Abstract
Alopecia is een veel voorkomende vorm van haaruitval die kan optreden in veel verschillende omstandigheden, met inbegrip van mannelijke kaalheid, polycysteus ovarium syndroom, en alopecia areata. Alopecia kan ook optreden als bijwerking van chemotherapie bij kankerpatiënten. In deze studie, ons doel was om een consistente en betrouwbare methode voor haaruitval bij muizen, waarmee onderzoekers nauwkeurig vast en nieuwe therapeutische benaderingen voor deze verschillende vormen van alopecia vergelijken kwantificeren ontwikkelen. De werkwijze gebruikt een standaard gel imager verkrijgen en verwerken afbeeldingen muizen meten van de lichtabsorptie, die optreedt in ruwe verhouding tot de hoeveelheid zwart (of grijs) haar op de muis. Gegevens die zijn gekwantificeerd op deze manier kunnen vervolgens worden geanalyseerd met behulp van standaard statistische technieken (dat wil zeggen, ANOVA, T-test). Deze methode werd getest in muismodellen van chemotherapie-geïnduceerde alopecia, alopecia areata en alopecia van waxen. In dit rapport, het gedetailleerd protocol is presteerde voor het uitvoeren van deze metingen, waaronder de goedkeuring gegevens van C57BL / 6 en C3H / HeJ stammen van muizen. Deze nieuwe techniek biedt een aantal voordelen, waaronder relatieve eenvoud van toepassing, afhankelijkheid van apparatuur die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria en toepassing van een objectief, kwantitatieve beoordeling die is robuuster dan subjectieve beoordelingen. Verbeteringen in de kwantificering van de haargroei bij muizen zal studie van alopecia modellen te verbeteren en de evaluatie van veelbelovende nieuwe therapieën te vergemakkelijken in preklinische studies.
Introduction
Alopecia (haaruitval) kan een psychologisch en emotioneel belastend evenement met meerdere oorzaken zijn. Mannelijke kaalheid is de meest voorkomende oorzaak van alopecia, die ongeveer tweederde van de mannen van 35 jaar 1. Een vergelijkbaar patroon van haarverlies kan worden waargenomen bij vrouwen met polycysteus ovarium syndroom. In beide van deze aandoeningen, is de haaruitval androgeen bemiddeld. Alopecia kan ook optreden als een auto-immuunziekte, alopecia areata, die 1,7% van de bevolking treft 2. Alopecia kan optreden als een neveneffect van sommige medische behandelingen, zoals chemotherapie 3. Een hoog percentage (65-85%) van de chemotherapie patiënten ervaren een zekere mate van alopecia 4,5. De psychologische gevolgen van haaruitval zijn goed bestudeerd in de chemotherapie setting. Chemotherapie geïnduceerde alopecia kan leiden tot angst, depressie, een negatief lichaamsbeeld, verminderd zelfrespect en een verminderd gevoel van welzijn 6,7. Een hoge percentage (47-58%) van de vrouwelijke kankerpatiënten verhelpen haaruitval de meest traumatische aspect van chemotherapie, en tot 8% daling behandeling van angst haaruitval 4,6. Er zijn ook aanwijzingen in alopecia androgenetica om therapie om psychologische en zelfs medische gevolgen van haaruitval 8,9 verminderen ondersteunen. Evenzo is alopecia areata gemeld ernstige psychologische gevolgen 2 hebben, en de fragmentarische aard van de haaruitval kan leiden tot een onaangename cosmetisch resultaat dan de meeste andere oorzaken van haarverlies.
Hoewel geneesmiddelen met milde anti-androgene effecten (effecten, spironolacton) werd gebruikt met beperkt succes als therapie voor alopecia, de eerste effectieve medicatie voor alopecia was minoxidil 10. Deze antihypertensieve heeft een waargenomen bijwerking veroorzaken haargroei en wordt nu gebruikt als topische therapie voor vele vormen van alopecia. Echter, de reacties zijn vaak onvolledig, met een aantal onderwerpen waarin slechts langzaaming van haar verlies in plaats van werkelijke hergroei 10. Finasteride is een competitieve antagonist II 5α-reductase type welk blokken omzetting van testosteron in dihydrotestosteron, wat resulteert in verbetering van androgene alopecia ten koste van gedeeltelijke systemische androgeen blokkade. Respons met lange termijn (10 jaar) therapie zijn ongeveer 50% 11. Kortom, ondanks aanzienlijke onderzoek op dit gebied, is er nog geen adequate behandeling voor haarverlies.
Al decennia lang hebben wetenschappers en clinici meetmethoden hoofdhuid haargroei in klinische studies onderzocht. Met de ontwikkeling van geneesmiddelen die de behandeling van alopecia, is er een grotere behoefte aan betrouwbare, economische en minimaal invasieve wijze meten haargroei en specifiek respons op therapie geweest. Beeldanalyse technologie voor een nauwkeurige kwantificering van haardichtheid bij patiënten met haaruitval aandoeningen leverde consistente en betrouwbare resultaten in het verleden met verschillende techniques, inclusief analyse van de gedigitaliseerde beelden 12, beeldanalyse van individuele haren en huidletsels 13, en microscopische scannen naar haar massa te kwantificeren in een bepaald hoofdhuid regio 14.
Helaas, terwijl de bovenstaande methodieken betere beoordeling van de werkzaamheid hebben geleverd voor de haargroei bevorderende interventies in klinische studies, deze methoden niet zijn toegepast om knaagdieren studies in preklinische onderzoeken. Ons doel is om een consistente en betrouwbare methode om haaruitval bij muizen, waardoor de onderzoekers om nauwkeuriger te beoordelen en nieuwe therapeutische benaderingen voor verschillende vormen van alopecia vergelijken kwantificeren ontwikkelen. We hebben een methode met behulp van apparatuur direct beschikbaar in de meeste laboratoria die een snelle en betrouwbare kwantificering van haardichtheid bij muizen met bruin of zwart haar zal toestaan ontwikkeld. Deze methode is getest in muismodellen van chemotherapie-geïnduceerde alopecia, alopecia areata en alopecia uit waxing. Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor het uitvoeren van deze metingen, waaronder de goedkeuring gegevens van C57BL / 6 en C3H / HeJ stammen van muizen. Omdat deze techniek berust op het opsporen lichtabsorptie van pigmenten in de haarschacht, kan het niet worden gebruikt om de haargroei te detecteren in witte muizen of albino muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Alle studies met dieren moeten door de IACUC van de instelling worden goedgekeurd (voor de gegevens die volgt, werden protocollen goedgekeurd door de Montefiore IACUC, protocol # 11-6-240 en # 13-7-100). Dieren worden voorzien lichte verdoving zoals geïndiceerd voor enig doel waardoor ze nog tijdens het fotograferen, er geen pijnlijke procedures vereist voor dit protocol.
1. Verwerving van Foto
- Stel focus en gezichtsveld voor gel imager gebruik van papier met gedrukte tekst. Controleer uniformiteit van de lichtbron heel gefotografeerd regio. Om ervoor te zorgen uniformiteit, gebruik dan een gel imager met een ingebouwde lichtbron voor reflectieve fotografie. Heeft een transillumination lichtbron niet gebruiken, omdat dit een silhouet van het dier, die niet geschikt is voor verdere grijstinten analyse zou maken.
OPMERKING: Dit zal de muis te plaatsen enigszins onscherp, die optische middeling biedt in de hele regio van belang (ROI) en zalhelpen verminderen quantale fouten voor zeer kleine (dwz <10 pixel) regio's van belang. Grotere gebieden van belang zal niet worden beïnvloed door deze minor focussen aanpassing, noch zullen zij worden beïnvloed door verschillen in de grootte van het dier. - Verdoven dieren met ketamine (100 mg / ml) / xylazine (20 mg / ml) (2: 1), daar dit een snelle verdoving effect en snel herstel en optimaal is voor het fotograferen van meerdere dieren.
OPMERKING: Anesthesie wordt bevestigd wanneer het dier is nog steeds genoeg om fotografie mogelijk te maken. Zoals dieren meestal herstellen van deze lichte verdoving binnen 10-15 minuten, heeft de dierenarts niet aanbevolen gebruik van oogzalven. - Plaats verdoofde dieren op gel imager in verticale uitlijning (zo dicht mogelijk parallel).
- Voor dorsale foto's, plaatst u de dieren in buikligging met ledematen verlengd.
- Voor ventrale foto's, plaatst dieren in rugligging, zorg dat de dieren niet zijdelings gedraaid.
- Plaats grijstinten standaard in gefotografeerd regio.
- Sluiten toegangsdeur. Belangrijk: Ambient licht kan verschillen in de blootstelling te introduceren.
- Set F-stop aan een vordering die de regio van belang plaatst binnen het lineaire bereik van de overname (lezen F-stop).
LET OP: De meeste systemen wordt weergegeven waar het beeld is verzadigd. - Neem foto.
- Verandering F-stop naar een andere belichtingsinstelling die de regio van belang plaatst binnen het lineaire bereik door het verhogen of verlagen van de F-stop door 1, zodanig dat zowel de standaard en de regio van belang blijven in een lineaire reeks van acquisitie (referentie F- stop).
- Neem foto.
- Zodra fotografie is voltooid, plaatst dieren op een opwarming tafel en bewaken totdat ze borstligging kan handhaven. Terug dieren hun kooien. De terugkeer van de groep dieren aan de vivarium zodra alle dieren zijn volledig hersteld.
2. Kwantificering van lichtabsorptie </ P>
- Mark regio's van de rente op de beelden van de dieren met behulp van meegeleverde software voor gel imager.
- Voor gehele dier dorsaal aanzicht, gebruikt een rechthoekig of ovaal beeld uitstrekt vanaf de bovenste ledematen van de onderste ledematen, zich zijdelings zoveel mogelijk zodanig dat geen deel van de doos voorbij de achterzijde van het dier zoals weergegeven in figuur 1A.
OPMERKING: Men kan ook markeren het gebied van belang met behulp van een vrije hand tekengereedschap. - Voor hele dier ventrale uitzicht, gebruik 2 rechthoeken: één voor het bekken en een voor de borst zoals weergegeven in figuur 1B.
- Voor een kleinere regio van belang, dat wil zeggen, de plaats van toediening van het geneesmiddel, merk naargelang het geval.
- Voor gehele dier dorsaal aanzicht, gebruikt een rechthoekig of ovaal beeld uitstrekt vanaf de bovenste ledematen van de onderste ledematen, zich zijdelings zoveel mogelijk zodanig dat geen deel van de doos voorbij de achterzijde van het dier zoals weergegeven in figuur 1A.
- Mark regio ('s) van de rente op grijstinten absorptie standaard.
- Neem absorptie van elk van de gemarkeerde gebieden van belang.
3. Analyse
Absorptie niveaus obtained voor de gebieden van belang moet worden genormaliseerd om de achtergrond standaard voor vergelijking van foto's. De relatie van de blootstelling aan de absorptie is log-log (dat wil zeggen, de relatie is lineair tussen log (blootstelling) en log (absorptie)). Met deze verhouding, kan de absorptie van het interessegebied genormaliseerd op een standaard achtergrondwaarde, waardoor absorpties rechtstreeks tussen verschillende foto, ook degene die op verschillende tijdstippen (bijv seriële metingen binnen een protocol) vergeleken worden. De procedure voor het uitvoeren van deze correcties wordt gedetailleerd beschreven in optionele stappen 3.1 en 3.2.
- (Optioneel) Plot curve van log (exposure) vs. log (absorptie) met waarden verkregen uit grijstinten absorptie standaard.
- (Optioneel) Pas variaties in de kwaliteit van elke foto als volgt:
- Selecteer F-stop voor het lezen (zoals bepaald in stap 1.6) en F-stop voor de referentie (zoals bepaald in sTEP 1.8).
- Bereken de gemiddelde absorptie van de standaard in alle foto's op het lezen van F-stop. Dit gemiddelde is de Reference Standard Value (RSV).
- Bereken het verschil in absorptie tussen het lezen en referentie F-stop instellingen in elke foto voor de standaard (delta-S) en voor elke toegezegd ROI (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Bereken de gecorrigeerde absorptie voor elke ROI als volgt: Gecorrigeerde absorptie (ROI-X) = Absorptie (ROI-X) bij het lezen van F-stop + (RSV - absorptie van standaard bij het lezen van F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Compileren experimentele data en data-analyses uit te voeren met behulp van standaard statistische technieken voor continue variabelen (dat wil zeggen, ANOVA, T-test).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze techniek werd gevalideerd met C3H / HeJ geënt muizen, de muis-model van alopecia areata 16. Deze dieren ontwikkelen wereldwijde haaruitval die vordert geleidelijk in de tijd. Echter, de haaruitval optreedt in patches, en kan variëren van een muis naar het volgende, de invoering van aanzienlijke variabiliteit en het verhinderen van kwalitatieve beoordelingen. Dit model bood de gelegenheid om correlaties tussen de metingen van de optische dichtheid te testen op verschillende locaties op de muis als een beoordeling van de geldigheid.
De eerste vraag is, als de maatregelen van verschillende belichtingen, variaties in ROI afbakening en ROI's van niet-overlappende gebieden op dezelfde muis werden gecorreleerd. Er was een significante correlatie (p <0,0001) waargenomen vergeleken ROI gedefinieerd rechthoekig vs. ovale normen op het dorsale oppervlak van de muis (Figuur 4A). Evenzo hoge correlaties werden waargenomen op verschillende plaatsen op het dier en diffehuur blootstelling (niet getoond). Dit geeft een hoge mate van nauwkeurigheid van deze metingen. Er was ook een significante correlatie tussen absorptie bij F-stop 2.0 vs. 1.2 op het dorsale oppervlak van de rug met rechthoekige ROI (p <0.0001, figuur 4B). Een significante correlatie werd ook waargenomen bij het vergelijken absorptiemetingen tussen de dorsale en ventrale oppervlak van dezelfde muizen (p <0.0001, figuur 4C). Deze gegevens tonen aan dat absorptie metingen genomen op verschillende plaatsen op hetzelfde dier zijn gecorreleerd, zoals verwacht in de C3H / HeJ geënt muismodel en deze correlaties blijven lineair over een breed scala van haaruitval. Dit helpt geldigheid van de grijswaarden metingen vast te stellen en stelt ook de robuustheid van deze techniek om variaties in het verwerven en analyseren techniek.
De tweede vraag was of er samenhang tussen seriële metingen uithetzelfde dier op verschillende tijdstippen. Om dit te beoordelen, werden beelden verkregen van C3H / HeJ geënt muizen op een wekelijkse basis voor 3 weken. De C3H / HeJ muis geënt verwachting zouden geleidelijk haarverlies tonen gedurende deze tijd. Grijsschaal analyse van het ventrale oppervlak (borststreek, doosvormige ROI) toonde deze verwachte haaruitval, met consistente daling van het ene tijdstip tot het volgende (Figuur 5). Van de nota, slechts 80% van C3H / HeJ geënt muizen tonen haaruitval, en die met de hoogste grijswaarden niet deze daling laten zien, in plaats vertonen consistente resultaten over de experimentele periode. Deze consistentie van de maatregel bij dieren zonder haaruitval werd ook geverifieerd in de C57BL / 6 muis 19. Dezelfde analyse uitgevoerd op de dij van het ventrale oppervlak en op het dorsale oppervlak toonde vergelijkbare resultaten in tijd (niet weergegeven).
Met deze bemoedigende resultaten van de toepassing van deze techniek in C3H / HeJ geënte dieren,verdere onderzoeken werden uitgevoerd in een ander diermodel, één van chemotherapie geïnduceerde alopecia. C57BL / 6 muizen die 3 wekelijkse cursussen van cyclofosfamide ontvangen zal variabel ontwikkelen wereldwijde haar dunner en depigmentatie. De grayscale analysetechniek hierin beschreven werd gebruikt om deze veranderingen te kwantificeren en om de respons op therapeutische interventies 17 beoordelen. In dit model, de grijstinten analyse bleek een krachtig instrument te zijn in het verstrekken van kwantitatieve beoordelingen van chemotherapie-geïnduceerde veranderingen in de vacht, en toegestane controle van de effecten van de behandeling door de statistische analyse. In een ander model van chemotherapie alopecia, waren er speciale uitdagingen in het gebruik van deze grijstinten analyse. In dit model worden dieren was gezet op het dorsale oppervlak van de haarzakjes synchroniseren en behandeld met een enkele dosis cyclofosfamide 9 dagen later, wanneer haarfollikels anagene fase VI zijn geworden en maximaal gevoelig voor chemotherapeutische 18. De gewaxteregio is de regio van belang zijn voor onderzoek, maar het gebied van waxen misschien van variabele grootte. Het beperken van de ROI binnen de gewaxte regio maakt kwantificering van zowel verlies en hergroei van haar na cyclofosfamide administratie 19. Bovendien is de techniek maakt een nauwkeurige evaluatie van de dosis-afhankelijke verschillen in behandelingseffect van een experimentele therapie. Deze toepassing toont de voordelen van flexibiliteit bij het bepalen van de ROI in deze techniek.
Ter verdere illustratie van de toepassing van deze techniek, voorzien zijn van een interim-analyse van gegevens van een lopend onderzoek in C57BL / 6 gebruik te maken van het protocol van de wekelijkse dosis cyclofosfamide hierboven aangegeven. 8 weken oude muizen werden behandeld met drager of 50 mg / kg / week gedurende 3 weken cyclofosfamide. Chemotherapie behandelde muizen bleek duidelijk zichtbaar haarverlies na 2 maanden, terwijl het voertuig behandelde dieren hadden een normale vacht (Figuur 6A). Grijstinten analyse was pergevormd zoals boven aangegeven, die significante (p <0,05) verschil tussen chemotherapie muizen en controles voertuig (figuur 6B).
Figuur 1: Bruto Gezien haar veranderingen op de dorsale en ventrale oppervlak van C3H / HeJ geënt muizen, de muis-model van alopecia areata Let op de dieren ontwikkelen wereldwijde haaruitval die vordert geleidelijk in de tijd (A) Dorsale uitzicht, met representatieve afbakening.. van gebieden van belang (ROI) voor grijswaarden analyse, ovaal of rechthoekig aangegeven. (B) Ventraal aanzicht met verschillende gebieden van belang voor grijswaarden analyse borst, overeenkomend met een ungroomed gebied of dij, oftewel een verzorgde gebied.
Figuur 2:.. Pixelniveau op grijstinten analyse versus Tiffen's nummer standaard Een standaard Tiffen's grafiek werd gefotografeerd op een gel imager op de aangegeven F-stops (A) Grafiek van Pixel niveau vs. Tiffen's nummer, Resultaat verwacht logaritmische relatie (B. ) logaritmische transformatie, in dit bereik blijft een niet-lineaire relatie te volgen.
Figuur 3:. Pixelniveau op grijstinten analyse versus F-stop Een standaard Tiffen's grafiek werd gefotografeerd op een gel imager op de aangegeven F-stops. Uitgezet zijn de variaties in pixelniveau gezien verschillende normen Tiffen vs. diafragma. Merk op dat de lijnen niet parallel, wat aangeeft dat de correcties aan normen tussen photogra uitlijnenPHS moet individueel worden berekend voor elke regio van belang.
Figuur 4:. Correlatie tussen verschillende fotografische technieken en interessante gebieden in grijswaarden analyse Getoond worden correlaties tussen de aangegeven meettechnieken uit dezelfde C3H / HeJ muis geënt op hetzelfde tijdstip (A) Correlatie van de rechthoek vs. ovaal regio. rente op de dorsale uitzicht. (B) Correlatie van F stop 2,0 versus 1,2 met behulp van rechthoekige regio van belang. (C) Correlatie van de grijswaarden van de dorsale en ventrale uitzicht, rechthoekig gebied van belang. Alle correlaties waren statistisch significant zoals bepaald door lineaire regressieanalyse (p <0,0001).
Figuur 5: Tijd loop van verandering in absorptie met behulp van grijstinten analyse in C3H / HeJ geënt muizen kleuren geven seriële metingen van individuele muizen.. Let op de consistentie van elke muis van het ene tijdstip tot het volgende.
Figuur 6:.. Grijsschaal analyse chemotherapie geïnduceerde alopecia 6 weken oude C57BL6 / J muizen werden behandeld met ofwel drager (N = 6) of 3 wekelijkse doseringen van cyclofosfamide (50 mg / kg) (N = 6) (A) Representatieve groepen van 3 muizen van elk van de behandelingsgroepen, gefotografeerd 2 maanden na het begin van de chemotherapie. (B) Samengesteld data van grijswaarden analyse van elke groep, met verminderde absorptie met cyclofosfamide (p <0,05). Let op de correlatie tussen zichtbare harenverlies in panel A en statistisch significante vermindering van de absorptie in paneel B.
| Absorptie waarden zijn: | |||
| Foto | F-stop | ROI | Absorptie |
| 1 | 2 | Standaard | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Standaard | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Standaard | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Standaard | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Lezen F-stop gekozen als 2.0, Referentie f-stop gekozen als 3.0. | |||
| Reference Standard Value (RSV) = gemiddelde van absorptie van standaard van foto 1 en foto 2 bij F-stop 2.0, RSV = gemiddelde (90, 110) = 100 | |||
| Voor foto 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Gecorrigeerde absorptie voor ROI-1 = 100 + (100-90) * (60/60) = 110 | |||
| Voor foto 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Gecorrigeerde absorptie voor ROI-1 = 120 + (100-110) * (50/50) = 110 | |||
| Gecorrigeerde absorptie voor ROI-2 = 210 + (100-110) * (25/50) = 205 | |||
Tabel 1:. Rekenvoorbeeld voor het corrigeren van de verschillen in blootstelling tussen de foto's De tabel geeft een voorbeeld van hoe om te compenseren voor kleine verschillen in de opname van de normen tussen foto's (optionele stap 3.2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van een nieuwe techniek voor het kwantificeren van haarverlies bij knaagdieren. Deze techniek maakt gebruik van een gel imager voor het verwerven en analyseren, apparatuur die gemakkelijk beschikbaar in de meeste laboratoria. De metingen hebben aangetoond robuust kleine variaties in de techniek (figuren 4-5) zijn, en zijn goed gecorreleerd aan de mate van visuele haarverlies bij behandelingsvormen (figuur 6). Deze technieken zijn met succes toegepast bij de evaluatie van experimentele therapieën voor alopecia 17.
Een kwantitatieve hulpmiddel voor het beoordelen van de haargroei in knaagdieren kan zeer waardevol zijn bij het bevorderen van onderzoek in therapeutica voor alopecia. Veel muismodellen voor alopecia hebben een intrinsieke variabiliteit, wat het moeilijk maakt om de resultaten op subjectieve beoordelingen van therapeutische interventies te baseren. Ook een kwantitatieve beoordeling, die een resultaat geeft in de vormvan een doorlopende handeling kan worden samengevat per groep gemiddelden en standaardafwijkingen / standaardfout en kunnen worden getest met behulp van standaard statistische technieken (ANOVA, t-test). Deze kwantitatieve beoordeling kan worden gebruikt om reacties op een aantal tijdstippen gemeten, en kan worden gebruikt zijn een dosis-response curve voor een testverbinding. Kwantitatieve analyse laat dus voor een op feiten gebaseerde beoordeling van de werkzaamheid van geneesmiddelen die in ontwikkeling zijn.
Deze techniek maakt gebruik van het verschil in kleur tussen vacht en huid in veel muizenstammen. Bij muizen met donker haar, hoe groter de dichtheid van het haar, de grotere hoeveelheid optische absorptie. Deze optische absorptie kan worden gekwantificeerd met behulp van een gel beeldvormende inrichting, die is bedoeld om optische absorptie evalueren in een bepaald gebied van belang hoeveelheden eiwit in Western blot analyse kwantificeren. Vergelijkbaar met western blot analyse, kan de resulterende absorptie metingen anaal te zijnyzed met behulp van standaard statistische methoden om te vergelijken haardichtheid tussen groepen muizen (dwz behandeling versus controle).
Western blot analyse gebeurt meestal op een beeld dat wordt geanalyseerd vergeleken met normen die op dat beeld. Echter, met deze toepassing, wordt het noodzakelijk om vergelijkingen tussen verschillende beelden, die kunnen worden genomen op verschillende tijdstippen maken. Met zeer consistente fotografische techniek kunnen verschillen tussen foto's worden geminimaliseerd. Echter, voor experimentele toepassing, is het handig als kleine variaties in belichting tussen foto's kunnen worden gecompenseerd. Het is dus belangrijk dat een grijsschaal norm in de fotografie (dwz Tiffen's grijstinten grafiek 15). De relatie tussen absorptie en blootstelling varieert afhankelijk van de optische dichtheid van de target (figuur 2A). Dus als de grijswaarden standaard een andere optische dichtheid van de tarGebruik, de nodige correcties kunnen verschillen. Logaritmische correcties zijn nuttig, maar niet een perfecte oplossing voor dit probleem (figuur 2B) niet over. Door het nemen van foto's op 2 verschillende F-stops, kan men een lineaire benadering te berekenen voor de grijswaarden standaard en voor elke doelgroep op de foto, en op die manier een geschikte schaling van de correctie voor de individuele doelstellingen. Figuur 3 illustreert hoe de doelen met verschillende optische dichtheden zullen verschillende correctiefactoren, die kunnen worden geïnterpoleerd uit verschillen in absorptie van elk voorwerp op 2 verschillende F-stops. Dus, als men wenst de standaard waarde van 150 normaliseren, zou een doel op optische dichtheid Tiffen 19, 148, één aan Tiffen 18 zou 140, een aan Tiffen 17 119 zou zijn, enzovoort. In plaats van het oplossen van deze correcties grafisch, kan men een verhouding van de hellingen te gebruiken tussen de grijstinten standaard en de doelgroep tussen de 2 F-stops om de correctie te berekenen foR elk doel, zoals in het ontvangen voorbeeld (Tabel 1).
Zoals alle technieken, kwantitatieve analyse van de haargroei door grijstinten analyse heeft een aantal beperkingen. Eerst en vooral is er aanzienlijke computationele complexiteit in de toepassing van deze techniek. Dit volgt uit het feit dat de analysesoftware voor gel belichters geoptimaliseerd voor het analyseren van elk figuur als een afzonderlijk experiment. Derhalve bestaat er een behoefte om handmatig te corrigeren voor variatie in blootstelling tussen afbeeldingen. De gelineariseerde benadering voor dergelijke correcties helpt dit proces te vereenvoudigen. Een voorbeeld wordt gegeven in Tabel 1: Gesimuleerde gegevens van 2 sets van foto's genomen op F-stop 2.0 en 3.0, met een gemeenschappelijke standaard. Elke set van foto's heeft 2 ROI's die moeten worden vergeleken tussen de sets. Kleine variaties in fotografische omstandigheden hebben de eerste reeks foto's veroorzaakt aan een iets grotere blootstelling dan de tweede set hebben, Evident door kleine verschillen in de absorptie van de gemeenschappelijke norm.
Het voorbeeld toont hoe kleine verschillen in fotografische omstandigheden duidelijke verschillen in absorptie bij een bepaalde ROI kan maken, maar deze kunnen worden gecorrigeerd met een referentiestandaard, in dit geval blijkt dat absorptie bij het ROI niet verschillen tussen de 2 groepen afbeeldingen.
Het is belangrijk dat de wijziging in lichtabsorptie mee niet altijd direct correleren hoeveelheid haar depigmentatie of andere kleurveranderingen verward haaruitval of haargroei kunnen zijn. Helaas kan de nauwkeurigheid van deze techniek niet worden vastgesteld omdat er geen gouden standaard waarmee vergelijken. Wanneer echter duidelijk haaruitval, de techniek levert wel de verwachte resultaten (Figuur 6). Ten slotte is er momenteel geen gegevens om te beoordelen of de resultaten met deze techniek te correleren met de uitkomsten in klinische studies van potentiële therapieën.
<p class = "jove_content"> De grayscale analyse voor de kwantificering van haarverlies bij verschillende vormen van alopecia een kans te verfijnen en te standaardiseren werkwijzen voor het karakteriseren modellen van alopecia en tests reacties op potentiële geneesmiddelen. De toepassing van deze techniek zou identificatie en ontwikkeling van meer effectieve therapieën voor alopecie verbeteren.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
- McAndrews, P. J.
- Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989. Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).
- Hussein, A. M.
- Trueb, R. M.
- Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia. J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).
- McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. Psychological sequelae and alopecia among women with cancer. Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).
- Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. Alopecia: effect on cancer patients' body image. Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).
- Stough, D. Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men. Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).
- Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. Alopecia: the case for medical necessity. Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).
- Olsen, E. A. A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men. J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).
- Rossi, A. 1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up. Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).
- Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C.
- Fleming, M. G. Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery. Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).
- Chamberlain, A. J., Dawber, R. P.
- The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. http://www.imatest.com/docs/q13/ Forthcoming.
- Freyschmidt-Paul, P. Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus). Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model. Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).
- Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist. J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner. Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).
