den Parafilm mit Nadeln auf dem Teller ohne Verletzung der Kaulquappe.
- Achten Sie darauf, die Kaulquappe wird in ausreichend Wasser mit 0,02% Tricaine getaucht.
- Montieren Sie den Imaging-Kammer auf der Bühne eines aufrechten Multiphotonen-Mikroskop oder konfokalen Mikroskop.
- Erwerben eines dreidimensionalen Stapel von Bildern des Riechkolbens. Sicherzustellen, dass das Bildgebungsverfahren ist so kurz wie möglich und ist 10-15 min nicht überschreiten.
- Liefert die Kaulquappe in normales Wasser in einem separaten Tank und verhindern, dass im Licht. Nach 5 min, wacht die Kaulquappe aus der Narkose.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.7 nach bestimmten Zeitabständen, z. B. täglich.
6. Montage Tiere für die ex vivo Visualisierung von Zellen und Nervenbahnen steuert Prozesse
- Alternativ zu Abschnitt 5des Protokolls, verwenden Sie ein ausgeschnitten Gehirn Vorbereitung, um die markierten sensorischen Neuronen zu visualisieren.
- Anesthetize und töten die Kaulquappe durch Durchtrennung des Gehirns am Übergang zum Rückenmark. Auszuschneiden einen Block von Gewebe, das die Geruchsorgane, die Geruchsnerven und die vordere Telenzephalon.
- Übertragen Sie die Gewebeblock zu Froschringerlösung und entfernen Bindegewebe mit einer feinen Schere, um die Bauchseite des Gehirns aus.
- Übertragen Sie die Gewebeblock zu einer Abbildungskammer und befestigen Sie sie mit einem Platin-Rahmen mit Nylonfäden bespannt.
- Montieren Sie den Imaging-Kammer auf der Bühne eines konfokalen / Multiphotonen-Mikroskop.
- Erwerben eines dreidimensionalen Stapel von Bildern des Riechkolbens.
7. Bildverarbeitung und Datenauswertung
- Optimieren und anzuwenden, nicht lokale mittels Filterung, um die Bildqualität und die Visualisierung von neuronalen Strukturen zu verbessern, wie durch Coupé, P. et al. 15.
HINWEIS: Die Daten aus bildgebenden Experimenten in tieferen Gewebeschichten lebender Exemplare sind oft laut. - Erstellen maximale Intensität Projektionen der Bildstapel für einen Überblick.
- Für Zeitraffer Bildschirm Imaging Experimente Datensätze für Einzel eindeutig identifizierbar Axone der sensorischen Neuronen.
- Rekonstruktion der Zellmorphologie über softwaregestützte Ablaufverfolgung von neuronalen Prozessen von Peng et al. 16 beschrieben.
Representative Results
Das beschriebene Protokoll kann erfolgreich für die Elektroporation und die in vivo Darstellung von axonalen Prozessen der sensorischen Neuronen des olfaktorischen Systems von betäubten X. angewendet laevis, mittels konfokaler Laser-Scanning oder Multiphotonen-Mikroskopie (Abbildung 1).
Elektroporation ermöglicht Fluorophor-gekoppelten Dextranen zu betreten und schnell innerhalb der Zellen des Riechorgan zu verbreiten. Es ist hilfreich, Fluoreszenzbeleuchtung gelten für erfolgreiche Kennzeichnung nach dem Auslösen der Spannungsimpulse zu überprüfen. Je nach den Parametern der Elektroporation, z. B., Pipettenwiderstand, Gruppen von Zellen (2A, B) oder einzelne Zellen (2C) des Riechorgan markiert sind. Axone markierten sensorischen Neuronen in den Riechnerv (2D) visualisiert und axonalen Prozesse können auch in den Riechkolben der Regel 24 Stunden nach Elektroporation erfolgreiche beobachtet werden,(Abbildung 3). Elektroporation von Gruppen von sensorischen Neuronen ermöglicht die Visualisierung der Grobverdrahtungsmuster im Riechkolben (3A). Einzelzelle Elektroporation kann angewendet werden, um einzelne axonalen Projektionsmuster, axonale Verzweigungen und Anbindung an Glomeruli im Riechkolben (3C-E) zu untersuchen.
Transparent Albino Kaulquappen von X. laevis Erlaubnis in vivo konfokalen oder Multiphotonen-Imaging von markierten sensorischen Neuronen im intakten Gehirn von anästhesiert Kaulquappe. Die Entwicklung der axonalen Wachstumsmuster kann über mehrere Tage / Wochen verfolgt werden durch in vivo Visualisierung der gleichen markierten sensorischen Neuronen (Abbildung 4) wiederholt. Je nach Laufzeit der sensorischen Neuronen im Zeitpunkt der Elektroporation das Axon Muster im Riechkolben kann erheblich variieren. Ältere Neuronen bereits aufwendige axonalen Verzweigungen, die Büschel verfügen besitzened Bereichen verbunden Glomeruli. Die axonalen Wachstumsmuster von reifen Neuronen ist ziemlich stabil, aber Dehnung von Axon Niederlassungen und Verfeinerungen der glomerulären Büschel beobachtbar sind (4A-E). Sensorischen Neuronen in vivo für längere Zeiträume zu beobachten, z. B., mehr als drei Wochen (4F-I). Andererseits sind die Axone von unreifen Neuronen noch im Prozess des anfänglichen Wachstums nicht getuftet Verzweigungen besitzen und noch nicht ihre endgültige glomerulären Ziele verbunden. Das experimentelle Protokoll ermöglicht die Verfolgung der Entwicklung dieser Neuronen während der Reifung, zB., Axon Dehnung, Gabelungen und Etablierung von Tufting Verzweigungen (4J-L). Weitere Beispiele siehe auch Hassenklöver und Manzini 12.
Abbildung 1. Schematische Darstellung des experimentellen Protokolls. (A) sensorischen Neuronen im Haupt Riechepithel (MOE) oder Vomeronasalorgan (VNO) der Riechorgan von betäubten X. laevis-Larven werden durch Elektroporation unter Verwendung einer Glaspipette mit fluoreszierenden Dextran-Lösung gefüllt markiert. Die Axone der markierten Neuronen durch den Riechnerv (ON) folgen und schließlich den Riechkolben (OB) zu erreichen. (B) Die Kaulquappe anästhesiert und die markierten Neuronen werden wiederholt unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops oder Multi in bestimmten Zeitabständen untersucht. (C) Das inkrementelle Entwicklung der axonalen Wachstumsmuster der markierten Zellen können über Zeiträume von Tagen bis Wochen folgen.
Abbildung 2. Electroporation der sensorischen Neuronen im Riechorgan. (A) Die Elektroporation mit niedrigem Widerstand Pipetten führt zu Kennzeichnung von mehreren Zellen im Riechorgan. In diesem repräsentativen Beispiel mehrere olfaktorische Rezeptorneuronen (ORN, gefüllt Pfeilspitzen) und zwei säulenförmigen Stützzellen (VZ, Sternchen) wurden gefärbt. Gestrichelte Linien grenzen die Grenzen des olfaktorischen Epithels (OE). (B) Verfeinerung der Elektroporation Parameter, z. B. Erhöhung der Pipettenwiderstand, schränkt die Anzahl der markierten Zellen. In diesem Beispiel wurden eine einzelne sensorischen Neuronen (gefüllte Pfeilköpfe) und einem benachbarten tragenden Zelle (Sternchen) nach der Elektroporation gefärbt. Beachten Sie die einzelnes Axon Verlassen des olfaktorischen Epithels (offene Pfeilspitzen). (C) Erfolgreiche Einzelzelle Elektroporation führt zu exklusiven Kennzeichnung eines einzelnen sensorischen Neuronen (gefüllte Pfeilspitze) und seine angeschlossenen Axon (offene Pfeilspitzen) im Riechepithel. 
Abbildung 3. Visualisierung Riech Axon Projektionen im geschnitten Riechkolben. (A) Die grobe Topologie axonalen Projektionen der sensorischen Neuronen im Riechkolben kann mit geringeren Widerstand Elektroporation Pipetten visualisiert werden. Ein Riechkolben Hemisphäre und die damit verbundenen Geruchsnerv (ON) sind dargestellt. Vier Dextrane auf unterschiedliche Fluorophore gekoppelt wurden an vier entfernten Orten des Riechorgan elektroporiert: lateral (grün), Mittelstufe (gelb), medial MOE (rot) und VNO (orange). Dies ermöglicht die Visualisierung der akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) und die drei Projektionsfelder des Hauptriechkolben (MOB). 
Abbildung 4. In vivo Zeitraffer-Bildgebung einzelner Riechnervenbahnen. (AE)Nach erfolgreicher Einzelzelle Elektroporation der markierte Axon kann wiederholt im Riechkolben (OB) visualisiert werden. Dieses Beispiel zeigt einen einzelnen Axon, für eine Woche untersucht wurde. Die Gesamt Morphologie nicht wesentlich ändern und zwei Hauptverzweigungspunkte identifiziert werden können (offene Pfeilspitzen). Beachten Sie, dass über den Zeitverlauf, einer glomerulären Büschel erfährt kontinuierliche Reduktion (gefüllte Pfeilspitze), während die beiden anderen glomerulären Büschel stabil bleiben (Sternchen). (FI) Diese repräsentative Beispiel zeigt die Lebensfähigkeit von Langzeitbeobachtungen, wie diese spezifische Axon wurde untersucht länger als drei Wochen. Keine offensichtliche Änderung der Wachstumsmuster detektiert werden kann. (JL) Ein Beispiel eines unreifen sensorischen Axonen in den Wachstumsprozess dargestellt. Es ist noch nicht angeschlossen, um Glomeruli und charakteristische glomerulären Büschel fehlen. Nach 5 Tagen die axonalen Verzweigungen verlängert sind, gegabelt das Axon mehrfach und feine Verzweigungen sindetabliert.
Discussion
Die hier beschriebenen Versuchsdurchführung ermöglicht die Kennzeichnung sensorischen Neuronen des Riechorgan der Larven X. laevis durch Elektroporation von Fluorophor gekoppelt Dextrane und anschließende Visualisierung der sensorischen Axonen Wachstum der lebenden Tieres. Durch Variation der Parameter der in vivo Elektroporation ist es möglich, die Anzahl der markierten sensorischen Neuronen steuern. Dadurch ist es möglich, große Gruppen von Neuronen einer sensorischen Epithel, sehr wenige oder sogar einzelne Zellen zu markieren.
Um sicherzustellen, das gewünschte Ausmaß der neuronalen Kennzeichnung ist es wichtig, besonders vorsichtig über die Mikropipette Eigenschaften und der Elektroporation Impulse zu sein. Höhere Pipettenwiderstände und die Verringerung der Spannungsimpulsamplitude, Dauer und Anzahl der Wiederholungen kann die Menge der markierten Zellen zu verringern, während eine Verringerung Pipettenwiderstände und Hochspannungsimpulsamplitude, Dauer und Anzahl von Impulsen auf, stärkeren Kennzeichnung führen. The Verwendung von fluoreszierenden Dextrane für die Elektroporation bietet sofortiges visuelles Feedback, wenn die angewendeten Einstellungen geeignet sind. Achten Sie darauf, dass mit Hilfe von Parametern für Amplitude, Dauer und Anzahl der Impulse, die die in dem Protokoll vorgesehenen Werte überschreiten kann potenziell zu Zellschäden führen oder sogar zum Zelltod 17. Verstopfte oder zerbrochen Spitzen Mikropipetten können auch erfolgreiche Elektroporation behindern.
In vivo Elektroporation im Riechorgan X. laevis ist larvalen Stadien beschränkt, da die Haut von Fröschen postmetamorphotic ist härter und kann nicht einfach mit einer Mikropipette durchstoßen werden. Die in vivo Darstellung von neuronalen Prozesse können durch Streuung der Anregungs- / Emissionslicht in tieferen Bereichen des Gehirns oder durch Blutgefäße verhindert werden. Dieses Problem wird besonders deutlich in höhere Larvenstadien aufgrund einer größeren Gehirn und kann zu verrauschten Signalen macht die eindeutige Identifizierung von feinen axonalen Prozessen schwieriger zu führen.
Die Anwendung des Protokolls ist nicht auf Riechzellen beschränkt, sondern kann auch angewandt, um andere Zelltypen, beispielsweise zu untersuchen., Stamm / Vorläuferzellen der neurogenen Zonen des sich entwickelnden Gehirns oder Mitralklappen Zellen im Riechkolben. Zusätzlich zeigte der Technik kann auch in Kombination mit Calcium-empfindlichen Dextrane verwendet oder eingebracht werden membranpermeabler Calcium Farbstoffe, funktionelle Informationen über die markierten Neuronen und / oder der angeschlossenen Schaltungs 7,19 zu erhalten. Die Verfügbarkeit einer Vielzahl von Fluorophoren Dextrane gekoppelt ermöglicht Kennzeichnung einer Vielzahl einzelner Zellen oder Populationen mit verschiedenen Farben. Auch Plasmid-DNA-Lösung, beispielsweise Codierung für fluoreszierende Proteine, geeignet für die Elektroporation und die versatili weiter zu verbessernty und die Nützlichkeit der Methode 6. Das Protokoll kann weiter verbessert werden, damit die kombinierten Elektroporation von DNA und Dextrane oder geladenen Morpholino Genexpression 13,17 zu manipulieren.
Das beschriebene Verfahren stellt sicherlich ein neues Tool, das komplexe und immer noch nicht vollständig verstanden Prozesse, die axonalen Führung in der Wirbeltier-Geruchssystem regulieren zu untersuchen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SZX16 | Olympus | Stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | Single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | Electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | Manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | Glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10 kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10 kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10 kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10 kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3 kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | Multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | Confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | Alternative software for neuronal tracing |
References
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