Isolatie en Excisie van Muriene Aorta; Een veelzijdige techniek in de studie van hart- en vaatziekten

Introduction

De aorta speelt een centrale rol in cardiovasculaire functie leveren het lichaam met zuurstofrijk bloed en vergelijkbaar met andere delen van het lichaam, is vatbaar voor ziekten. Voorkomende aorta ziekten omvatten atherosclerose en aneurysma, waarin de resultaten van genetische en omgevingsfactoren zoals voeding, roken en sedentaire levensstijl ¹ zijn. Atherosclerose is de afzetting van calcium en op lipide gebaseerde plaque de aortawand typisch in patiënten met chronische hyperlipidemie ^2. Aneurysma's worden gekenmerkt door afbraak van de structurele componenten van de aorta en verdunning van de vaatwand, gevolgd door een vergrote diameter die uiteindelijk kunnen leiden tot scheuren ^3.

Diermodellen zijn belangrijke instrumenten gebruikt om het mechanisme van ziekte en werkzaamheid van mogelijke behandelingen bestuderen. Vaak gebruikte diermodellen in cardiovasculair onderzoek, specifiek onderzoek zijn vasculaire en metabole stoornissenonder andere genetisch gemodificeerde muizen aan lipide niveaus zoals apolipoproteïne E-gen knock-out en low density lipoprotein receptor knockout muizen ⁴ veranderen. De meeste methoden mechanismen van ziekte en werkzaamheid van de therapie te evalueren omvatten de isolatie en excisie van de aorta.

Als de aorta is gelokaliseerd en geïsoleerd, kunnen morfometrische analyse bepaald, zoals aanwezigheid van aneurysma, typisch gedefinieerd als een stijging van meer dan 50% in diameter ^5. Na noodzakelijk situ analyse is voltooid, kan de aorta worden uitgesneden voor verdere analyse. Een uitgesneden aorta kan worden diepgevroren moleculaire studies zoals eiwitten en / of genexpressie testen of die bevestigd met 4% paraformaldehyde en later ingebed, coupes en gekleurd voor histologische analyse. Histologische analyse van de aorta kan aantonen gemeenschappelijke kenmerken van de aorta zoals structurele afbraak, plaquevorming en infiltratie van leukocyten <sup> 6,7. Bovendien kan een uitgesneden aorta worden gebruikt om primaire cellijnen waaronder endotheel- en gladde spiercellen die vervolgens kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van in vitro studies ⁷ isoleren.

Momenteel zijn er geen andere methoden om deze grondige karakterisering van de aorta verstrekken en voorzien bedrijven met hulpmiddelen om verdere studie hart- en vaatziekten. Beeldvormende modaliteiten zoals magnetische resonantie beeldvorming, computertomografie en echografie zijn de dichtstbijzijnde methoden om de aorta morfologisch, maar dit is moeilijk in kleine dieren en het verkrijgen van een apparaat met voldoende techniek is duur ^8. Onsterfelijk gemaakte cellijnen zijn verkrijgbaar mogelijke mechanismen van ziekte en werkzaamheid van therapieën, maar de artificiële aard van deze cellen beperkend bestuderen van de effecten op de cel levenscyclus en apoptose ⁹ onderzoeken.

De algemene doelstelling vandit manuscript is de steriele isolatie en excisie van het muizen aorta bij het onderzoek van hart- en vaatziekten tonen.

Protocol

Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Cincinnati en in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, herzien in 1996).

1. Voorbereiding van de muis

1. Euthanaseren door het blootstellen van het dier naar een supratherapeutische dosis verdoving, isofluraan ingeademd door te voeren. Controleer primaire euthanasie via teen knijpen als een schadelijke stimulus. Secundaire methode van euthanasie, diafragma snijden, zal plaatsvinden in een aanstaande stap. Alternatieve methoden kunnen gebruikt verleend euthanasie wordt verkregen worden.
2. Sanitizie het buitenoppervlak van de muis door sproeien de vacht langs de buikstreek, waarbij de eerste sneden worden gemaakt, met 70% ethanol tot het punt van vocht waardoor de vacht nat met ethanol en losse / droog haren niet voorkomen de regio.
3. Leg de muis op een surgische boord in rugligging met de bovenste en onderste aanhangsels verlengd naar buiten.
4. Beveiligde aanhangsels aan de raad met behulp van chirurgische tape.

2. Isolatie van het hart en de aorta

1. Na een goede positionering van de muis, een tang te lokaliseren en isoleren buikhuid alleen inferieur aan de processus xiphoideus van het sternum.
2. Maak de spanning door het opheffen van de huid recht omhoog en gebruik een schaar om de oppervlakkige huid te verwijderen, waardoor de superieure deel van het buikvlies en inferieure deel van de borstholte.
3. Voer de peritoneale holte door het opheffen van de processus xiphoideus en maken laterale incisies alleen inferieur aan het proces langs de subcostal marges.
4. Ontleden tot in de borstholte, gaan door het membraan, en zorg ervoor dat het hart of de grote bloedvaten niet te verscheuren.
5. Verleng de laterale incisies gemaakt in stap 2.3 craniaal aan het voorste gedeelte van de ribbenkast te verwijderen. Indiennoodzakelijk, bevrijden het hart van de voorste borstwand behulp stompe dissectie.
6. Reinig de borstholte van vreemde bloed en vocht met behulp van een steriel gaasje om materiaal te absorberen. Nadat het gebied is meer zichtbaar is, verwijdert de longen naar het hart en de aorta beter bloot.

3. perfusie van het hart en de aorta

OPMERKING: Om het bloed te verkrijgen via cardiale punctie, doe dat enkel voorafgaand aan deze stap.

1. Vul een 10 cc spuit met 10 ml steriel ijskoude 1x fosfaatbufferoplossing (PBS), en bevestig een 25 gauge naald op de spuit.
2. Steek voorzichtig de naald in de linker ventrikel van het hart.
3. Snijd de rechterboezem om drukopbouw te verlichten van perfusie. Perfuseren de inhoud van de spuit in de muis over 2-3 min.
4. Gebruik steriel gaas bij de opening in het rechter atrium perfusievloeistof absorberen.

4. Isolatie en Excisie van de Aorta

1. Na voltooiing van perfusion, steriel gaas resterende vloeistof vertroebeling van het gezichtsveld in de borstholte absorberen.
2. Expose het maag-inhoud door te snijden caudaal door de buikwand, de uitbreiding van de incisie aan de suprapubische gebied. Verder uit te breiden de incisie in de richting van de onderste ledematen bilateraal voor de huid flappen die kunnen worden vastgepind of weggesneden creëren.
3. Verwijder de lobben van de lever, pancreas, maag, milt en darmen beter te visualiseren de aorta. Wees voorzichtig bij het ontleden van de buurt van de perirenaal regio, zoals de aorta is oppervlakkig op de takken van de nierslagaders.
   OPMERKING: Voer deze stap in een nauwkeurige en laten inschrijven wijze als het maagdarmkanaal is rijk aan bacteriën die de neiging verhoogt voor besmetting.
4. Spoel het gebied met 1x PBS en verwijder alle vloeistof door absorptie met een steriel gaasje.
5. Met behulp van steriele microscissors en microforceps, scheiden de aorta van de wervelkolom dorsaal en de slokdarm ventraal.Het beste is om stompe dissectie en met behulp van een dissectie microscoop voor dit gebruiken.
   OPMERKING: Bij het isoleren van de aorta, start caudaal in de iliacale bifurcatie en bewegen craniaal schoonmaken en scheiden van de aorta van het dorsale oppervlak van de holte of start craniaal de halsslagaders en brachycefale slagaders ontleden caudaal. Ofwel methode is geschikt en is aan de onderzoekers comfort.
6. Verwijder de perivasculaire vetweefsel met fijne microscissors zeker te een deel van de aortawand niet te verwijderen. Dit is essentieel om de mogelijkheden te beperken voor fibroblast verontreiniging bij kweken aorta gladde spiercellen.

Representative Results

Na voltooiing van de procedure, zal er een intacte aorta afkomstig uit het hart, afdalen in de borst- en buikholte, met de nierslagaders nog steeds verbonden (figuur 1A) zijn. Vanaf hier kunnen de aorta worden afgebeeld in situ morfometrische veranderingen die diagnostisch in de studie van abdominale aorta aneurysma (figuur 1B en 1C) zijn kwantificeren. Vervolgens kan de aorta verwijderd, gefixeerd en gekleurd te kijken histologische veranderingen. Een algemene en gemeenschappelijke vlek van de aorta is de hematoxyline en eosine kleuring (figuur 2A en 2B). Daarnaast kan de structurele integriteit van de aorta kwalitatief worden gekwantificeerd met behulp van Verhoff van Geison vlekken te kijken naar de elastine banden (figuur 2C en 2D). In plaats van het verkrijgen van een histologische analyse, de onderzoeker kan knipperen bevriezen de aorta voor de volgende eiwitten en ribonucleinezuur Expression. De laatste optie voor de onderzoeker de aorta om primaire cel isolatie te verkrijgen. Deze cellen kunnen in kweek (Figuur 3A) en gebruikt voor een verscheidenheid van in vitro studies waarbij levensvatbaarheid studies (figuur 3B) en eiwit lokalisatie (figuur 3C).

Figuur 1. In situ representatieve beelden van muizen aorta. (A) Afbeelding van de normale muis anatomie na de isolatie van de aorta waaronder het hart en de nieren. (B) vergroot beeld van een normale intacte murine abdominale aorta. (C) vergrote afbeelding van een zieke abdominale aorta met een aneurysma in de bijnieren regio. Klik hier om een grotere versie van th bekijkenis figuur.

Figuur 2. Histologische analyse van muizen aorta. (A) representatief beeld van een normale hematoxyline en eosine kleuring van een gezonde suprarenal aorta bij een vergroting van 20x. (B) representatief beeld van een aneurismal suprarenal aorta met intramurale trombus na hematoxyline en eosine vlek bij een vergroting van 20x. (C) representatief beeld van een Verhoff van Geison vlek, aandacht voor de elastine banden van een normale suprarenal aorta bij 10x vergroting. (D) representatief beeld van een Verhoff van Geison vlek aandacht voor de elastine banden van een suprarenal aorta ontwikkelen van de ziekte opgemerkt door het dunner en striating van elastine bands en verdikking van de adventitia laag. Gelieve click hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3. Primaire aorta myocytes gekweekt uit aorta. (A) representatief beeld van primaire aorta myocyten in kweek bij 20X vergroting verkregen van de abdominale aorta. (B) representatief beeld van primaire aorta myocyten gedurende een trypan blauw exclusie analyse na 500 uM behandeling van H ₂ O ₂ bij 20x vergroting verkregen de abdominale aorta. (C) representatief beeld van een immunohistochemie vlek voor alfa actine in het primair isolaat aorta gladde spiercellen van de abdominale aorta. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical tape	3M	1527-1
Sterile gauze	Dukal Corporations	1312
25 gauge needle	BD	305122
10 ml syringe	BD	309604