Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف عن خلايا الدم البيضاء الإنسان مستضد المؤشرات الحيوية في سرطان الثدي الاستفادة تسمية خالية جهاز الاستشعار البيولوجي تقنية

Published: March 24, 2015 doi: 10.3791/52159
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 2,3, 1
1Experimmune, A Center for Immunotherapeutic Development, Department of Immunotherapeutics and Biotechnology, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Resonant Sensors Incorporated, 3University of Texas Arlington

Summary

يتم تسليط سليمة الصف الأول المجمعات HLA / الببتيد من قبل الخلايا السرطانية، وهو ما يمثل العلامات البيولوجية السرطان المحتملة ذات الصلة. استخدام تكنولوجيا الاستشعار خالية من التسمية ومستقبلات الخلايا T-محاكاة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، والكشف عن سقيفة MIF / HLA-A * 02: 01 المجمعات في supernatants خلية MDA-MB-231، ارتفعت المصل البشري، ويتجلى بلازما المريض، مما يتيح تطوير سرطان رواية منصة التشخيص.

Abstract

وفقا لجمعية السرطان الأمريكية، وسيتم تشخيص أكثر من 200،000 النساء المصابات بسرطان الثدي كل عام، وحوالي 40،000 سيموت من المرض. مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) فئة I عينات الببتيدات المستمدة من تدهور proteasomal من البروتينات الخلوية وتقدم هذه الشظايا على سطح الخلية للتحقيق معهم من خلال تعميم الخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL). جيل من مستقبلات الخلايا T-تقليد (TCRm) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) التي تعترف سرطان الثدي محددة الببتيد / HLA-A * 02: 01 المجمعات مثل تلك المشتقة من هجرة البلاعم المثبطة عامل (MIF 19-27) وNY-ESO- 1 157-165 تمكين كشف وتدمير خلايا سرطان الثدي في حال عدم وجود المضادة للورم استجابة فعالة CTL. يتم تسليط سليمة الصف الأول المجمعات HLA / الببتيد من قبل خلايا سرطان الثدي وسرطان تمثل المؤشرات الحيوية ذات الصلة المحتملة. في هذا العمل، ونظام فحص اختراق العلامات البيولوجية لسرطان التشخيصويرد ق دمج مستقبلات الخلايا T-الاجسام المضادة تقليد جنبا إلى جنب مع الرواية، خالية من التسمية جهاز الاستشعار البيولوجي باستخدام الموجهة وضع الرنين (GMR) تكنولوجيا الاستشعار. الكشف عن سقيفة MIF / HLA-A * 02: 01 المجمعات في supernatants خلية MDA-MB-231، ارتفعت المصل البشري، ويتجلى بلازما المريض. تأثير هذا العمل يمكن أن تحدث ثورة الطب الشخصي من خلال تطوير وسائل التشخيص مرض مصاحب لالمناعية المستهدفة.

Introduction

الطبقة I الكريات البيض البشرية مستضد (HLA) عينات الببتيدات من 8-11 الأحماض الأمينية في الطول المستمدة من تدهور proteasomal من البروتين داخل الخلايا ذخيرة وتقدم هذه الببتيدات على سطح كل خلية الأنوية 1،2. مجمع HLA هو "العلامات البيولوجية الطبيعة"، مما يدل على صحة كل خلية (الشكل 1) لتعميم الخلايا الليمفاوية التائية السامة (CTL). الاعتراف المرض المرتبطة الببتيدات النتائج في القضاء على الخلايا المخالف من قبل CTL. وهكذا، فإن الاستجابة المناعية التكيفية فعالة للغاية في القضاء على العدوى الفيروسية والأورام. ومع ذلك، فإن الجهاز المناعي يمارس الضغط والتي غالبا ما يعزز اختيار بحثا عن الفيروسات أو ورم قادرة على التهرب من الاستجابة الفعالة CTL. مستقبلات الخلايا T-محاكاة (TCRm) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) التي تعترف محدد الببتيد / HLA-A * 02: 01 المجمعات مثل تلك المستمدة من سرطان الثدي البروتينات المرتبطة بها، عامل بلعم المثبطة الهجرة (MIF19-27) 3 وNY-ESO-1 157-165، وتمكين كشف وتدمير خلايا سرطان الثدي في حال عدم وجود المضادة للورم فعال CTL استجابة 4،5. ويركز هذا العمل التمثيلي على HLA-A * 0201 جزيء، وهو ما يعبر عنه بنسبة تصل إلى 30٪ من السكان. ومع ذلك، فإن تحديد غيرها من المجمعات HLA / الببتيد ذات الصلة، تليها إنتاج TCRm ويمكن من تطوير المناعية المستهدفة وتشخيص الأمراض رفيق، وتوسيع فائدة هذا العمل إلى السكان أوسع من ذلك بكثير.

يتم تحرير جزء من المجمعات الببتيد / HLA متجهة إلى سطح الخلية في البلازما. ونظرا لطبيعة معقدة للغاية من الببتيد / حمامات HLA، الأساليب الحالية للتعدين وimmunopeptidome عن المؤشرات الحيوية المرتبطة HLA هي مضيعة للوقت. وتتطلب هذه العملية تنقية تقارب من HLA القابلة للذوبان من البلازما، والفصل بين HLA الببتيدات ذات الصلة عن طريق عكس المرحلة ارتفاع ضغط اللوني السائل(RP-HPLC) والببتيد تسلسل التي كتبها جنبا إلى جنب مطياف الكتلة (MS / MS) 6،7. على الرغم من أن هذه العملية هي خيارا قابلا للتطبيق لاكتشاف أهداف علاجية جديدة، بل هو عملية مرهقة كأداة تشخيصية رفيق للأهداف المرتبطة HLA بالفعل في لقاح علاجي أو خط أنابيب الصيدلانية البيولوجية 8-10. TCRm الموجهة ضد هذه الأهداف توفر الأدوات اللازمة لتطوير التشخيص رفيق السريعة التي تهدف إلى تقسيمها المرضى في التجارب السريرية ذات الصلة وتوفير خيارات علاجية أكثر استنارة.

في هذا العمل، يتم تقديم نظام فحص اختراق العلامات البيولوجية لتشخيص مرض السرطان الذي يستخدم TCRm ونظام الأحيائي خالية من التسمية التي تراقب التفاعلات البيولوجية مع خطوات معالجة الحد الأدنى. ويستند هذا النظام الأحيائي خالية من التسمية على الطريقة التي يستخدم الموجهة وضع الرنين (GMR) التأثير الذي يحدث في حواجز شبكية الدليل الموجي عازلة 11-14. عندما الاتصالات ذات النطاق العريض في ضوء إنحرافيصريف في لوحات المطلوبة لهذا النظام، وتنعكس اثنين من موجات محددة. ويتم رصد التفاعل بين مستقبلات ملزمة يجمد ويجند في الوقت الحقيقي من خلال تتبع الطول الموجي تحول الرنين مع محلل الطيف 12. تحدث قمم الرنين منفصلة عن الحادث TE (ناقلات الكهربائي الطبيعي لطائرة من الإصابة) وTM (ناقلات المغناطيسي الطبيعي أن الطائرة من الإصابة) الدول الاستقطاب توفير نقاط البيانات المتعددة التي يمكن أن يحتمل زيادة دقة الكشف 11،14. باستخدام الأجسام المضادة لوحات ما قبل توعيتهم في هذا النظام الفحص خالية من التسمية، ووقت التشغيل مقايسة مع تحليل البيانات ما يقرب من 45 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، عينات المرضى متعددة يمكن استجوابه في شكل 96- أو 384-جيدا، وميزة واضحة على شكل أساس HPLC-MS / MS.

Protocol

بيان الأخلاق: تم الحصول على عينات الأنسجة والبلازما البشرية التي تم تحديدها دي من مركز هندريك الطبية في ظل مجلس المراجعة المؤسسية الموافقة على البروتوكول.

1. إضافة المعقدة البيروكسيديز الأجسام المضادة

ملاحظة: رصد من هذه الخطوة هو اختياري. انظر البروتوكول البديل إن لم يكن الرصد.

  1. الحصول على مشتقات المغلفة لوحات أفيدين المتاحة تجاريا (انظر المواد والمعدات الجدول).
  2. إضافة 50 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) الرقم الهيدروجيني 7.2 إلى الآبار.
    ملاحظة: يحضن مسبقا PBS في 28 ° C للحد من تحولات الرنين درجة الحرارة ذات الصلة.
  3. البرمجيات مفتوحة الأحيائي الماسح الضوئي واتبع معالج الإعداد لتحديد الإجراء التجريبي الذي يضم مجموعة من الفراغات والمعايير والعينات في تخطيط لوحة، وتحديد درجة الحرارة (28 ° C)، وعدد من مسح لكل دقيقة (1)، وطول التجربة ( 150 دقيقة لاستيعاب الخطوات التحضيرية). إدراج لوحة فحص أعدت في التسمية الأحيائي الحر الماسح الضوئي والبدء في الفحص الأول. عندما الفحص الأول هو كاملة، حدد "إشارة الذاتي لبدء". الأساس هو مجموعة أولية من المسح التي تم جمعها في بداية التجربة. إذا كانت هذه هي أول قراءة أجريت على هذه اللوحة محددة، والسماح للالماسح الضوئي لتشغيل لكي تتوازن درجة الحرارة والقضاء على الانجراف في الأساس. انظر الشكل 2 لقطة من خط الأساس تليها عينة بالإضافة.
  4. بعد أن استقر خط الأساس، أو على الأقل 5 بالاشعة، وقفة القراءة وإخراج اللوحة.
  5. إزالة PBS عن طريق الإغراق في الحوض وإضافة 50 ميكرولتر RL21A المعقدة البيروكسيديز الأجسام المضادة في [10 ميكروغرام / مل في PBS الرقم الهيدروجيني 7.2] للجميع ولكن آبار المراقبة على لوحة. إضافة 50 ميكرولتر PBS إلى آبار المراقبة.
  6. إدراج لوحة العودة إلى الماسح الضوئي الأحيائي واستئناف القراءة حتى يتم التوصل إلى التشبع، ما يقرب من 1.5 ساعة.
  7. وقفة القراءة وإخراج اللوحة.
  8. غسل لوحة 3 مرات مع 200 ميكرولتر / جيد الفوسفات مخزنة المالحة + 0.05٪ توين 20 (PBST) تليها 3 يشطف مع 200 ميكرولتر / جيد PBS الرقم الهيدروجيني 7.2. كرر مع برنامج تلفزيوني. اضغط PBS الزائدة من لوحة على مناشف ورقية قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
    ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يؤديها على صفيحة غسالة أوتوماتيكية أو غسل لوحة 3 مرات مع 200 PBST ميكرولتر عن طريق الإغراق السائل إلى بالوعة واستبدال PBST مع ماصة.
  9. إضافة 50 ميكرولتر PBS الرقم الهيدروجيني 7.2 لجميع الآبار النشطة.
  10. إدراج لوحة العودة إلى الماسح الضوئي الأحيائي واستئناف القراءة لمراقبة ما بعد غسل-الرنين.
  11. وقف القراءة وإخراج اللوحة.

بروتوكول بديل للالخطوة 1:

  1. إضافة 50 ميكرولتر RL21A الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز في [10 ميكروغرام / مل PBS] لجميع الآبار.
  2. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. غسل لوحة 3 مرات مع 200 ميكرولتر / جيد PBST تليها 3 يشطف مع 200 ميكرولتر / جيد PBS كما في الخطوة 1.9.
jove_title "> 2. إضافة الحليلة

  1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 50 ميكرولتر لكل بئر من العازلة الفحص المناسب. لهذا الاختبار، تم استخدام المتاحة تجاريا المصل البشري الطبيعي المخفف 01:20 في برنامج تلفزيوني.
  2. مفتوحة الأحيائي برنامج الماسح الضوئي واتبع معالج الإعداد لتحديد الإجراء التجريبي.
  3. إدراج لوحة في الماسح الضوئي الأحيائي ويبدأ خط الأساس قراءتها. إذا كانت هذه هي أول قراءة أجريت على هذه اللوحة محددة، والسماح للتشغيل الماسح الضوئي لكي تتوازن درجة الحرارة والقضاء على الانجراف في الأساس.
  4. بعد أن استقر خط الأساس، أو على الأقل 5 بالاشعة، وقفة القراءة وإخراج اللوحة.
  5. إزالة المخزن المؤقت فحص من الآبار.
  6. ضوابط سبايك مع HLA A * 02: 01 مونومر تحمل ذات الصلة (FLSL) أو غير ذات صلة (SLLV، YLEV، أو KVL) الببتيدات بتركيزات تتراوح بين [،625-10 ميكروغرام / مل] العازلة في الفحص. إضافة 50 ميكرولتر من المعايير لآبار السيطرة على لوحة
  7. إضافة 50 ميكرولتر من تحليلها في المخزن فحص لعينةالآبار من لوحة. لهذا الاختبار، وارتفعت تم استخدام مصل الدم البشري متاحة تجاريا.
  8. إدراج لوحة العودة إلى الماسح الضوئي الأحيائي واستئناف القراءة حتى يتم التوصل إلى التشبع، حوالي 30-60 دقيقة.
  9. وقفة القراءة وإخراج اللوحة.
  10. غسل لوحة 3 مرات مع 200 ميكرولتر / جيد PBST تليها 3 يشطف مع 200 ميكرولتر / جيد PBS كما في الخطوة 1.9.
  11. إضافة 50 ميكرولتر عازلة فحص لجميع الآبار النشطة.
  12. إدراج لوحة العودة إلى الماسح الضوئي الأحيائي واستئناف القراءة لمراقبة ما بعد غسل-الرنين.
  13. وقف القراءة وإخراج اللوحة.
    ملاحظة: المخزن المؤقت الفحص يمكن أن يكون PBS، الأنسجة وسائل الإعلام والثقافة، أو المصل البشري المخفف 01:20 في برنامج تلفزيوني اعتمادا على الهدف من الفحص.

تحليل 3. البيانات

  1. تحليل باستخدام برنامج الأحيائي الماسح الضوئي أو تصدير ملفات البيانات الخام إلى فضل برامج التحليل الإحصائي. برنامج الأحيائي الماسح الضوئي تلقائيا بإنشاء منحنى ملزم على أساستخطيط لوحة المقدمة خلال الإعداد التجريبية.
    ملاحظة: إذا لم باستخدام برنامج الماسح الضوئي الأحيائي للتحليل، اتبع الخطوات 3،2-3،4.
  2. طرح خط الأساس ومراقبة سلبية من كل نقطة البيانات اللاحقة.
  3. حساب المتوسط ​​والانحراف المعياري للآبار تكرار في كل نقطة زمنية.
  4. توليد الرسم البياني لمنحنى ملزم أو تحديد بيانات نقطة النهاية لشريط الرسوم البيانية.

Representative Results

وأجريت مجموعة تمثيلية من التجارب باستخدام جيدا اتسم TCRm، RL21A، والفئران الأجسام المضادة وحيدة النسيلة IgG2a الذي يعترف تحديدا الببتيد (MIF 19-27 أو FLSL) ضمن سياق HLA-A * 02: 01 جزيء 3. لوما شابه ذلك مونومر الببتيد / HLA، وكذلك لا صلة لها بالموضوع HLA مونومر 15، وكان يستخدم للتدليل على الإجراء الموضح الشكل 3 يوضح الشكل الفحص.

RL21A غير محددة لمونومر FLSL / HLA مع الصليب قليل التفاعل مع الببتيد الأخرى / HLA مجمعات 3. ولخص هذا التحديد باستخدام نظام الأحيائي خالية من التسمية (الشكل 4). حساسية النظام الأحيائي الحر التسمية لهذه التجربة هي في حدود nanomolar منخفض على النحو الذي يحدده المعايرة من الأجسام المضادة RL21A على FLSL يجمد / مونومر HLA (الشكل 5). على الرغم من أن إشارة الخلفية وزيادة كبيرة في عينات مصل، قويتحقق كشف pecific من مونومر FLSL / HLA في مصل الدم البشري قد تصاعد في الشكل (6) والتدرج التركيز هو بسهولة ملحوظ في هذه العينات. وأخيرا، supernatants من خط الخلية MDA-MB-231، أظهرت في وقت سابق لتقديم FLSL / HLA-A * 02: 01 جزيء، وتظهر لاحتواء ذوبان FLSL مونومر باستخدام هذه التسمية منصة فحص مجانية (الشكل 7). بالإضافة لاحقة من FLSL / HLA مونومر يزيد من إشارة على RL21A (الشكل 7). نظرا لحساسية النظام، وأيضا لاختلاف جيدا بما في ذلك التحولات بالرنين سلبية يمكن أن تحدث نتيجة التقلبات في درجات الحرارة كما رأينا بوصفها وظيفة من الانحرافات المعيارية في أرقام 4 و 5. ويمكن تخفيض هذه الاختلافات بشكل كبير لما قبل الحضانة من جميع العينات ولوحة القارئ الأحيائي في درجة حرارة تتجاوز طفيف في درجة حرارة الغرفة (أي 28 ° C).

في الشكل 8، لفترة وجيزة، 96حسنا تم المغلفة لوحات البوليسترين مع [10 ميكروغرام / مل] من RL21A لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وغسلها مع PBST، ومنعت مع 0.5٪ الحليب منخفض الدهون، وغسلها مع PBST، وحضنت لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التخفيفات المسلسل FLSL HLA مونومر في مصل الدم البشري الطبيعي المخفف 01:10 في برنامج تلفزيوني لتوليد منحنى القياسية أو تضعف بلازما المريض 01:10 في برنامج تلفزيوني. وجرفت لوحة مع PBST، حضنت 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الأرنب مكافحة الإنسان β2 المكروغلوبولين [1: 5،000] للكشف عن HLA سليمة، وغسلها في PBST. ثم تم تحضين لوحات لمدة 30 دقيقة مع الماعز المضادة للأرنب مفتش [1: 10،000] وغسلها مع PBST. تم إجراء الكشف اللونية باستخدام ABTS (2،2'-Azinobis [حامض 3-ethylbenzothiazoline-6-السلفونيك] الملح -diammonium) الركيزة مع فترة حضانة لمدة 15 دقيقة، ولاحظ في 405 نانومتر على قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم الكشف عن FLSL / HLA في ثلاث عينات من المرضى.

في الشكل 8B، تم تخفيفه المريض RL.064 البلازما 01:20 في برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافةed لوحة ورصدها على كاشف خالية من التسمية لمدة 60 دقيقة. تم انجازه كشف محدد من مجمع FLSL / HLA في مصل المريض. تم إجراء اختبار ر الطالب باستخدام الرسوم البيانية والإحصاءات البرمجيات (P <0.05).

في الشكل 8C، كانت ملطخة أقسام الأنسجة في 1 ميكروغرام / مل مع الماوس مكافحة HLA-A2 (BB7.2) كعنصر تحكم إيجابية، RL21A، IgG2b IgG2a على التوالي والضوابط سلبية. تم الكشف عن تلطيخ باستخدام عدة المضادة للماوس الكشف، DAB (diaminobenzadine)، وQS الهيماتوكسيلين لتلطيخ النووي وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة. تلطيخ من الأنسجة الورم عن طريق RL21A يؤكد العرض المجمعات FLSL / HLA.

الشكل (1)
الشكل 1: ورم مستضد العرض من قبل الطبقة I مستضد الكريات البيض البشرية تحول سرطاني هو اضطراب داخل الخلايا. HLA عينة intracellulالبروتينات AR وتكشف التغيرات المرتبطة بسرطان على سطح الخلية. CTL وTCRm قادرا على التعرف على الخلايا السرطانية من خلال مجمعات للHLA الببتيد واضحة لتلك الخلايا.

الشكل 2
الشكل 2: لقطة من الحصول على البيانات في البرنامج الأحيائي الماسح الضوئي مثال على الحصول على البيانات التي تبين خط الأساس الأولي تفحص تليها RL21A الأجسام المضادة بالإضافة إلى لوحة المغلفة مع 10 ميكروغرام / مل من مجمع FLSL / HLA. تركيزات من الأجسام المضادة هي المشار إليها كما. يمثل كل سطر الفرد مراقبة بشكل جيد مع مرور الوقت.

الشكل (3)
الرقم 3: شكل الفحص توضيحات من الأجسام المضادة يجمد على سطح صريف إنحرافي من يختلط لوحة فحص التقاطإيفانت، تكساس الببتيد / المجمعات HLA في الحل.

الشكل (4)
الشكل 4: خصوصية RL21A لFLSL / HLA مجمع مظاهرة لخصوصية المعقدة البيروكسيديز RL21A TCRm للذات الصلة (FLSL) HLA مونومر لها مقارنة مع غير ذي صلة مونومر HLA (YLEV، SLLV، وKVL). المعقدة البيروكسيديز RL21A TCRm [10 ميكروغرام / مل] وقد ثبتوا على أفيدين المغلفة لوحة فحص السطح وتم إجراء الكشف باستخدام الخالي من الملصقات مونومر HLA ذات الصلة أو غير ذي صلة [10 ميكروغرام / مل] في برنامج تلفزيوني. كان RL21A محددة لمجمع FLSL / HLA. وقد أجريت في اتجاهين ANOVA باستخدام الرسوم البيانية والإحصاءات البرمجيات (P <0.001).

الرقم 5
الشكل 5: ربط حساسية RL21A لوما شابه ذلك الببتيد / مجمع HLA لها توضيحات من detectiعلى حد وحساسية RL21A ملزمة لمجمع FLSL / HLA. وقد ثبتوا المعقدة البيروكسيديز HLA الأحادي FLSL [10 ميكروغرام / مل] على سطح لوحة فحص وأضيف RL21A ليس لها علامة لوحة في التخفيفات المسلسل في برنامج تلفزيوني كما هو مبين. وكان الكشف عن هذا النظام في نطاق nanomolar منخفضة.

الشكل (6)
الشكل (6): الكشف عن HLA مجمعات في مصل مسنبل الإنسان مظاهرة للكشف عن HLA في مصل الدم البشري. وقد ثبتوا المعقدة البيروكسيديز RL21A TCRm [10 ميكروغرام / مل] على أفيدين المغلفة لوحة فحص السطح. تم تخفيفه المجمعة المصل البشري العادي ارتفعت مع ذات الصلة (FLSL) أو غير ذي صلة (SLLV) HLA مونومر 01:20 في برنامج تلفزيوني ثم تضاف إلى لوحة ومراقبة على كاشف خالية من التسمية لمدة 60 دقيقة. تم انجازه كشف محدد من مجمع FLSL / HLA في مصل الدم البشري. بشكل عام، إشارة الخلفية (غير ذي صلة SLLV مونومر) عالية إيه لعينات المصل المخفف مقارنة التحاليل تنقيته في برنامج تلفزيوني (انظر الشكل 4). وقد أجريت في اتجاهين ANOVA باستخدام الرسوم البيانية والإحصاءات البرمجيات (ع <0.0001).

الرقم 7
ويتجلى تم الكشف عن المجمعات HLA القابلة للذوبان في سرطان الثدي supernatants ثقافة الخلية القدرة على كشف HLA في الثدي supernatants الخلايا السرطانية: الرقم 7. على الحركة المعقدة البيروكسيديز RL21A TCRm، RL9A TCRm (المراقبة السلبية)، وisotype السيطرة على سطح لوحة الفحص. أضيفت ارتفعت [5 ميكروغرام / مل] وunspiked MDA-231 supernatants ثقافة الخلية وملزمة تم رصد لمدة 60 دقيقة على كاشف خالية من التسمية. FLSL وSLLV HLA مونومر ارتفعت تمثل عينات الضوابط الإيجابية لRL9A وRL21A ملزمة. وقد أجريت في اتجاه واحد ANOVA باستخدام الرسوم البيانية والإحصاءات البرمجيات (P <0.0001).

ogether.within صفحة = "دائما"> الرقم 8
استخدمت الكشف النوعي المجمعات FLSL / HLA في عينات المرضى (A) انزيم مرتبط المناعي التقليدي الفحص (ELISA) للكشف عن المجمعات محددة FLSL / HLA في البلازما المريض: الرقم 8. (B) المعقدة البيروكسيديز RL21A TCRm أو IgG2a [10 ميكروغرام / مل] كان يجمد على لوحة فحص أفيدين. كان الملون (C) ورم الثدي الأنسجة من RL.064 المريض كما هو موضح سابقا 3 للتحقق من العرض الورم من المجمعات FLSL / HLA. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الطريقة الموصوفة هنا يدخل نظام فحص العلامات البيولوجية لتشخيص السرطان الذي من شأنه أن يمكن الكشف السريع عن ذوبان المجمعات الببتيد / HLA في مصل الدم والبلازما والبول أو اللعاب عينات من المرضى في إنتاجية عالية 96- أو شكل 384 بئرا. هذا النظام الفحص باستخدام الخلايا التائية مستقبلات محاكاة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ونظام الكشف خالية من التسمية يقطع الوقت التحليل إلى أقل من 1 ساعة مقارنة مع 3.5 ساعة بواسطة ELISA التقليدية. هذا النهج الإنتاجية العالية تمكن الطبقات السريع للمرضى إلى التجارب السريرية للقاحات السرطان العلاجية أو المستحضرات الصيدلانية البيولوجية. الأساليب الحالية للكشف عن هذه الأهداف المرض تتطلب تنقية تقارب وHPLC-MS / MS عينات المريض الفردية، وهي عملية تستغرق ومرهقة والوقت. على الرغم من أن هذه الطريقة هو قابل للتقنيات ELISA التقليدية، هناك قلق من أن الكواشف كشف الثانوية مثل مكافحة β2 المكروغلوبولين الأجسام المضادة يمكن أن يغير هيكل HL الوليدجزيء وتمنع ملزمة للكشف عن الحد TCRm. كشف خالية من التسمية يخفف من هذه المخاوف. يمكن تعديل هذا الإجراء للاستخدام على أنظمة خالية من التسمية الأخرى مثل نظام سطح مأكل الرنين. ومع ذلك، فإن هذا يقلل كثيرا من قدرات إنتاجية أعلى بالمقارنة مع النظام الأحيائي المستخدمة في هذه الدراسة.

هذا البروتوكول يمكن تعديلها على نحو فعال للكشف عن المؤشرات الحيوية غير HLA-في مصل المريض والبلازما مع الالتزام بضع خطوات حاسمة. ويوصى رصد عملية طلاء الأجسام المضادة الأولية لتعظيم الاستفادة من السطح، باعتباره <200 مساء التحول سوف يؤدي على الأرجح في إشارة منخفضة للخطوة الكشف اللاحقة. خط الأساس وبعد غسل-يقرأ مفيدة لتحليل نقطة النهاية حيث وفرة للبروتينات المصل قد يخفي ملزم من انخفاض تركيز تحليلها. وأخيرا، والتباين في درجة الحرارة من العينات يمكن أن يؤدي بشكل جيد لاختلاف الآبار. فمن المستحسن أن جميع العينات تكون مرحلة ما قبل المحتضنة لد يتم تعيين التسمية biosassay مجانا تحكم في درجة الحرارة وحدة في 2-3 درجة مئوية فوق درجة حرارة الغرفة. وينبغي أن يسمح عينات المبردة وقتا كافيا للوصول إلى درجة حرارة التشغيل.

وسوف تشمل التعديلات المستقبلية من هذا البروتوكول مضاعفة من TCRm على سطح اللوحة. النظام الأحيائي هو الانقياد حاليا لاكتشاف آبار في مناطق ذات كثافة ما لا يقل عن 8 الصفيف. عن طريق إدخال 4-8 TCRm إلى كل بئر، في حجم عينة الاختبار يتم تخفيض وتمكين مجموعة من البيانات التي تزداد تعقيدا لكل مريض. يمكن لهذه القدرة مزيد من إبلاغ المرضى فيما يتعلق الخيارات العلاجية.

Disclosures

المؤلفين، ديبرا Wawro Weidanz وروبرت ماجنوسون، هي على التوالي الرئيس التنفيذي والرئيس التنفيذي للتكنولوجيا في الرنين مجسات للإعلام، التي تنتج لوحة الأحيائي القارئ وفحص لوحات المستخدمة في هذه المقالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ResoSens Label-free Bioassay Detection System Resonant Sensors Incorporated
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates Resonant Sensors Incorporated
ResoVu software Resonant Sensors Incorporated
RL21A Biotinylated TCRm mAb  PureMHC, LLC
RL9A Biotinylated TCRm mAb  PureMHC, LLC
FLSL HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: FLSELTQQL
SLLV HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: SLLMWITQV
YLEV HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: YLEPGPVTV
KVL HLA-A*02:01 Monomer  Experimmune full peptide sequence: KVLEYVIKV
Pooled Normal Human Serum  ThermoFisher BP2657100
MDA-MB-231 Cell Supernatant ATCC HTB-26 Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) Life Technologies 12440-053
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 10082-147
Penicillin/Streptomycin  Life Technologies 15070-63
Sodium Hydroxide ThermoFisher 5318-1
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher BP665-1
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) ThermoFisher BP337-500
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) ThermoFisher 37615
rabbit anti-human β2 microglobulin  Dako A0072
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG  Jackson Immunoresearch 111-035-144
Nunc  microplates ThermoFisher 439454
Synergy 2 microplate reader Biotek
Immpress Reagent Kit Vector MP-7402
Immpact DAB Vector SK-4105
Hematoxylin QS Vector H3403
IgG2a MP BioMedicals 50328
IgG2b MP BioMedicals 50330
anti-HLA-A2 (BB7.2) Experimmune
Prism 5 Graphpad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules. Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).
  2. Peaper, D. R., Cresswell, P. Regulation of MHC class I assembly and peptide binding. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).
  3. Hawkins, O., et al. An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer. J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).
  4. Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models. J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).
  5. Verma, B., et al. TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms. J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).
  6. Bassani-Sternberg, M., et al. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  7. Hickman, H. D., Yewdell, J. W. Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).
  8. Neethling, F. A., et al. Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies. Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).
  9. Mittendorf, E. A., et al. Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from. US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).
  10. Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. Future of cancer vaccines. Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).
  11. Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel. Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).
  12. Kaja, S., et al. Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics. J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).
  13. Magnusson, R., Wang, S. S. New principle for optical filters. Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).
  14. Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings. Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).
  15. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).

Tags

علم المناعة، العدد 97، HLA، العلامات البيولوجية، وسرطان الثدي، TCRm، التشخيص، خالية من التسمية، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة
الكشف عن خلايا الدم البيضاء الإنسان مستضد المؤشرات الحيوية في سرطان الثدي الاستفادة تسمية خالية جهاز الاستشعار البيولوجي تقنية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weidanz, J. A., Doll, K. L.,… More

Weidanz, J. A., Doll, K. L., Mohana-Sundaram, S., Wichner, T., Lowe, D. B., Gimlin, S., Wawro Weidanz, D., Magnusson, R., Hawkins, O. E. Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology. J. Vis. Exp. (97), e52159, doi:10.3791/52159 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter