Her presenterer vi en protokoll for å forvandle lin hjelp Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dip. Denne protokollen er enkel å utføre og billig, men likevel gir en høyere transformasjon rente enn dagens tilgjengelige metoder for lin transformasjon.
Agrobacterium-formidlet transformasjon anlegget via blomster-dip er en mye brukt teknikk innen plantetransformasjon og har blitt rapportert å være vellykket for mange plantearter. Imidlertid har lin (Linum usitatissimum) transformasjon av floral-dip ikke blitt rapportert. Målet med denne protokollen er å fastslå at Agrobacterium og floral-dip metoden kan brukes til å generere transgene lin. Vi viser at denne teknikken er enkel, billig og effektiv, og enda viktigere, gir en høyere transformasjon rente enn dagens tilgjengelige metoder for lin transformasjon.
Oppsummert ble blomsterstander av lin dyppet i en oppløsning av Agrobacterium bærer en binær vektor plasmid (T-DNA-fragmentet pluss Linum innskuddssekvens, LIS-1), 1 – 2 min. Plantene ble lagt flatt på sin side i 24 timer. Deretter planter ble opprettholdt under normale vekstforhold frem til neste behandling. Forarbeides av dipping ble gjentatt 2-3 ganger, med ca 10 – 14 dagers mellomrom mellom dipping. Den T1 frø ble samlet og spiret på jord. Etter ca to uker, ble behandlet progenies testet ved direkte PCR; 2-3 blader ble brukt per plante pluss de passende T-DNA-primere. Positive transformanter ble valgt ut og vokst til forfall. Omformingen raten var uventet høy, med 50 – 60% av frøene fra behandlede planter blir positive transformanter. Dette er en høyere transformasjon rente enn det som er rapportert for Arabidopsis thaliana og andre plantearter, ved hjelp av floral-dip transformasjon. Det er også den høyeste, som har blitt rapportert så langt, for lin transformasjon ved hjelp av andre metoder for transformasjon.
Lin (Linum usitatissimum) er en viktig avling dyrkes mye for sine fiber og oljer. Transformasjon av lin-genom som er mulig med teknikker som såret, Agrobacterium-infeksjon, og ko-dyrking i vevskultur, påføring biolistic partikler eller ultralyd sonikering, etterfulgt av regenerering. Imidlertid har disse teknikker har mange ulemper, blant annet tilbøyeligheten til mange mutasjonshendelser og en forlenget tid for å oppnå de transgene linjer. Noen av disse metodene kan også være kostbart og krever dyktig og effektiv manipulering av instrumentene, noe som resulterer i lave utvinning frøplanter. Viktigst, disse teknikken ofte resultere i lave transformasjon prisene 2,6.
Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dip er en enkel og effektiv metode for å generere transgene planter. Det har blitt rutinemessig og med hell brukt i mange plantearter slik som Arabidopsis Thalianen 1,4, Medicago truncatula 11, tomat 12, hvete 13 og mais 10. Imidlertid har det ikke vært tenkt som en levedyktig teknikk for lin transformasjon på grunn av flere faktorer, som den lave tall for blomster produsert av lin, begrenset antall frø hentet fra hver blomst, den store frø størrelse, og den tykke pelsen, som også kan være problematisk for eksempel genetiske transformasjonsprosessen. I tillegg er utvalget segment av floral-dip teknikken krever spirende forvandlet frø på en plante medier som inneholder et antibiotikum, med transform progenies utmerker basert på deres evne til å spire og bli grønn, mens ikke-transformert progenies enten ikke spire eller spire men blekemiddel ut raskt og dø. I den aktuelle litteratur, er det blitt bemerket at villtype-lin har en tendens til å unnslippe høy konsentrasjon av antibiotika valg, produserer falske positive resultater, og gjør valg av T1 progenies basertpå antibiotikaresistens vanskeligere 6,14. Også når en høy konsentrasjon av antibiotikum ble tilsatt til seleksjonsmedium, frekvensen av den observerte forandring falt dramatisk 9.
I denne protokoll har vi brukt Agrobacterium og blomster-dip metode for å transformere en linje av fiber lin, Stormont Cirrus (responsiv og plast), som har vist seg å svare til spenninger i miljøet ved å endre sitt genom 3,5. For å overvinne den antibiotika flukt problem, har vi valgt å gjøre direkte PCR-testing av DNA fra T1 blader, i stedet for valg ved å legge antibiotika til anlegget media. Vi tok fordel av den enkle anatomi av lin å spore bestemte blomster på tidspunktet for behandlingen. Denne sporingssystem tillatt utvalg av frø fra bestemte blomster og spiring på jord uten å legge antibiotika. Positive transformanter ble rett og slett identifisert ved å teste DNA hentet fra bladene ved hjelp av rask og effektiv metode of direkte PCR. Våre resultater viser at floral-dip metoden fungerte veldig bra i denne linjen av lin og overraskende resulterte i en meget høy transformasjonsraten (50 – 60%), høyere enn de som tidligere er observert for Arabidopsis thaliana, som ble rapportert å være 0,1 til 1 1%, og også høyere enn andre plantearter 10,12. Vi testet også en annen variasjon av linfrø (olje lin), Bethune (stabil og ikke-responsive), og vår foreløpige data indikerer at floral-dip fungerer også for denne varianten av lin.
Målet med denne protokollen er å vise at Agrobacterium og floral-dip kan brukes til å generere transgene lin. Vi viser at denne teknikk er enkel, billig, og raskere enn andre metoder for lin transformasjon. Enda viktigere det resulterer i en mye høyere transformasjon rente enn de andre metodene for lin transformasjon 2,6. Anatomi av Arabidopsis thaliana, som har mange grener og blomster, makes det vanskelig å skille dyppet og ikke-dyppet blomster på samme plante. Derfor et stort antall frø, ca. 20.000 frø per plante, må være skjermet for å identifisere positive transformanter 8. Flax, på den annen side, har færre grener (en hovedgren og noen sidegrener) og færre blomster, produserer ca 100 frø per planter, som gjør det mulig å spore enkelte blomster og for å velge bestemte frø under screening prosessen.
Vi foreslår at floral-dip er en anvendelig metode for å forvandle noen beslektede arter av lin, en slekt av ca 200 arter. Denne metoden gir mye høyere transformasjon rente enn andre metoder for lin transformasjon. Vi foreslår også at den direkte PCR-screening av T1 blad DNA er en effektiv måte til å overvinne problemet med antibiotikaresistens flukt som ofte frembringer mange falske positiver. Direct PCR-screening kan anvendes på andre plantearter, og er ikke begrenset to lin. Den enkle frø sporing teknikk ansatt i denne protokollen kan brukes på alle andre plantearter med forgrening anatomi ligner på lin.
I enkelte plantearter, for eksempel lin (Linum usitatissimum), har vellykket plante transformasjon vært begrenset. Tidligere har transformasjon i lin kreves en agrobakteriuminfeksjon av såret og co-dyrking, søker biolistic partikler eller ved hjelp av ultralyd ultralyd, etterfulgt av regenerering; en prosess som er både lange og utsatt for å bli ledsaget av mange mutasjonshendelser. Videre krever utvelgelsen av disse teknikkene ved bruk av antibiotiske seleksjonsmarkører slik som kanamycin. Det har imidlertid blitt bemerket i litteraturen at denne metoden for utvelgelse produserer mange falske positiver, som lin har en tendens til å unnslippe høye konsentrasjoner av antibiotika 6,9,14. En annen ulempe ved de tidligere teknikker i lin transformasjon vært den lave transformasjons prisene 2,6.
I protokollen som er beskrevet her, ble Agrobacterium formidlet plante transformasjon via floral-dipping visttil å resultere i en høy transformasjonsfrekvens for lin (50 – 60%). Transformanter ble hentet fra blomster dyppet og samlet inn fra hoved- og sidegreiner. Utvalg av positive transformanter ble rett og slett gjort ved å dyrke T1 planter på jord og screening sine blader snart etter at de spirer, og unngår bruk av antibiotika utvalg, et skritt tidligere brukt som en norm i floral-dip for andre plantearter. Ved å utføre direkte PCR-testing av blader, og bruke de riktige T-DNA primere, kan positive transformanter være raskt valgt. Denne teknikk er enkel, billig og lett å utføre, men resulterer i en mye høyere transformasjonsrate enn de som tidligere er rapportert for Arabidopsis og andre plantearter ved hjelp av denne metoden 1,10,12. Det er også den høyeste rapporterte transformasjonsraten for lin.
Imidlertid er det kritiske trinn i fremgangsmåten, inkludert valg av det beste blomsterstadiet, og det beste overflateaktive konsentrasjon, slik atden Agrobacterium kan trenge inn i planteceller uten å drepe de blomster organer. Hvis et tidlig stadium knopp benyttes (figur 2A) med høy Silwet-77-konsentrasjon på mer enn 0,05%, vil blomsten ikke utvikle eller sette frø. Hvis sent knopp scenen brukes (figur 2C), selv om transformasjonen kan fungere, vil det skje på en mye lavere pris. Lignende resultater ble oppnådd med Arabidopsis floral dukkert transformasjon 1,4. For denne protokollen, ble alle flor stadier testet med forskjellige Silwet-77-konsentrasjoner og den beste fasen ble bestemt til å være den midtre knopp stadium (figur 2C) med Silwet-77 0.05% for den første dyppingen, etterfulgt av en andre dyppe i sen knopptrinnet (figur 2C) med en litt redusert Silwet-77 konsentrasjon på 0,03%. Omformingen også fungert bra med tidlig stadium knopp (figur 2A) med et lavt Silwet-77 konsentrasjon på 0,003%, etterfulgt aven andre dyppe med midtknoppstadiet (figur 2B) ved høyere Silwet-77 konsentrasjon på 0,05%.
I denne protokollen ble noen andre parametere forsøkt å optimalisere transformasjonsraten, men funnet å ha noen effekt på det endelige utfallet. Eksempler er å forlenge tiden etter dypping at plantene lå på sin side og dekket av plast fra en dag til to dager; ved hjelp av en OD på mer enn 1 for Agrobacterium kultur, i stedet for 0,5 til 1; å øke dyppetiden til 5 – 15 minutter i stedet for 1 – 2 min. Igjen har vi ikke merket noen effekt på transformasjonsraten ved hjelp av disse strategiene. De mest effektive faktorer, men ble funnet å være ved hjelp av sunne planter i de riktige blomster trinn, og ved å bruke den beste Silwet-77 konsentrasjon. Vi la merke til at to dipping intervaller, fungerer liksom bedre enn én gang, selv om en gang dipping fungerer også.
Modifikasjon til denne protokollen kan oppnås ved reducing av Silwet-77 konsentrasjon til så lite som 0,003% i det andre eller tredje dypping. Siden Silwet-77 er giftig, for høy konsentrasjon resulterer i blomster utvikler dårlig, noe som resulterer i ingen frø utbytte. Dipping frekvensen kan reduseres til en, med den andre eller tredje hendelser eliminert hvis plantene ikke ser sunn og knoppene er ikke god utvikling.
En viktig begrensning ved denne teknikk er den lave antall blomster produsert av lin, det begrensede antall frø oppnådd fra hver blomst, og den lange levetid av lin. Det tar 6 – 8 uker fra frø såing å ha de primære knopper klar for første dipping og en ytterligere 8-10 uker etter dipping å komme til T1 generasjon. Totalt, et utvalg av 5 – er 6 måneder ha for å få T1 generasjon. I motsetning til andre plantearter, som blomstrer når som helst på året, noen lin varianter blomst bedre på bestemte tider av året. Så gjennomtenkt planlegging for denne teknikken er viktig.
<p class = "jove_content"> I sammendraget, våre resultater av floral dukkert med to forskjellige lin varianter: fiber lin, Stormont Cirrus (responsive og plast), og oljen lin, Bethune (stabil og ikke-responsive), viser at Agrobacterium – mediert plante transformasjon via floral-dip er en anvendelig og effektiv metode for lin transformasjon og kan brukes til å erstatte de tidligere brukte teknikker for lin transformasjon. De modifikasjoner av floral-dip metode i denne protokollen vil være aktuelt for bruk med noen andre plantearter og ikke begrenset til lin.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |