Ici, nous présentons un protocole de transformer le lin en utilisant Agrobacterium transformation de plante médiée par l'intermédiaire floral creux. Ce protocole est simple à réaliser et peu coûteux, mais donne un taux de transformation plus élevé que les procédés actuellement disponibles pour la transformation de lin.
Agrobacterium transformation de plante médiée par immersion florale est une technique largement utilisée dans le domaine de la transformation des plantes et a été rapporté comme étant efficace pour de nombreuses espèces végétales. Toutefois, le lin (Linum usitatissimum) par transformation floral creux n'a pas été signalée. L'objectif de ce protocole est d'établir que la méthode Agrobacterium et floral creux peut être utilisé pour générer le lin transgénique. Nous montrons que cette technique est simple, peu coûteux, efficace, et plus important encore, donne un taux de transformation plus élevé que les méthodes actuellement disponibles de la transformation de lin.
En résumé, les inflorescences de lin ont été plongées dans une solution d'Agrobacterium portant un plasmide vecteur binaire (fragment d'ADN-T en plus de la séquence d'insertion Linum, LIS-1) pour 1 à 2 min. Les plantes ont été posées à plat sur le côté pendant 24 heures. Ensuite, les plantes ont été maintenues dans des conditions de croissance normales jusqu'à ce que le traitement suivant. Les procèss d'immersion a été répétée 2-3 fois, avec environ 10 à 14 jours d'intervalle entre trempage. Les graines T1 ont été recueillies et mises à germer sur le sol. Après environ deux semaines, descendances traités ont été testés par PCR directe; 2-3 feuilles ont été utilisés par plante ainsi que les amorces d'ADN-T appropriées. Les transformants positifs ont été sélectionnés et cultivés jusqu'à maturité. Le taux de transformation est étonnamment élevé, avec 50 à 60% des semences de plantes traitées étant transformants positifs. Ce est un taux de transformation plus élevés que ceux rapportés pour Arabidopsis thaliana et d'autres espèces de plantes, en utilisant la transformation floral creux. Ce est aussi le plus élevé, qui a été rapporté à ce jour, pour la transformation de lin à l'aide d'autres méthodes de transformation.
Lin (Linum usitatissimum) est une culture importante largement cultivé pour ses fibres et les huiles. La transformation du génome de lin est possible avec des techniques telles que la blessure, infection par Agrobacterium, et la co-culture dans une culture de tissu, à appliquer des particules biolistiques ou des ultrasons sonication suivie d'une régénération. Cependant, ces techniques présentent de nombreux inconvénients, notamment la propension à de nombreux événements de mutation et une période prolongée afin d'obtenir les lignées transgéniques. Certaines de ces méthodes peuvent également être coûteux et nécessitent une manipulation efficace du métier et des instruments, ce qui entraîne des plants de récupération faible. Plus important encore, ces techniques entraînent souvent des taux de transformation de faibles 2,6.
Agrobacterium transformation de plante médiée par l'intermédiaire floral creux est une approche simple et efficace pour générer des plantes transgéniques. Il a été utilisé avec succès et de façon routinière pour de nombreuses espèces de plantes telles que Arabidopsis Thalianun 1,4, Medicago truncatula 11, 12 tomate, le blé et le maïs 13 10. Cependant, il n'a pas été considéré comme une technique viable pour la transformation du lin en raison de plusieurs facteurs, tels que le faible nombre de fleurs produites par le lin, le nombre limité de graines obtenues à partir de chaque fleur, la grande taille des semences, et la couche épaisse, qui peut aussi être problématique pour un tel procédé de transformation génétique. En outre, le segment de sélection de la technique floral creux nécessite la germination des graines transformées sur un support végétal contenant un antibiotique, avec descendances transformées distingués en fonction de leur capacité à germer et rester vert, alors que les descendants non transformée, soit ne pas germer ou germer, mais l'eau de Javel rapidement et mourir. Dans la littérature actuelle, il a été noté que de type sauvage lin a tendance à échapper à forte concentration de sélections antibiotiques, produire de faux résultats positifs, et de faire la sélection des descendances T1 basesur la résistance aux antibiotiques plus difficile 6,14. En outre, quand une forte concentration d'antibiotique a été ajouté au milieu de sélection, le taux de transformation a chuté considérablement observée neuf.
Dans ce protocole, nous avons utilisé la méthode Agrobacterium et floral creux de transformer une ligne de lin textile, Stormont Cirrus (réactif et plastique), qui a été montré pour répondre aux contraintes de l'environnement en modifiant son génome 3,5. Pour surmonter le problème d'échappement antibiotique, nous avons choisi de faire des tests PCR directe de l'ADN à partir de feuilles de T1, au lieu de la sélection en ajoutant l'antibiotique aux médias de l'usine. Nous avons profité de simple anatomie de lin pour suivre fleurs spécifiques au moment du traitement. Ce système de suivi a permis la sélection des graines de fleurs et la germination spécifiques sur le sol sans ajouter antibiotique. Transformants positifs ont été tout simplement identifiés par des tests ADN obtenu à partir de feuilles en utilisant le rapide et efficace méthode of PCR directe. Nos résultats démontrent que la méthode floral creux fonctionnait très bien dans cette ligne de lin et étonnamment abouti à un taux de transformation très élevé (50-60%), le plus élevé que ceux précédemment observés pour Arabidopsis thaliana, qui a été signalé à être de 0,1 à 1 1%, et aussi élevés que d'autres espèces végétales 10,12. Nous avons également testé une autre variété de lin (lin oléagineux), Bethune (stable et non réactive), et nos données préliminaires indiquent que floral creux travaille également pour cette variété de lin.
L'objectif de ce protocole est de montrer que Agrobacterium et floral creux peuvent être utilisés pour générer le lin transgénique. On montre que cette technique est simple, peu coûteuse et plus rapide que d'autres méthodes de transformation de lin. Plus important encore, il en résulte un taux de transformation beaucoup plus élevé que les autres méthodes de lin 2,6 transformation. L'anatomie d'Arabidopsis thaliana, qui a beaucoup de branches et de fleurs, makes difficile de distinguer trempé et non trempé fleurs sur la même plante. Par conséquent, un grand nombre de graines, environ 20 000 graines par plante, doivent subir un dépistage pour identifier les transformants positifs 8. Lin, d'autre part, a moins de branches (une branche principale et quelques branches latérales) et moins de fleurs, produisant environ 100 graines par les plantes, ce qui permet de suivre les fleurs individuelles et pour sélectionner semences spécifiques pendant le processus de dépistage.
Nous proposons que floral creux est une méthode applicable à transformer des espèces apparentées de lin, un genre d'environ 200 espèces. Cette méthode donne des taux de transformation beaucoup plus élevés que d'autres méthodes de transformation de lin. Nous proposons également que le dépistage PCR directe de l'ADN T1 feuille est un moyen efficace de résoudre le problème de l'évasion de la résistance aux antibiotiques qui produit souvent de nombreux faux positifs. Criblage PCR directe peut être appliquée à toutes les autres espèces de plantes et ne est pas limitée to lin. La technique simple de suivi de semences employée dans ce protocole peut être appliqué à d'autres espèces de plantes avec ramification anatomie similaire à lin.
Dans certaines espèces végétales, telles que le lin (Linum usitatissimum), la transformation de plantes avec succès a été limité. Auparavant, la transformation du lin a exigé une infection par Agrobacterium en blessant et co-culture, appliquer des particules biolistiques ou en utilisant des ultrasons sonication, suivie par la régénération; un processus qui est à la fois long et sujettes à être accompagné par de nombreux événements de mutation. En outre, le procédé de sélection de ces techniques nécessite l'utilisation de marqueurs de sélection d'antibiotiques tels que la kanamycine. Cependant, il a été noté dans la littérature que cette méthode de sélection produit un grand nombre de faux positifs, comme le lin a tendance à se échapper de fortes concentrations d'antibiotiques 6,9,14. Un autre inconvénient des techniques précédentes dans la transformation de lin a été le taux de transformation de faibles 2,6.
Dans le protocole décrit ici, Agrobacterium transformation végétale médiée par trempage floral a été montrépour aboutir à un taux de transformation élevé pour le lin (50 – 60%). Les transformants ont été obtenus à partir de fleurs de croisement et recueillies auprès des principales et secondaires branches. Sélection de transformants positifs a été fait simplement en cultivant des plantes T1 sur le sol et le dépistage leurs feuilles dès qu'elles ont germé, sans passer par l'utilisation de la sélection antibiotique, une étape précédemment utilisé comme norme dans floral creux pour d'autres espèces de plantes. En effectuant des essais de PCR directe de feuilles, et en utilisant les amorces d'ADN-T appropriées, des transformants positifs peuvent être rapidement sélectionnées. Cette technique est simple, peu coûteux et facile à réaliser, mais donne un taux de transformation beaucoup plus élevés que ceux précédemment rapportés pour Arabidopsis et d'autres espèces de plantes en utilisant cette méthode 1,10,12. Ce est aussi le taux de transformation la plus élevée signalée pour le lin.
Cependant, il ya des étapes critiques dans les procédures, y compris la sélection de la meilleure stade de la floraison et la meilleure concentration en tensioactif, de sorte queAgrobacterium peut pénétrer dans les cellules de plante sans tuer les organes floraux. Si un stade précoce des boutons est utilisé (figure 2A) avec une concentration élevée Silwet-77 de plus de 0,05%, la fleur ne se développera pas, ni mettre en graines. Si stade tardif des bourgeons est utilisé (figure 2C), bien que la transformation pourrait fonctionner, il va se produire à un rythme beaucoup plus faible. Des résultats similaires ont été obtenus avec Arabidopsis dip floral transformation 1,4. Pour ce protocole, toutes les étapes floraux ont été testés avec différents Silwet-77 concentrations et le meilleur stade était déterminé à être le stade du bouton du milieu (figure 2C) avec Silwet-77 à 0,05% pour la première immersion, suivie d'une seconde immersion au la fin du stade du bourgeon (figure 2C) avec une concentration Silwet-77 légèrement réduit de 0,03%. La transformation a également bien fonctionné en utilisant le stade du bouton (Figure 2A) avec une faible concentration Silwet-77 de 0,003%, suivie parun deuxième trempage avec stade du bouton du milieu (figure 2B) à une concentration plus élevée Silwet-77 de 0,05%.
Dans ce protocole, d'autres paramètres ont été tentées pour optimiser le taux de transformation, mais je ai trouvé ne avoir aucun effet sur le résultat final. Les exemples incluent proroge le délai après trempage que les plantes mettent sur leur côté et couverts en plastique d'une journée à deux jours; en utilisant une DO de plus de 1 pour la culture d'Agrobacterium, au lieu de 0,5 à 1; l'augmentation du temps d'immersion de 5 à 15 min au lieu de 1 à 2 min. Encore une fois nous ne avons pas remarqué aucun effet sur le taux de transformation à l'aide de ces stratégies. Les facteurs les plus efficaces, cependant, ont été trouvés à l'aide de plantes saines aux stades de fleurs correctes, et en utilisant la meilleure concentration Silwet-77. Nous avons remarqué que deux intervalles de trempage, fonctionne en quelque sorte mieux que une seule fois, même si une immersion de temps fonctionne aussi.
Modification de ce protocole peut être atteint par Reducing la concentration Silwet-77 à aussi peu que 0,003% dans le deuxième ou le troisième trempage. Depuis Silwet-77 est toxique, une trop forte concentration entraîne les fleurs développent mal, résultant en un rien de rendement en graines. La fréquence d'immersion peut être réduit à un, avec les deuxième ou troisième événements éliminés si les plantes ne sont pas à la recherche en santé et les bourgeons ne se développent pas bien.
Une limitation majeure de cette technique est le faible nombre de fleurs produites par le lin, le nombre limité de graines obtenues à partir de chaque fleur, et le cycle de lin longue durée de vie. Il prend 6-8 semaines à partir de semis d'avoir les bourgeons primaires prêts pour la première immersion et un 8 supplémentaires – 10 semaines post-trempage pour se rendre à la génération T1. Au total, une gamme de 5 – 6 mois est nécessaire pour obtenir la génération T1. Contrairement à d'autres espèces de plantes, qui fleurissent à tout moment de l'année, certaines variétés de lin fleur mieux à des moments précis de l'année. Donc, la planification réfléchie pour cette technique est important.
<p class = "jove_content"> En résumé, nos résultats d'immersion florale avec deux variétés de lin différents: le lin textile, Stormont Cirrus (de plastique souple et), et le lin oléagineux, Bethune (stable et non réactive), montrent que Agrobacterium – transformation de plante médiée par immersion florale est une méthode applicable et efficace pour la transformation de lin et peut être utilisé pour remplacer les techniques précédemment utilisées pour la transformation du lin. Les modifications de la méthode floral creux dans ce protocole seront en vigueur pour une utilisation avec d'autres espèces végétales et non limité à lin.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |