Abstract
La alopecia es una forma común de pérdida de cabello que puede ocurrir en muchas condiciones diferentes, incluyendo la pérdida de cabello de patrón masculino, el síndrome de ovario poliquístico, y la alopecia areata. Alopecia también puede ocurrir como un efecto secundario de la quimioterapia en pacientes con cáncer. En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida del pelo en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con precisión y comparar los nuevos enfoques terapéuticos para estas diversas formas de alopecia. El método utiliza un generador de imágenes de gel estándar para obtener y procesar imágenes de los ratones, la medición de la absorción de la luz, que se produce en una proporción aproximada a la cantidad de pelo negro (o gris) en el ratón. Los datos que han sido cuantificados de esta manera se pueden analizar utilizando técnicas estadísticas estándar (es decir, ANOVA, t-test). Esta metodología fue probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de la depilación. En este informe, el protocolo detallado es presentados para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Esta nueva técnica ofrece una serie de ventajas, incluyendo la relativa simplicidad de aplicación, la confianza en el equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios de investigación, y la aplicación de una evaluación objetiva, cuantitativa que es más robusto que las evaluaciones subjetivas. Las mejoras en la cuantificación del crecimiento del pelo en ratones mejorarán estudio de los modelos de alopecia y facilitar la evaluación de nuevas terapias prometedoras en estudios preclínicos.
Introduction
La alopecia (caída del cabello) puede ser un evento psicológicamente y emocionalmente angustiante con múltiples causas. Calvicie de patrón masculino es la causa más común de alopecia, que afecta a aproximadamente dos tercios de los hombres a los 35 años 1. Un patrón similar de pérdida de cabello se puede observar en las mujeres con síndrome de ovario poliquístico. En ambos de estos trastornos, la pérdida de cabello es de andrógenos mediada. Alopecia también puede ocurrir como una enfermedad autoinmune, alopecia areata, que afecta a 1,7% de la población 2. La alopecia puede ocurrir como efecto secundario de algunos tratamientos médicos, como la quimioterapia 3. Un alto porcentaje (65-85%) de los pacientes de quimioterapia experimentan algún grado de alopecia 4,5. Las consecuencias psicológicas de la pérdida de cabello se han estudiado bien en el entorno de la quimioterapia. Alopecia inducida por la quimioterapia puede provocar ansiedad, depresión, una imagen corporal negativa, baja autoestima y un sentido reducido de bienestar 6,7. Un alto percentaje (47-58%) de los pacientes de cáncer femeninas consideran la pérdida del cabello a ser el aspecto más traumática de la quimioterapia, y hasta 8% de tratamiento de disminución por temor a 4,6 pérdida de cabello. También hay evidencia en la alopecia androgénica para apoyar a la terapia para reducir las consecuencias psicológicas y médicas, incluso de 8,9 pérdida de cabello. Asimismo, se ha informado de la alopecia areata tener graves consecuencias psicológicas 2, y de la naturaleza irregular de la pérdida de cabello puede conducir a un resultado cosmético más desagradable que la mayoría de otras causas de pérdida de cabello.
Mientras que las drogas con efectos anti-androgénicos leves (es decir, espironolactona) se habían utilizado con éxito limitado como tratamiento para la alopecia, el primer medicamento eficaz para la alopecia fue minoxidil 10. Este antihipertensivo tiene un efecto secundario observado de causar el crecimiento del cabello, y ahora se utiliza como terapia tópica para muchas formas de alopecia. Sin embargo, las respuestas son a menudo incompletos, con algunos temas mostrando sólo lentaing de pérdida de cabello en lugar de rebrote real 10. Finasteride es un antagonista competitivo de tipo II 5α-reductasa que bloquea la conversión de testosterona a dihidrotestosterona, que resulta en mejoras en la alopecia androgénica, a expensas de bloqueo parcial de andrógenos sistémica. Las tasas de respuesta con a largo plazo (10 años), la terapia son alrededor del 50% 11. En general, a pesar de una considerable investigación en esta área, aún no existe una terapia adecuada para la pérdida del cabello.
Durante décadas, los científicos y los médicos han examinado métodos de medición de crecimiento del pelo del cuero cabelludo en ensayos clínicos. Con el desarrollo de medicamentos que tratan la alopecia, ha habido una mayor necesidad de medios fiables, económicas y mínimamente invasivos de medición de crecimiento del cabello y, específicamente, la respuesta a la terapia. La tecnología de análisis de imágenes para una cuantificación precisa de la densidad del pelo en pacientes con trastornos de pérdida de cabello produjeron resultados coherentes y válidos en el pasado usando una variedad de techniquES, incluyendo el análisis de imágenes digitalizadas 12, análisis de imágenes de los pelos individuales y las lesiones de la piel 13, y el escaneo microscópico para cuantificar la masa de pelo del cuero cabelludo en una región definida 14.
Desafortunadamente, mientras que las metodologías anteriores han proporcionado una mejor evaluación de la eficacia para el cabello intervenciones en los ensayos clínicos promotora del crecimiento, estos métodos no han sido aplicados a los estudios con roedores en investigaciones preclínicas. Nuestro objetivo es desarrollar un método consistente y fiable para cuantificar la pérdida de cabello en ratones, lo que permitirá a los investigadores a evaluar con mayor precisión y comparar nuevos enfoques terapéuticos para diversas formas de alopecia. Hemos desarrollado una metodología utilizando equipos disponibles en la mayoría de los laboratorios que permitirán la cuantificación rápida y fiable de la densidad del pelo en ratones con pelo marrón o negro. Esta metodología ha sido probada en modelos de ratón de la alopecia inducida por quimioterapia, alopecia areata y la alopecia de waxing. Un protocolo detallado se presenta para realizar estas mediciones, incluidos los datos de validación de C57BL / 6 y C3H / HeJ cepas de ratones. Como esta técnica se basa en la detección de la absorción de luz a partir de pigmentos en el eje del pelo, no puede ser utilizado para detectar el crecimiento del cabello en ratones blancos o ratones albinos.
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Protocol
Declaración de Ética: Todos los estudios con animales deben ser aprobados por el IACUC de la institución (por los datos que siguen, los protocolos fueron aprobados por el Montefiore IACUC, protocolo # 11-6-240 y # 13-7-100). Animales se proporcionan anestesia luz como se indica con la única finalidad de mantenerlos quietos durante la fotografía, no hay procedimientos dolorosos requeridos para este protocolo.
1. Adquisición de fotografías
- Ajuste el enfoque y campo de visión para reproductor de imágenes de gel utilizando papel con el texto impreso. Verificar la uniformidad de la fuente de luz en toda la región fotografiada. Para ayudar a asegurar la uniformidad, utilice un generador de imágenes de gel con un sistema incorporado en la fuente de luz para la fotografía reflexiva. No utilice una fuente de luz transiluminación, ya que esto crearía una silueta del animal que no es adecuado para su posterior análisis en escala de grises.
NOTA: Esto colocará el ratón ligeramente fuera de foco, que proporciona un promedio óptica a través de la región de interés (ROI) y la voluntadayudar a reducir los errores cuánticos para regiones muy pequeñas (es decir, <10 píxeles) de interés. Regiones más grandes de interés no se verán afectados por esta menor centrándose ajuste, ni serán afectados por las diferencias en el tamaño del animal. - Anestesiar a los animales, utilizando ketamina (100 mg / ml) / xilazina (20 mg / ml) (2: 1), ya que esto proporciona un efecto de la anestesia rápida y recuperación rápida y es óptimo para fotografiar múltiples animales.
NOTA: La anestesia se confirmó cuando el animal es todavía suficiente para permitir la fotografía. Como los animales se recuperan de esta luz anestesia dentro de 10-15 minutos, el veterinario no ha recomendado el uso de ungüentos para los ojos. - Coloque los animales anestesiados en gel de imágenes en alineación vertical (tan cerca como sea posible a paralelo).
- Para las fotografías dorsales, colocar los animales en decúbito prono, con los miembros extendidos.
- Para las fotografías ventrales, colocar los animales en decúbito supino, con cuidado de que los animales no se rotan lateralmente.
- Coloque estándar en escala de grises en la región fotografiada.
- Cierre la puerta de acceso. Importante: La luz ambiental puede introducir variaciones en la exposición.
- Establecer F-stop a una exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal de adquisición (lectura F-parada).
NOTA: La mayoría de los sistemas se mostrarán donde la imagen está saturado. - Tome la fotografía.
- Cambio F-parar a otro ajuste de exposición que sitúa a la región de interés dentro del rango lineal aumentando o disminuyendo la ventanilla F por 1, de manera que tanto la norma y la región de interés se mantienen en un rango lineal de adquisición (referencia F- deténgase).
- Tome la fotografía.
- Una vez que la fotografía se ha completado, colocar los animales en una mesa de calentamiento y monitorear hasta que puedan mantener decúbito esternal. Vuelta de los animales a sus jaulas. Devuelva el grupo de animales para el vivero, una vez que todos los animales están completamente recuperados.
2. Cuantificación de absorción de la luz </ P>
- Marcar las regiones de interés en las imágenes de los animales utilizar el software proporcionado por imager gel.
- Para vista dorsal animal completo, utilice una imagen rectangular u oval que se extiende desde los miembros superiores a las extremidades inferiores, que se extiende lateralmente tanto como sea posible de tal manera que ninguna parte de la caja se extiende más allá de la parte posterior del animal, como se muestra en la Figura 1A.
NOTA: También se podría marcar el área de interés utilizando una herramienta de dibujo a mano alzada. - Para el conjunto de vista ventral animal, utilizar 2 rectángulos: uno que cubre la región pélvica y uno que cubre la zona del pecho, como se muestra en la Figura 1B.
- Para una región más pequeña de interés, es decir, la ubicación de la administración del fármaco, marca, según corresponda.
- Para vista dorsal animal completo, utilice una imagen rectangular u oval que se extiende desde los miembros superiores a las extremidades inferiores, que se extiende lateralmente tanto como sea posible de tal manera que ninguna parte de la caja se extiende más allá de la parte posterior del animal, como se muestra en la Figura 1A.
- Marcos región (s) de interés en el estándar de absorción de escala de grises.
- Absorción registro de cada una de las regiones marcadas de interés.
3. Análisis
Niveles de absorción obtained para las regiones de interés puede necesitar ser normalizados a la norma de fondo para la comparación entre las fotografías. La relación de la exposición a la absorción es log-log (es decir, la relación es lineal entre log (exposición) y log (absorción)). Usando esta relación, la absorción de la región de interés puede ser normalizado a un valor de fondo estándar, que permitirá absorciones que deben compararse directamente entre diferentes fotografías, incluidas las tomadas en diferentes puntos de tiempo (es decir, mediciones en serie dentro de un protocolo de estudio). El procedimiento para realizar estas correcciones se detalla en los pasos opcionales 3.1 y 3.2.
- (Opcional) curva Parcela de registro (exposición) vs log (absorción) utilizando los valores obtenidos de la norma de absorción de escala de grises.
- (Opcional) ajustar las variaciones en el nivel de cada fotografía como sigue:
- Seleccione F-stop para la lectura (según lo determinado en el paso 1.6) y F-stop para referencia (como se determina en sTEP 1,8).
- Calcular la absorción media de la norma en todas las fotografías en la lectura de F-stop. Este promedio es el estándar de referencia Valor (RSV).
- Calcular la diferencia en la absorción entre la lectura y de referencia configuración F-stop en cada fotografía para el estándar (delta-S) y para cada ROI definido (delta-ROI-1, delta-ROI-2 ... ..delta-ROI-X)
- Calcular la absorción corregido para cada ROI de la siguiente manera: la absorción corregida (ROI-X) = Absorción (ROI-X) en la lectura de F-stop + (RSV - absorción de la norma en la lectura de F-stop) * (delta-ROI-X / delta-S)
- Recopilar datos experimentales y realizar análisis de datos utilizando técnicas estadísticas estándar para las variables continuas (es decir, ANOVA, t-test).
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Representative Results
Esta técnica fue validada utilizando / HeJ injertadas C3H, el modelo de ratón de la alopecia areata 16. Estos animales desarrollan la pérdida mundial de cabello que progresa gradualmente con el tiempo. Sin embargo, la pérdida de cabello se produce en parches, y puede variar de un ratón a la siguiente, la introducción de una variabilidad considerable y obstaculizando evaluaciones cualitativas. Este modelo proporciona una oportunidad para poner a prueba las correlaciones entre las mediciones de densidad óptica a diferentes lugares en el ratón como una evaluación de la validez.
La primera pregunta fue si las medidas utilizando diferentes exposiciones, variaciones en la demarcación ROI, y el ROI de las áreas que no se solapan en se correlacionaron el mismo ratón. Hubo una correlación significativa (p <0,0001) visto comparando ROI definido por rectangulares vs. normas ovales en la superficie dorsal del ratón (Figura 4A). Del mismo modo altas correlaciones fueron vistos en diferentes sitios en el animal y en difealquiler niveles de exposición (no mostrado). Esto indica un alto grado de precisión en estas mediciones. También hubo una correlación significativa entre la absorción en F-stop 2.0 vs. 1.2 en la superficie dorsal de la espalda utilizando ROI rectangulares (p <0.0001, Figura 4B). Existe una correlación significativa se observó incluso cuando se comparan las mediciones de absorción entre la superficie dorsal y ventral del mismo ratón (p <0.0001, Figura 4C). Estos datos proporcionan evidencia de que las medidas de absorción tomadas de diferentes sitios en el mismo animal están correlacionados, como se esperaba en la C3H / HeJ injertado modelo de ratón, y estas correlaciones siguen siendo lineal en un amplio rango de pérdida de cabello. Esto ayuda a establecer la validez de las mediciones de escala de grises y también establece robustez de esta técnica a las variaciones en la adquisición de imágenes y la técnica de análisis.
La segunda pregunta fue si hay coherencia entre las mediciones seriadas tomadas deel mismo animal en diferentes puntos temporales. Para evaluar esto, se obtuvieron imágenes de C3H / HeJ injertado ratones semanalmente durante 3 semanas. Se esperaría que la C3H / HeJ de ratón injertado para mostrar la pérdida de cabello gradual durante este tiempo. Análisis de escala de grises en la superficie ventral (región del pecho, ROI en forma de caja) mostró esta pérdida de cabello esperado, con tendencia a la baja constante de un punto de tiempo al siguiente (Figura 5). Es de destacar que sólo el 80% de C3H / HeJ ratones injertados muestran la pérdida de cabello, y aquellos con los más altos valores de escala de grises no muestran este descenso, más bien muestran resultados consistentes en todo el período experimental. Esta compatibilidad de la medida en los animales sin pérdida de cabello también se verificó en el ratón C57BL / 6 19. El mismo análisis realizado sobre la región del muslo de la superficie ventral y dorsal en la superficie mostró resultados similares a través del tiempo (no mostrado).
Con estos alentadores resultados de la aplicación de esta técnica en C3H / HeJ injertado animales,nuevas investigaciones se llevaron a cabo en un modelo animal diferente, uno de alopecia inducida por quimioterapia. C57BL / 6 ratones que reciben 3 cursos semanales de ciclofosfamida será variable desarrollar adelgazamiento del cabello global y despigmentación. Se empleó la técnica de análisis de escala de grises se describe aquí para cuantificar estos cambios, y para evaluar la respuesta a las intervenciones terapéuticas 17. En este modelo, el análisis de la escala de grises demostró ser una herramienta poderosa para proporcionar evaluaciones cuantitativas de los cambios inducidos por la quimioterapia en la capa del pelo, y permitió la verificación de los efectos del tratamiento mediante un análisis estadístico. En otro modelo de la alopecia quimioterapia, había problemas especiales en la utilización de este análisis de escala de grises. En este modelo, los animales se enceran en la superficie dorsal para sincronizar los folículos pilosos, entonces tratados con una dosis única de ciclofosfamida 9 días más tarde, cuando los folículos pilosos han entrado en fase anágena VI y son máximamente sensibles a agentes quimioterapéuticos 18. El enceradoregión es la región de interés para el estudio, pero el área de la depilación con cera puede ser de tamaño variable. La restricción de la ROI a dentro de la región encerado permite la cuantificación de tanto la pérdida y el nuevo crecimiento de cabello después de la administración de ciclofosfamida 19. Además, la técnica permite una evaluación precisa de las diferencias dependientes de la dosis en la respuesta al tratamiento de una terapia experimental. Esta aplicación ilustra las ventajas de tener flexibilidad en la definición de la ROI en esta técnica.
Para ilustrar mejor la aplicación de esta técnica, siempre son un análisis de los datos provisionales de un estudio en curso en ratones C57BL / 6 que utiliza el protocolo de administración semanal ciclofosfamida indicado anteriormente. 8 semanas de edad ratones fueron tratados con vehículo o 50 mg / kg / semana ciclofosfamida durante 3 semanas. Los ratones tratados con quimioterapia mostraron pérdida de cabello aparente visualmente después de 2 meses, mientras que los animales tratados con vehículo tenían una capa de pelo normal (Figura 6A). Análisis de escala de grises fue porformado como se ha indicado anteriormente, que muestra significativa (p <0,05) la diferencia entre los ratones de quimioterapia y los controles del vehículo (Figura 6B).
Figura 1: Vista Bruto de cambios en el pelo en la superficie dorsal y ventral de C3H / HeJ injertado ratones, el modelo de ratón de la alopecia areata Nota los animales desarrollan la pérdida mundial de cabello que progresa gradualmente con el tiempo vista (A) Dorsal, con demarcación representante.. de las regiones de interés (ROI) para el análisis de la escala de grises, ovalada o rectangular, como se indica. (B) Vista ventral con diferentes regiones de interés para el análisis de la escala de grises en el pecho, lo que corresponde a un área sin aplanar, o el muslo, que corresponden a un área de cuidados.
Figura 2:.. Nivel de píxeles en el análisis de la escala de grises vs. norma relativa al número de Tiffen tabla Un estándar de Tiffen fue fotografiado en una cámara de gel a los F-paso añadido (A) Gráfico de nivel de píxeles en función del número de Tiffen, mostrando esperaba relación logarítmica (B. ) transformación logarítmica, en este rango continúa siguiendo una relación no lineal.
Figura 3:. Nivel de píxeles en el análisis de la escala de grises en función de F-stop tabla Un estándar de Tiffen fue fotografiado en una cámara de gel a los F-paradas indicadas. Trazan son las variaciones en el nivel de píxel visto por varias normas diferentes de Tiffen vs F-stop. Tenga en cuenta que las líneas no son paralelas, lo que indica que las correcciones para alinear las normas entre photographs deben calcularse individualmente para cada región de interés.
Figura 4:. Correlación entre diferentes técnicas y regiones de interés fotográficos en el análisis de escala de grises Se muestran las correlaciones entre las técnicas de medición indicados tomadas de la misma C3H / HeJ de ratón injertado en el mismo punto de tiempo (A) Correlación de rectángulo vs. región ovalada de. interés en la vista dorsal. (B) Correlación de F detener 2.0 vs. 1.2 utilizando región rectangular de interés. (C) La correlación de los valores de escala de grises de puntos de vista dorsal y ventral, región rectangular de interés. Todas las correlaciones fueron estadísticamente significativas según lo determinado por análisis de regresión lineal (p <0,0001).
Figura 5: Evolución temporal de cambio en la absorción mediante el análisis de escala de grises en C3H / HeJ injertado ratones Los colores indican las mediciones seriadas de los ratones individuales.. Tenga en cuenta la consistencia para cada ratón de un punto de tiempo al siguiente.
Figura 6:.. El análisis de escala de grises en la alopecia inducida por la quimioterapia 6 semanas de edad C57BL6 / J ratones fueron tratados con vehículo (N = 6) o 3 dosis semanales de ciclofosfamida (50 mg / kg) (N = 6) (A) grupo representativo de 3 ratones de cada uno de los grupos de tratamiento, fotografiado 2 meses después del inicio de la quimioterapia. (B) los datos compilados a partir del análisis de escala de grises de cada grupo, que muestra disminución de la absorción con la administración de ciclofosfamida (p <0,05). Tenga en cuenta la correlación entre el pelo visiblepérdida en el panel A y reducciones estadísticamente significativas en la absorción en el panel B.
| Valores de absorción son los siguientes: | |||
| Fotografía | F-stop | ROI | Absorción |
| 1 | 2 | Estándar | 90 |
| 1 | 2 | ROI-1 | 100 |
| 1 | 2 | ROI-2 | 200 |
| 1 | 3 | Estándar | 150 |
| 1 | 3 | ROI-1 | 160 |
| 1 | 3 | ROI-2 | 230 |
| 2 | 2 | Estándar | 110 |
| 2 | 2 | ROI-1 | 120 |
| 2 | 2 | ROI-2 | 210 |
| 2 | 3 | Estándar | 160 |
| 2 | 3 | ROI-1 | 170 |
| 2 | 3 | ROI-2 | 235 |
| Lectura F-Stop elegido como 2.0, Referencia f-stop elegido como 3.0. | |||
| Referencia Estándar Valor (RSV) = promedio de absorción de la norma de la fotografía 1 y fotografía 2 en F-stop 2.0, RSV = Media (90, 110) = 100 | |||
| Para fotografía 1: | |||
| Delta-S = 150-90 = 60 | |||
| Delta-ROI-1 = 160-100 = 60 | |||
| Delta-ROI-2 = 230-200 = 30 | |||
| Absorción corregido para ROI-1 = 100 + (100 - 90) * (60/60) = 110 | |||
| Para fotografía 2: | |||
| Delta-S = 160-110 = 50 | |||
| Delta-ROI-1 = 170-120 = 50 | |||
| Delta-ROI-2 = 235-210 = 25 | |||
| Absorción corregido para ROI-1 = 120 + (100 - 110) * (50/50) = 110 | |||
| Absorción corregido para ROI-2 = 210 + (100 - 110) * (25/50) = 205 | |||
Tabla 1:. Ejemplo de cálculo para corregir diferencias en la exposición entre las fotografías La tabla muestra un ejemplo de cómo compensar las pequeñas diferencias en la absorción de las normas entre fotografías (paso opcional 3.2).
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Discussion
En este informe una descripción detallada se proporciona de una nueva técnica para la cuantificación de la pérdida de cabello en los roedores. Esta técnica utiliza un generador de imágenes de gel para la adquisición y análisis de imágenes, equipo que está fácilmente disponible en la mayoría de los laboratorios. Las mediciones han demostrado ser robusto a las variaciones menores en la técnica (Figuras 4 - 5), y están bien correlacionados con el grado de pérdida de cabello visual en los modelos de tratamiento (Figura 6). Estas técnicas se han empleado con éxito en la evaluación de terapias experimentales para la alopecia 17.
Una herramienta cuantitativa para evaluar el crecimiento del cabello en los roedores puede ser muy valiosa en el avance de la investigación en la terapéutica para la alopecia. Muchos modelos de ratón para la alopecia tienen variabilidad intrínseca, lo que hace que sea difícil de basar los resultados en las evaluaciones subjetivas de las intervenciones terapéuticas. Del mismo modo, una evaluación cuantitativa que proporciona un resultado en la formade una medida continua se pueden resumir en los promedios de grupo y la desviación estándar / error estándar, y puede ser probado usando técnicas estadísticas estándar (ANOVA, t-test). Esta evaluación cuantitativa se puede utilizar para medir las respuestas sobre una serie de puntos de tiempo, y se puede utilizar en la generación de una curva de dosis-respuesta para un compuesto de ensayo. Así el análisis cuantitativo permite evaluaciones basadas en la evidencia de la eficacia de la terapéutica que están en desarrollo.
Esta técnica toma ventaja de la diferencia de color entre la capa del pelo y de la piel presente en muchas cepas de ratón. Para los ratones con pelo oscuro, mayor es la densidad del cabello, mayor cantidad de absorción óptica. Esta absorción óptica se puede cuantificar usando un aparato de formación de imágenes de gel, que está diseñado para evaluar la absorción óptica en una región de interés definida para cuantificar las cantidades de proteína en análisis de transferencia Western. Al igual que en el análisis de transferencia de Western, las medidas de absorción resultantes pueden ser analyzed utilizando métodos estadísticos estándar para comparar la densidad del pelo entre grupos de ratones (es decir, el tratamiento vs. control).
El análisis de transferencia Western se realiza generalmente en una sola imagen que se analiza en comparación con las normas previstas en esa imagen. Sin embargo, con esta aplicación, se hace necesario hacer comparaciones entre diferentes imágenes, que pueden ser tomadas en diferentes momentos. Con la técnica fotográfica muy consistente, las variaciones entre las fotografías pueden ser minimizados. Sin embargo, para su aplicación experimental, es útil que pequeñas variaciones en la exposición entre las fotografías se pueden compensar. Por lo tanto, es importante que un nivel de escala de grises se incluirá en la fotografía (es decir, un gráfico de escala de grises de Tiffen 15). Sin embargo, la relación entre la absorción y la exposición varía dependiendo de la densidad óptica de la diana (Figura 2A). Por lo tanto, si el estándar de escala de grises tiene una densidad óptica diferente de la target, las correcciones apropiadas pueden ser diferentes. Correcciones logarítmicas son útiles, pero no ofrecen una solución perfecta a este problema (Figura 2B). Al tomar fotografías en 2 stops diferentes, se puede calcular una aproximación lineal para el estándar de la escala de grises y para cada objetivo en la fotografía, y por lo tanto proporcionar una escala apropiada de la corrección en función de los objetivos individuales. Figura 3 ilustra cómo los objetivos con diferentes ópticas densidades tendrán diferentes factores de corrección, que pueden ser interpolados de las diferencias en la absorción de cada objetivo en 2 stops diferentes. Por lo tanto, si uno desea para normalizar el nivel de valor de 150, un objetivo en densidad óptica Tiffen 19 sería 148, uno a Tiffen 18 sería 140, uno a Tiffen 17 sería 119, y así sucesivamente. En lugar de resolver estas correcciones de forma gráfica, se puede utilizar una proporción de las pendientes entre la norma en escala de grises y el blanco entre el 2 diafragmas para calcular la corrección for cada objetivo, como se explica en el ejemplo proporcionado (Tabla 1).
Como todas las técnicas, el análisis cuantitativo del crecimiento del pelo a través del análisis de escala de grises tiene varias limitaciones. En primer lugar, hay complejidad computacional importante en la aplicación de esta técnica. Esto resulta del hecho de que el software de análisis de imágenes para gel se optimiza para el análisis de cada figura como un experimento separado. Por lo tanto, existe un requisito para corregir manualmente para cualquier variación en la exposición entre las imágenes. La aproximación linealizada para tales correcciones sí ayuda a simplificar este proceso. Se proporciona un ejemplo en la Tabla 1: Simulación de datos de 2 series de fotografías, tomadas en F-stop 2.0 y 3.0, con una norma común. Cada conjunto de fotografías tiene 2 regiones de interés que deben ser comparados entre las series. Las variaciones menores en condiciones fotográficas han causado la primera serie de fotografías para tener un poco mayor exposición de la segunda serie, évidént por diferencias menores en la absorción de la norma común.
El ejemplo muestra cómo las diferencias menores en las condiciones fotográficas pueden crear diferencias aparentes en la absorción a una ROI dado, pero estos se puede corregir utilizando un estándar de referencia, en este caso muestra que la absorción en las ROIs no difieren entre los 2 conjuntos de imágenes.
Es importante tener en cuenta que el cambio en la absorción de luz no siempre se correlaciona directamente con la cantidad de pelo despigmentación u otros cambios de color puede confundirse con la pérdida del cabello o el crecimiento del cabello. Por desgracia, la precisión de esta técnica no se puede evaluar porque actualmente no existe una regla de oro con la que comparar. Sin embargo, donde hay pérdida obvia de pelo, la técnica produce los resultados esperados (Figura 6). Por último, en la actualidad no hay datos para evaluar si los resultados con esta técnica se correlacionan con los resultados en los ensayos clínicos de terapias potenciales.
<p class = "jove_content"> El análisis de escala de grises para la cuantificación de la pérdida de cabello en las diversas formas de alopecia representa una oportunidad para mejorar y estandarizar los métodos para la caracterización de modelos de alopecia y para las respuestas a las pruebas terapéuticas potenciales. La aplicación de esta técnica debe mejorar la identificación y el desarrollo de terapias más eficaces para la alopecia.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KODAK Gel Logic 100 Imaging System | Eastman Kodak Company, Rochester, NY, USA | Gel imager for obtaining and analyzing photographs, must have built in light source for reflective photography. | |
| The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale |  Imatest |
Greyscale standard | |
| C57BL/6J Mice | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study | |
| C3H/HeJ engrafted mouse | Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine | Mice for representative study |
References
- McAndrews, P. J.
- Safavi, K. H., Muller, S. A., Suman, V. J., Moshell, A. N., Melton, L. J. 3rd Incidence of alopecia areata in Olmsted County, Minnesota, 1975 through 1989. Mayo Clin Proc. 70 (7), 628-633 (1995).
- Hussein, A. M.
- Trueb, R. M.
- Sato, N., Leopold, P. L., Crystal, R. G. Effect of adenovirus-mediated expression of Sonic hedgehog gene on hair regrowth in mice with chemotherapy-induced alopecia. J Natl Cancer Inst. 93 (24), 1858-1864 (2001).
- McGarvey, E. L., Baum, L. D., Pinkerton, R. C., Rogers, L. M. Psychological sequelae and alopecia among women with cancer. Cancer Pract. 9 (6), 283-289 (2001).
- Baxley, K. O., Erdman, L. K., Henry, E. B., Roof, B. J. Alopecia: effect on cancer patients' body image. Cancer Nurs. 7 (6), 499-503 (1984).
- Stough, D. Psychological effect, pathophysiology, and management of androgenetic alopecia in men. Mayo Clin Proc. 80 (10), 1316-1322 (2005).
- Ogunmakin, K. O., Rashid, R. M. Alopecia: the case for medical necessity. Skinmed. 9 (2), 79-84 (2011).
- Olsen, E. A. A randomized clinical trial of 5% topical minoxidil versus 2% topical minoxidil and placebo in the treatment of androgenetic alopecia in men. J Am Acad Dermatol. 47 (3), 377-385 (2002).
- Rossi, A. 1 mg daily administration on male androgenetic alopecia in different age groups: 10-year follow-up. Dermatol Ther. 24 (4), 455-461 (2011).
- Gibbons, R. D., Fiedler-Weiss, V. C.
- Fleming, M. G. Techniques for a structural analysis of dermatoscopic imagery. Comput Med Imaging Graph. 22 (5), 375-389 (1998).
- Chamberlain, A. J., Dawber, R. P.
- The Kodak/Tiffen Q-13 Gray Scale*. , Imatest. http://www.imatest.com/docs/q13/ Forthcoming.
- Freyschmidt-Paul, P. Treatment of alopecia areata in C3H/HeJ mice with the topical immunosuppressant FK506 (Tacrolimus). Eur J Dermatol. 11 (5), 405-409 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Matsushita, O., Sakon, J., Gensure, R. Treatment and prevention of chemotherapy-induced alopecia with PTH-CBD, a collagen-targeted parathyroid hormone analog, in a non-depilated mouse model. Anticancer Drugs. 25 (1), 30-38 (2014).
- Peters, E. M., Foitzik, K., Paus, R., Ray, S., Holick, M. F. A new strategy for modulating chemotherapy-induced alopecia, using PTH/PTHrP receptor agonist and antagonist. J Invest Dermatol. 117 (2), 173-178 (2001).
- Katikaneni, R., Ponnapakkam, T., Seymour, A., Sakon, J., Gensure, R. C. Parathyroid hormone linked to a collagen binding domain promotes hair growth in a mouse model of chemotherapy induced alopecia in a dose-dependent manner. Anti-cancer drugs. 25 (7), 819-825 (2014).
