Her præsenterer vi en protokol til at omdanne hør hjælp Agrobacterium-medieret plantetransformation via blomster-dip. Denne protokol er enkel at udføre og billig, men giver en højere transformation end de nuværende tilgængelige metoder til hør transformation.
Agrobacterium-medieret plantetransformation via Floral dip er en almindeligt anvendt teknik inden for plantetransformation og er blevet rapporteret at være en succes for mange plantearter. Imidlertid har hør (Linum usitatissimum) transformation af blomster-dip ikke blevet rapporteret. Målet med denne protokol er at fastslå, at Agrobacterium og blomster-dip metode kan bruges til at generere transgene hør. Vi viser, at denne teknik er enkel, billig, effektiv, og endnu vigtigere, giver en højere omdannelse end de nuværende tilgængelige metoder hør transformation.
Sammenfattende blev blomsterstande af hør dyppet i en opløsning af Agrobacterium bærer en binær vektor plasmid (T-DNA-fragment plus Linum insertionssekvensen, LIS-1) til 1 – 2 min. Planterne blev lagt fladt på deres side i 24 timer. Derefter blev planterne holdt under normale vækstbetingelser, indtil den næste behandling. De process af dypning blev gentaget 2 – 3 gange, med cirka 10-14 dages interval mellem dypning. T1 frø blev indsamlet og spiret på jord. Efter cirka to uger, blev behandlet afkom testet ved direkte PCR; 2 – 3 blade blev anvendt per plante plus de passende T-DNA-primere. Positive transformanter blev udvalgt og dyrket til modenhed. Forvandlingen sats var uventet høj, idet 50 – 60% af frøene fra behandlede planter være positiv transformanter. Det er en højere transformation end dem, der rapporteres for Arabidopsis thaliana og andre plantearter, der bruger floral-dip transformation. Det er også den højeste, der er rapporteret hidtil, for hør transformation ved hjælp af andre metoder til transformation.
Hør (Linum usitatissimum) er en vigtig afgrøde dyrkes bredt for sine fibre og olier. Transformation af hør genomet er muligt med teknikker såsom sårdannelse, Agrobacterium infektion og samdyrkning i vævskultur under anvendelse biolistiske partikler eller ultralyd sonikering efterfulgt af regenerering. Men disse teknikker har mange ulemper, herunder tilbøjelighed til mange mutationsbegivenheder og en længere tid til opnåelse af de transgene linjer. Nogle af disse metoder kan også være dyrt og kræver dygtige og effektiv manipulation af instrumenterne, hvilket resulterer i lave recovery frøplanter. Vigtigst disse teknik resulterer ofte i lave Omsætningshastighederne 2,6.
Agrobacterium-medieret plantetransformation via Floral dip er en enkel og effektiv metode til at generere transgene planter. Det er blevet rutinemæssigt og med held anvendes til mange plantearter såsom Arabidopsis Thalianen 1,4, Medicago truncatula 11, tomat 12, hvede 13 og majs 10. Det har imidlertid ikke været tænkt på som en levedygtig teknik til hør transformation på grund af flere faktorer, såsom det lave antal af blomster fremstillet ved hør, begrænset antal af frø opnået fra hver blomst, den store frø størrelse og tyk pels, som også kan være problematisk for en sådan genetisk transformationsproces. Derudover udvælgelse segment af blomster-dip teknik kræver spire transformerede frø på en plante medier indeholdende et antibiotikum, med transformerede afkom skelnes baseret på deres evne til at spire og blive grøn, mens ikke-transformerede afkom enten ikke spire eller spire men blegemiddel hurtigt og dø. I den nuværende litteratur er det blevet bemærket, at vildtype-hør tendens til at undslippe høj koncentration af antibiotika valg, der producerer falske positive resultater, og at udvælgelsen af T1 afkom baseretom antibiotikaresistens sværere 6,14. Også, når en høj koncentration af antibiotikum blev tilsat til selektionsmedium, hastigheden af observerede transformation faldt dramatisk 9.
I denne protokol, vi brugte Agrobacterium og blomster-dip metode til at omdanne en linje af spindhør, Stormont cirrus (lydhør og plast), som har vist sig at reagere på spændinger i miljøet ved at ændre dets genom 3,5. For at overvinde den antibiotiske escape problem har vi valgt at gøre direkte PCR-analyse af DNA fra T1 blade i stedet for valget ved at tilsætte antibiotika til anlægget medier. Vi benyttede sig af den simple anatomi hør til at spore specifikke blomster på tidspunktet for behandlingen. Denne tracking system tillod udvælgelse af frø fra bestemte blomster og spiring på jorden uden at tilføje antibiotikum. Positive transformanter blev simpelthen identificeres ved at teste DNA opnået fra blade ved hjælp af en hurtig og effektiv metode of direkte PCR. Vores resultater viser, at blomster-dip metoden virker meget godt i denne linje af hør og overraskende resulterede i en meget høj transformation rate (50 – 60%), højere end dem, der tidligere er observeret for Arabidopsis thaliana, som blev rapporteret til at være 0,1-1 % 1, og også højere end andre plantearter 10,12. Vi testede også en anden sort af hørfrø (oliehør), Bethune (stabil og ikke-responderende), og vores foreløbige data tyder på, at blomster-dip arbejder også for denne sort af hør.
Målet med denne protokol er at vise, at Agrobacterium og blomster-dip kan bruges til at generere transgene hør. Vi viser, at denne teknik er enkel, billig og hurtigere end andre metoder til hør transformation. Vigtigere det resulterer i en meget højere transformation end de andre metoder til hør transformation 2,6. Anatomi Arabidopsis thaliana, som har mange grene og blomster, makes det vanskeligt at skelne dyppet og ikke-dyppet blomster på samme plante. Derfor stort antal frø, ca. 20.000 frø pr plante, skal screenes for at identificere positive transformanter 8. Hør, på den anden side, har færre grene (én vigtigste gren og et par side filialer) og færre blomster, der producerer ca. 100 frø pr planter, hvilket gør det muligt at spore enkelte blomster og til at vælge særlige frø under screening proces.
Vi foreslår, at blomster-dip er en anvendelig metode til at omdanne eventuelle relaterede arter af hør, en slægt af omkring 200 arter. Denne metode giver meget højere transformation end andre metoder til hør transformation. Vi foreslår også, at den direkte PCR screening af T1 blad DNA er en effektiv måde at løse problemet med antibiotikaresistens flugt, der ofte producerer mange falske positiver. Direkte PCR-screening kan anvendes til alle andre plantearter og er ikke begrænset to hør. Den enkle sporing frø teknik anvendes i denne protokol kan anvendes til alle andre plantearter med forgrening anatomi ligner hør.
I nogle plantearter, såsom hør (Linum usitatissimum), har vellykket plantetransformation været begrænset. Tidligere har transformation i hør kræves en Agrobacterium infektion ved såret og co-dyrkning, anvendelse biolistiske partikler eller ved hjælp af ultralyd lydbehandling, efterfulgt af regenerering; en proces, der er både lange og tilbøjelige til at blive ledsaget af mange mutationsbegivenheder. Desuden udvælgelsesprocessen af disse teknikker kræver anvendelse af antibiotiske selekterbare markører, såsom kanamycin. Imidlertid er det blevet bemærket i litteraturen, at denne metode til udvælgelse producerer mange falske positiver, som hør har tendens til at undslippe høje koncentrationer af antibiotika 6,9,14. En anden ulempe ved de tidligere teknikker i hør transformation har været de lave Omsætningshastighederne 2,6.
I protokollen beskrevet her, blev Agrobacterium-medieret plantetransformation via blomster-dypning vistat resultere i en høj transformation rate for hør (50 – 60%). Transformanter blev opnået fra blomster dyppet og indsamlet fra de vigtigste og sidegrene. Udvælgelse af positive transformanter blev simpelthen gjort ved dyrkning T1 planter på jord og screening deres blade kort efter de spirede, at omgå anvendelsen af antibiotika udvælgelse, der tidligere et skridt bruges som normen i blomstret-dip til andre plantearter. Ved at udføre direkte PCR-analyse af blade, og anvendelse af de egnede T-DNA-primere kan positive transformanter hurtigt valgt. Denne teknik er enkel, billig og let at udføre, men resulterer i en meget højere transformation end dem, der tidligere er rapporteret for Arabidopsis og andre plantearter ved hjælp af denne metode 1,10,12. Det er også den højeste rapporterede transformation sats for hør.
Men der er kritiske trin i procedurerne, herunder udvælgelse af de bedste blomst scenen og den bedste koncentration overfladeaktive såAgrobacterium kan trænge ind i planteceller uden at dræbe blomsten organer. Hvis et tidligt knopstadiet anvendes (figur 2A) med høj Silwet-77 koncentration på mere end 0,05%, vil blomsten ikke udvikle eller indføre frø. Hvis sent knopstadiet bruges (figur 2C), selv om omdannelsen kan arbejde, vil det ske på et langt lavere sats. Lignende resultater blev opnået med Arabidopsis floral dip transformation 1,4. Til denne protokol blev alle floral faser testet med forskellige Silwet-77 koncentrationer og den bedste fase blev bestemt til at være den midterste knopstadiet (figur 2C) med Silwet-77 på 0,05% for den første dypning, efterfulgt af en anden dypning ved den sene knopstadiet (figur 2C) med en lidt reduceret Silwet-77 koncentration på 0,03%. Omdannelsen fungerede også godt ved hjælp af den tidlige knopstadiet (figur 2A) med en lav Silwet-77 koncentration på 0,003%, efterfulgt afen anden dypning med midterste knopstadiet (figur 2B) ved højere Silwet-77 koncentration på 0,05%.
I denne protokol, blev nogle andre parametre forsøgt at optimere omdannelsen sats, men fundet at have nogen effekt på det endelige resultat. Som eksempler kan nævnes udvidelse af tid efter dypning, at planterne lå på deres side og dækket i plast fra den ene dag til to dage; ved hjælp af en OD på mere end 1 for Agrobacterium kultur, i stedet for 0,5-1; øge dypning tid til 5 – 15 min i stedet for 1-2 min. Igen har vi ikke bemærket nogen effekt på transformation sats at bruge disse strategier. De mest effektive faktorer imidlertid viste sig at være ved hjælp af sunde planter på de korrekte blomst etaper, og ved hjælp af den bedste Silwet-77 koncentration. Vi bemærkede, at to dypning intervaller, arbejder eller anden måde bedre end en gang, selv om en gang dypning også fungerer.
Ændring af denne protokol kan opnås ved reducing den Silwet-77-koncentration til så lidt som 0,003% i det andet eller tredje dypning. Da Silwet-77 er giftigt, for høj koncentration resulterer i blomsterne udvikler dårligt, hvilket resulterer i ingen frøudbytte. Den dypning frekvens kan reduceres til én, med den anden eller tredje begivenheder fjernes, hvis planterne ikke ser sundt og knopperne ikke udvikler godt.
En væsentlig begrænsning ved denne teknik er det lave antal af blomster fremstillet af hør, det begrænsede antal af frø opnået fra hver blomst, og den lange levetid af hør. Det tager 6 – 8 uger frø såning til at have de primære knopper klar til den første dypning og yderligere 8-10 uger efter dypning for at komme til T1 generation. I alt en række af 5 – der er behov for 6 måneder til opnåelse af T1 generation. I modsætning til andre plantearter, der blomstrer helst tidspunkt af året, nogle hørsorter blomst bedre på bestemte tidspunkter af året. Så tankevækkende planlægning for denne teknik er vigtig.
<p class = "jove_content"> Sammenfattende vores resultater af blomster dip med to forskellige hør sorter: fiber hør, Stormont Cirrus (lydhør og plast), og olien hør, Bethune (stabil og ikke-responderende), viser, at Agrobacterium – medieret plantetransformation via Floral dip er en anvendelig og effektiv metode til hør transformation og kan anvendes til at erstatte de tidligere anvendte teknikker for hør transformation. De ændringer af blomster-dip metoden i denne protokol finder anvendelse til brug med andre plantearter, og ikke begrænset til hør.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |