Hier presenteren we een protocol om vlas te transformeren met behulp van Agrobacterium-gemedieerde transformatie van planten via florale-dip. Dit protocol is eenvoudig uit te voeren en goedkoop, maar levert een hogere transformatie tarief dan de huidige beschikbare methoden voor vlas transformatie.
Agrobacterium-gemedieerde plantentransformatie via floral dip is een veel gebruikte techniek op het gebied van plantentransformatie en gerapporteerd succesvol voor vele plantensoorten. Echter, vlas (Linum usitatissimum) transformatie door florale-dip niet gemeld. Het doel van dit protocol is dat Agrobacterium stellen en floral dip werkwijze kan worden gebruikt om transgene vlas genereren. We tonen aan dat deze techniek is eenvoudig, goedkoop, efficiënt, en nog belangrijker, geeft een hogere omzettingssnelheid dan de huidige beschikbare wijzen van vlas transformatie.
Samengevat, werden bloeiwijzen van vlas gedompeld in een oplossing van Agrobacterium die een binaire vector plasmide (T-DNA-fragment plus het Linum insertiesequentie, LIS-1) 1 – 2 min. De planten werden plat gelegd op hun kant voor 24 uur. Daarna werden planten gehandhaafd onder normale groeiomstandigheden tot de volgende behandeling. Het proces3 keer, met ongeveer 10 – – s van dompelen werd 2 herhaald 14 dagen intervallen tussen dompelen. De T1 zaden werden verzameld en ontkiemd op de grond. Na ongeveer twee weken werden behandeld nakomelingen getest door directe PCR; 2-3 bladeren werden gebruikt per plant plus de geschikte T-DNA-primers. Positieve transformanten werden geselecteerd en gegroeid naar volwassenheid. De omzettingssnelheid was onverwacht hoog, 50 – 60% van de zaden van behandelde planten positief transformanten. Dit is een hogere omzettingssnelheid dan die gerapporteerd voor Arabidopsis thaliana en andere plantensoorten, met behulp van bloemen-dip transformatie. Het is ook de hoogste die tot dusver gerapporteerd, vlas transformatie met andere methoden voor transformatie.
Vlas (Linum usitatissimum) is een belangrijk gewas op grote schaal gekweekt voor zijn vezels en oliën. Transformatie van de vlas genoom mogelijk technieken zoals verwonding Agrobacterium infectie en het tezamen kweken in weefselkweek, aanbrengen biolistische deeltjes of ultrageluid sonicatie gevolgd door regeneratie. Maar deze technieken hebben vele nadelen, waaronder neiging om veel mutatie gebeurtenissen en langere tijd de transgene lijnen te verkrijgen. Sommige van deze methoden kan ook duur en vereisen deskundige en efficiënte manipulatie van de instrumenten, resulterend in lage herstel zaailingen. Belangrijker nog, deze techniek die vaak resulteren in een lage transformatie tarieven 2,6.
Agrobacterium-gemedieerde plantentransformatie via floral dip is een eenvoudige en efficiënte aanpak om transgene planten te genereren. Het is routinematig en met succes gebruikt voor vele plantensoorten zoals Arabidopsis Thalianeen 1,4, Medicago truncatula 11, 12 tomaat, tarwe en maïs 13 10. Er is echter niet gezien als een levensvatbare techniek voor vlas transformatie door verschillende factoren, zoals het lage aantal bloemen door vlas, beperkt aantal zaden verkregen uit elke bloem, het grote zaadgrootte en de dikke laag, die ook problematisch dergelijke genetische transformatie proces kan zijn. Daarnaast is de selectie segment van de bloemen-dip techniek vereist kiemende getransformeerd zaden op een plant media met een antibioticum, met getransformeerd nakomelingen onderscheiden op basis van hun vermogen om te ontkiemen en groen blijven, terwijl niet-getransformeerde nakomelingen ofwel niet ontkiemen of ontkiemen maar bleekwater snel uit en sterven. In de huidige literatuur is geconstateerd dat wildtype vlas neiging hoge concentratie antibioticum selecties ontsnappen, waardoor vals positieve resultaten en de selectie van T1 nageslachten gebaseerdeover antibioticaresistentie moeilijker 6,14. Ook bij een hoge concentratie van antibioticum toegevoegd aan het selectiemedium, de snelheid van de waargenomen verandering drastisch gedaald 9.
In dit protocol, gebruikten we Agrobacterium en florale-dip werkwijze om een lijn van vezelvlas Stormont Cirrus (responsief en kunststof), waarvan is aangetoond reageren spanningen in het milieu door het veranderen van het genoom 3,5 transformeren. Tegen het antibioticum ontsnapping probleem op te lossen, hebben wij ervoor gekozen om directe PCR testen van DNA van T1 bladeren te doen, in plaats van de selectie door het toevoegen van het antibioticum aan de plant media. We maakten gebruik van de eenvoudige anatomie van vlas specifieke bloemen bij de behandeling te volgen. Dit volgsysteem toegestaan selectie van zaden van bepaalde bloemen en kieming op de bodem zonder toevoeging van antibiotica. Positieve transformanten werden gewoon geïdentificeerd door het testen van DNA verkregen uit de bladeren met behulp van de snelle en efficiënte methode of directe PCR. Onze resultaten tonen aan dat de bloem-dip methode werkt goed in deze lijn vlas en verrassend tot een zeer hoge omzettingssnelheid (50 – 60%), hoger dan eerder waargenomen voor Arabidopsis thaliana, die naar verluidt 0,1-1 % 1, en ook hoger dan andere plantensoorten 10,12. We testten ook een verscheidenheid van lijnzaad (vlas olie), Bethune (stabiel en niet-responsief) en onze voorlopige gegevens blijkt dat floral dip werkt ook voor deze variëteit van vlas.
Het doel van dit protocol is aangetoond dat Agrobacterium en bloem-dip kan worden gebruikt om transgene vlas genereren. We tonen aan dat deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en sneller dan andere methoden van vlas transformatie. Belangrijker resulteert in een veel hogere omzettingssnelheid dan andere methoden van vlas transformatie 2,6. De anatomie van Arabidopsis thaliana, die vele takken en bloemen heeft, makes het moeilijk om onderscheid te maken ondergedompeld en niet-ondergedompeld bloemen op dezelfde plant. Daarom is een groot aantal zaden, ongeveer 20.000 zaden per plant, moeten worden gescreend om positieve transformanten 8 identificeren. Vlas, daarentegen, heeft minder vertakkingen (een hoofdtak en enkele zijtakken) en minder bloemen produceert ongeveer 100 zaden per plant, waardoor het afzonderlijke bloemen te volgen en om specifiek zaad bij screening proces te selecteren.
Wij stellen voor dat de bloemen-dip is een toepasbare methode om eventuele verwante soort van vlas, een geslacht van ongeveer 200 soorten te transformeren. Deze methode geeft veel hogere omzettingssnelheid dan andere methoden van vlas transformatie. We stellen ook dat de directe PCR-screening van T1 blad DNA is een efficiënte manier om het probleem van de antibioticaresistentie ontsnapping die vaak produceert veel valse positieven te overwinnen. Directe PCR screening kan worden toegepast op elke andere plantensoorten en niet beperkt to vlas. De eenvoudige zaad volgen toegepaste techniek in dit protocol kan worden toegepast op andere plantensoorten met vertakking anatomie vergelijkbaar vlas.
In sommige plantensoorten, zoals vlas (Linum usitatissimum), succesvol plantentransformatie beperkt. Eerder heeft de transformatie in de sector vezelvlas een Agrobacterium-infectie vereist door verwonden en co-teelt, het aanbrengen van biolistische deeltjes of met behulp van ultrasone geluidsgolven, gevolgd door regeneratie; een proces dat zowel lang en gevoelig voor gepaard met vele mutatie gebeurtenissen. Bovendien is de selectie van deze technieken is het gebruik van antibiotica selecteerbare merkers zoals kanamycine. Er is echter geconstateerd in de literatuur die deze selectiemethode produceert veel valse positieven, vlas neiging om hoge concentraties antibiotica 6,9,14 ontsnappen. Een ander nadeel van de voorgaande technieken vlas transformatie de lage omzettingssnelheid 2,6 geweest.
In de hier beschreven protocol, Agrobacterium-gemedieerde transformatie van planten via florale-dompelen werd getoondresulteren in een hoge omzettingssnelheid vlas (50 – 60%). Transformanten werden verkregen van bloemen gedoopt en verzameld van hoofd- en zijtakken. Selectie van positieve transformanten werd gedaan door simpelweg groeiende T1 planten op de bodem en het screenen van hun bladeren kort nadat ze ontkiemd, het omzeilen van het gebruik van antibiotica-selectie, een stap die eerder gebruikt als een norm in bloemen-dip voor andere plantensoorten. Door het uitvoeren van directe PCR testen van bladeren en met de geschikte T-DNA primers, kunnen positieve transformanten snel worden geselecteerd. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop en gemakkelijk uit te voeren, maar resulteert in een veel hogere omzettingssnelheid dan eerder gerapporteerde Arabidopsis en andere plantensoorten met deze methode 1,10,12. Het is ook de hoogste gemelde transformatie tarief voor vlas.
Er zijn kritische stappen in de procedures inclusief de selectie van de beste bloemstadium en de beste surfactant concentratie, zodatAgrobacterium kan doordringen in de plantencellen zonder het doden van de bloemorganen. Als een vroeg knopstadium wordt gebruikt (figuur 2A) met een hoge Silwet-77 concentratie van meer dan 0,05%, zal de bloem niet ontwikkelen noch ingesteld zaden. Als late bud fase gebruikt (figuur 2C), hoewel de transformatie zou kunnen werken, zal optreden met een veel lagere snelheid. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Arabidopsis bloemen dip transformatie 1,4. Voor dit protocol werden alle bloemen fasen getest met verschillende Silwet-77 concentraties en de beste fase werd bepaald aan de middelste knop fase (figuur 2C) met Silwet-77 0.05% voor de eerste dompelen, gevolgd door een tweede dompelen in het late stadium knop (figuur 2C) met een iets lagere Silwet-77 concentratie van 0,03%. De transformatie werkte ook goed met de eerste kiem stadium (figuur 2A) met een lage Silwet-77 concentratie van 0,003%, gevolgd dooreen tweede dompelen met middelste knop stadium (figuur 2B) bij hogere Silwet-77 concentratie van 0,05%.
In dit protocol, werden een aantal andere parameters geprobeerd om de transformatie tarief te optimaliseren, maar vond geen effecten op het uiteindelijke resultaat te hebben. Voorbeelden hiervan verlenging van de na onderdompelen dat de planten leggen aan hun kant en bedekt met plastic van een dag tot twee dagen; met een OD van meer dan 1 voor Agrobacterium kweek, in plaats van 0,5-1; verhogen van de dompeltijd 5 – 15 min in plaats van 1-2 min. Wederom hebben we niet opgevallen geen effect op de transformatie tarief met behulp van deze strategieën. De meest effectieve factoren echter bleken te zijn met gezonde planten op de juiste bloem stadia, en met de beste Silwet-77 concentratie. We hebben gemerkt dat twee dompelen intervallen, werkt een of andere manier beter dan één keer, ook al een keer dompelen werkt ook.
Wijziging van dit protocol kan worden bereikt door reducinG de Silwet-77 concentratie slechts 0,003% in het tweede of derde dompelen. Aangezien Silwet-77 toxisch, te hoge concentratie resulteert in de ontwikkeling van bloemen slecht, waardoor er geen zaadopbrengst. Het dompelen frequentie kan worden teruggebracht tot één, met de tweede of derde gebeurtenissen geëlimineerd als de planten zijn niet gezond uit en de knoppen zijn niet goed ontwikkelen.
Een belangrijke beperking van deze techniek is het lage aantal bloemen door de vlas, het beperkte aantal zaden verkregen uit elke bloem en de lange levensduur van vlas. Het duurt 6-8 weken uit zaad zaaien naar de primaire knoppen klaar voor de eerste dompelen en een extra 8 hebben – 10 weken na het dompelen van de T1 generatie te krijgen. In totaal werd een bereik van 5 – 6 maanden nodig T1 generatie verkrijgen. In tegenstelling tot andere plantensoorten, die bloem op elk moment van het jaar, wat vlas rassen bloem beter op bepaalde tijden van het jaar. Dus doordachte planning voor deze techniek is belangrijk.
<p class = "jove_content"> In het kort, onze resultaten van bloemen duik met twee verschillende vlas rassen: de vezelvlas, Stormont Cirrus (responsief en plastic), en de olie vlas, Bethune (stabiel en niet-responsieve), laten zien dat Agrobacterium – gemedieerde plantentransformatie via bloem-dip een uitvoerbaar en efficiënte methode voor vlas transformatie en kan worden gebruikt om de eerder gebruikte technieken voor vlas transformatie vervangen. De wijzigingen van de bloemen-dip-methode in dit protocol van toepassing zal zijn voor gebruik met andere plantensoorten en niet beperkt tot vlas zijn.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |