Burada, biz çiçek daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki dönüşümü kullanarak keten dönüştürmek için bir protokol mevcut. Bu protokol için basit ve ucuzdur, ancak keten transformasyonu için mevcut veriler yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranını verir.
Çiçeksi-daldırma yoluyla, Agrobacterium aracılı bitki transformasyon bitki transformasyonu alanında yaygın olarak kullanılan bir teknik olan ve çok sayıda bitki türleri için başarılı olduğu rapor edilmiştir. Ancak, çiçek daldırma ile keten (Linum usitatissimum) dönüşümü rapor edilmemiştir. Bu protokolün amacı bu Agrobacterium kurmak ve çiçek daldırma yöntemi transgenik keten oluşturmak için de kullanılabilir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve etkili olan ve daha da önemlisi, keten dönüşüm akımı mevcut yöntemlere göre daha yüksek bir dönüşüm oranı elde edildiğini göstermektedir.
2 dakika – Özetle, keten inflorescences 1, bir ikili vektör plazmid (T-DNA fragmanı ayrıca Linum ekleme dizisi, Lis-1) taşıyan Agrobacterium çözeltisi içinde bekletilir. Bitkiler 24 saat kendi tarafında düz atıldı. Daha sonra, bitkiler bir sonraki işlem yapana dek, normal gelişim koşulları altında muhafaza edilmiştir. süreçdaldırma ile, 14 günlük aralıklarla – yaklaşık 10 ile 3 kez, – daldırma s 2 tekrarlandı. T1 tohumları toplanır ve toprağa çimlendirilmiştir. Yaklaşık iki hafta sonra, muamele edilen nesiller, doğrudan PCR ile test edilmiştir; 2-3 yaprak bitki artı uygun T-DNA primerleri başına kullanılmıştır. Pozitif transformantlar seçilir ve olgunlaşana kadar büyütülmüştür. pozitif dönüştürücüleri olarak muameleden geçirilmiş olan bitkilerin tohumlarının% 60 – dönüşüm hızı 50 ile, beklenmedik bir şekilde yüksek olmuştur. Bu Arabidopsis thaliana ve çiçek daldırma dönüşüm kullanarak diğer bitki türleri için bildirilenlerden daha yüksek bir dönüşüm oranıdır. Bu transformasyon için başka yöntemler kullanarak keten transformasyonu için, aynı zamanda bugüne kadar rapor edilmiş olan, en yüksek düzeydedir.
Keten (Linum usitatissimum) kendi lifleri ve yağlar için yaygın olarak yetiştirilen önemli bir üründür. Keten genomunun dönüşüm örneğin yaralanma, Agrobacterium enfeksiyonuna ve doku kültürü içinde ko-kültivasyonu, rejenerasyonunun ardından biyolistik tanecikleri veya ultrason sonikasyon uygulama gibi tekniklerle mümkündür. Ancak, bu teknikler çok mutasyon olayları eğilimi ve transjenik çizgiler elde etmek üzere uzun bir süre de dahil olmak üzere pek çok dezavantajları vardır. Bu yöntemlerin bazıları, aynı zamanda pahalı olabilir ve düşük kurtarma fide sonuçlanan araçların yetenekli ve etkili manipülasyon gerektirebilir. En önemlisi, bu teknik genellikle düşük dönüşüm oranları 2,6 sonuçlanır.
Çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon transgenik bitkiler oluşturmak için basit ve etkili bir yaklaşımdır. Bu rutin olarak ve başarılı Arabidopsis thaliana gibi birçok bitki türleri için kullanılmaktadırbir 1,4-ta, medicago truncatula 11, domates 12, buğday 13 ve mısır 10. Ancak, bu tür nedeniyle keten tarafından üretilen çiçekler düşük sayılar gibi çeşitli faktörlere, keten dönüşümü için uygun bir teknik olarak düşünülmüş değil, her çiçek, tohum boyutu büyük ve kalın ceket elde edilen tohumların sınırlı sayıda, aynı zamanda genetik transformasyon süreci için sorunlu olabilir hangi. Yavrularıyla olmayan transforme ya çimlenme veya çimlenme ama çamaşır suyu yok iken Ayrıca, çiçek daldırma tekniği seçimi segmenti, filizlenmeye ve yeşil kalmak için kendi yeteneklerine göre ayırt dönüştürülmüş progeny'lerinde bir antibiyotik içeren bir bitki medyada dönüştürülmüş tohumların çimlenme gerektirir dışarı hızlı ve ölür. Mevcut literatürde, vahşi tip keten esaslı yalancı pozitif sonuçlar üreten, ve T1 progeny'lerinin seçim yapmak, antibiyotik seçimleri yüksek konsantrasyon kaçmak eğiliminde olduğu görülmüştürAntibiyotik direnci 6,14 daha zor. Antibiyotiğin yüksek konsantrasyon seçim ortamına ilave edildi, ayrıca, gözlenen dönüşüm oranı önemli ölçüde 9 düştü.
Bu protokol, biz onun genomu 3,5 değiştirerek ortamda streslere cevap gösterilmiştir elyaf keten, Stormont cirrus (duyarlı ve plastik), bir çizgi dönüştürmek için Agrobakteriyi ve çiçek daldırma yöntemi kullanılmıştır. Antibiyotik kaçış sorunu aşmak için, biz bitki medyaya antibiyotik ekleyerek yerine seçim, T1 yapraklarından DNA'nın doğrudan PCR testi yapmak için seçtiniz. Biz tedavi sırasında belirli çiçekler izlemek için keten basit anatomi yararlandı. Bu izleme sistemi antibiyotik eklemeden toprağa belirli çiçekler ve çimlenme gelen tohum seçimi izin. Pozitif transformantlar sadece DNA hızlı ve etkili bir yöntem kullanılarak o yapraklarından elde edilen testlerin yapılmasını tespit edildif direkt PCR. Bizim sonuçlarımız çiçek daldırma yöntemi keten bu hat çok iyi çalıştı ve şaşırtıcı bir çok yüksek dönüşüm oranı sonuçlandı göstermek – daha önce olduğu bildirildi Arabidopsis thaliana, gözlemlenen daha yüksek, (50% 60) 0,1-1 % 1 ve diğer bitki türlerinin 10,12 daha da yüksektir. Biz de keten tohumu (keten yağı) başka çeşitli Bethune test (stabil ve duyarlı olmayan), ve bizim ön veriler çiçek daldırma da keten bu çeşitli çalıştığını gösterir.
Bu protokolün amacı, Agrobacterium ve çiçek daldırma transgenik keten oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektir. Bu teknik, basit, pahalı olmayan ve keten dönüşümün diğer yöntemlere göre daha hızlı olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, keten dönüşüm 2,6 diğer yöntemlere göre çok daha yüksek bir dönüşüm oranı ile sonuçlanır. Birçok şubesi ve çiçekleri vardır Arabidopsis thaliana'nın anatomisi, makes zor daldırma ve aynı bitki üzerinde çiçek olmayan daldırma ayırt etmek üzere. Bu nedenle, tohumların çok sayıda, bitki başına yaklaşık 20,000 tohum, pozitif dönüştürücüleri 8 tanımlamak amacıyla taranması gerekir. Keten, diğer taraftan, mümkün bireysel çiçekler izlemek ve süreci tarama sırasında belirli tohum seçmek için yapar bitkilerin başına yaklaşık 100 tohum üreten az sayıda şube (bir ana dal ve yan dal birkaç) ve daha az çiçek vardır.
Biz çiçek daldırma keten ilgili herhangi bir tür, yaklaşık 200 türün bir cins dönüştürmek için uygulanabilir bir yöntem olduğunu öneriyorum. Bu yöntem keten dönüşümün diğer yöntemlere göre çok daha yüksek dönüşüm oranı verir. Biz de T1 yaprak DNA'nın doğrudan PCR taraması genellikle birçok yanlış pozitif üretir antibiyotik direnç kaçış sorunu aşmak için etkili bir yol olduğunu öneriyorlar. Doğrudan PCR taraması herhangi bir başka bitki türlerine uygulanabilir ve t sınırlı değildirketen o. Bu protokolde kullanılan basit bir tohum izleme yöntemi keten benzer anatomik dallanma ile herhangi bir diğer bitki türlerine uygulanabilir.
Böyle keten (Linum usitatissimum) gibi bazı bitki türlerinin,, başarılı bitki transformasyon sınırlı olmuştur. Daha önce, keten dönüşüm yaralama ve ortak ekimi, biyolistik parçacıkları uygulayarak ya da rejenerasyon ardından ultrason sonikasyon kullanarak bir Agrobacterium enfeksiyonu gerektiriyordu; Uzun ve eğilimli hem bir süreci birçok mutasyon olayları eşlik ediliyor. Ayrıca, bu teknikler arasında seçim süreci kanamisin gibi antibiyotik seçilebilir markerlerin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, keten antibiyotik 6,9,14 yüksek konsantrasyonlarda kaçış eğilimi seçimi bu yöntem, bir çok yanlış pozitif üreten literatürde not edilmiştir. Keten dönüşüm önceki tekniklerin bir diğer dezavantajı düşük dönüşüm oranları 2,6 olmuştur.
Burada anlatılan protokolde, çiçek-daldırma yoluyla Agrobacterium aracılı bitki transformasyon gösterildi(-% 60 50), keten için yüksek dönüşüm oranı yeterli olmaktadır. Transformantlar, ana ve yan dallarından daldırma ve toplanan çiçeklerden elde edilmiştir. Pozitif transformantların seçimi sadece by-pass antibiyotik seçimi kullanımı, toprak T1 büyüyen bitkiler ve çimlenmiş kısa bir süre sonra yapraklarını tarama tarafından yapıldı, bir adım önce diğer bitki türleri için çiçek daldırma bir norm olarak kullanmıştır. Yaprakların doğrudan PCR testi yapılarak ve uygun T-DNA primerleri kullanılarak, pozitif transformantlar hızlı bir şekilde seçilebilir. Bu teknik, bu yöntem 1,10,12 kullanılarak daha önce Arabidopsis ve diğer bitki türleri için rapor edilen çok daha yüksek bir dönüşüm oranı basit, ucuz ve kolay uygulanabilir olması, ancak sonuçlar. Ayrıca keten en yüksek bildirilen dönüşüm oranıdır.
Ancak, en iyi çiçek aşamasının seçimi ve iyi yüzey aktif madde konsantrasyonu gibi işlemlerde önemli adımlar, böylece oradaAgrobacterium çiçek organları öldürmeden bitki hücrelerine nüfuz edebilir. Erken sürgün aşamasında fazla% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonu ile (Şekil 2A) kullanılırsa, çiçek geliştirme veya tohum vermeyecek. Dönüşüm çalışabilir, ancak son tomurcuk aşamasında (Şekil 2C) kullanılırsa, bu, çok daha düşük bir oranda gerçekleşir. Benzer sonuçlar Arabidopsis çiçek daldırma dönüşüm 1,4 ile elde edilmiştir. Bu protokol, tüm çiçek aşamaları ikinci daldırma ile, ardından farklı Silwet-77 konsantrasyonları ile test edilmiştir ve iyi aşama birinci daldırma için% 0.05 Silwet-77 orta tomurcuk aşama (Şekil 2C) olduğu belirlendi 0.03% biraz daha azalmış Silwet-77 konsantrasyonu ile geç tomurcuk sahne (Şekil 2C). Bu dönüşüm ayrıca, ardından% 0.003 düşük Silwet-77 konsantrasyonu ile erken tomurcuk aşama (Şekil 2A) ile çalıştı% 0.05 yüksek Silwet-77 konsantrasyonunda orta tomurcuk aşamasında (Şekil 2B) olan bir ikinci daldırma.
Bu protokolde, diğer bazı parametreler dönüşüm oranını optimize çalıştı, ancak nihai sonuç üzerinde hiçbir etkisi olduğu bulunmuştur. Örnekler bitkiler tarafında yatıyordu ve bir gün iki gün plastik kaplı olduğunu daldırma süre sonra uzanan içerir; Agrobacterium kültürü için birden fazla 1 OD kullanılarak yerine 0,5-1; 15 dakika yerine 1 – – 2 dakika 5 daldırma süresini arttırmak. Yine bu stratejileri kullanarak dönüşüm oranı üzerinde herhangi bir etkisi fark değil. En etkili faktör, bununla birlikte, doğru çiçek aşamalarında sağlıklı bitkiler kullanılarak, ve en iyi Silwet-77 konsantrasyonu kullanılarak bulunmuştur. Biz iki daldırma aralıkları, bir kez daldırma da çalışır halde, nedense daha iyi bir zaman çalıştığını fark ettim.
Bu protokole modifikasyonu reducin ile elde edilebilirg ikinci veya üçüncü daldırma olarak az 0.003 olarak% kadar Silwet-77 konsantrasyonu. Silwet-77 toksik olduğu için, çiçek çok yüksek bir konsantrasyon sonucu herhangi bir tohum verimi ile sonuçlanır kötü geliştirilmesi. bitkiler, sağlıklı görünümlü değil ve tomurcukları iyi gelişmekte değilse, ikinci veya üçüncü olaylar ortadan ile daldırma frekansı, birine azaltılabilir.
Bu tekniğin önemli bir sınırlama, keten, her bir çiçekten elde edilen tohum sınırlı sayıda ve keten uzun yaşam döngüsü tarafından üretilen çiçek düşük sayıdır. T1 nesil almak için 10 hafta sonrası daldırma – ilk daldırma için hazır birincil tomurcukları ve ek 8 için tohum ekimi 8 hafta 6 – alır. Toplamda, 5 bir dizi – 6 ay T1 nesil elde etmek gereklidir. Diğer bitki türlerinin aksine hangi çiçek yılın her zaman, yıllık belirli zamanlarda bazı keten çeşitleri çiçek daha iyi. Bu teknik için çok düşünceli planlama önemlidir.
<p clÖzetle eşek = "jove_content">, iki farklı keten çeşitleri ile çiçek dip bizim sonuçlarımız: keten, Stormont Cirrus (duyarlı ve plastik), ve yağ keten, (stabil olmayan duyarlı) Bethune, bu Agrobakteriyi gösteriyor – çiçek daldırma ile uyumlu bitki transformasyon keten transformasyonu için uygulanabilir ve etkili bir yöntem olup, keten transformasyonu için daha önce kullanılan tekniklerle yerine kullanılabilir. Bu protokolde çiçeksi-daldırma yöntemi tadilatları, diğer bitki türlerinden ile kullanım için uygulanan ve keten ile sınırlı olmayacaktır.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Ogelbay fund.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
5" pots | |||
potting soil | |||
greenhouse with appropriate light setting | |||
Thermocycler | |||
Agarose gel electropheresis equipment | |||
digital imaging setup | |||
Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
GoTaq Green Master Mix | promega | Part# 9PIM712 | |
Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
TOPO TA cloning kit | invitrogen | K4595-01 | |
sucrose | fischer scientific | ||
electroporator and cuvettes | bio-Rad | 165-2092 | |
Shaker | |||
spinner | |||
platic wrap and aluminum foil wrap | |||
speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
Murashige Skoog | sigma | M5524 | |
Agar | fisher scintific | A360-500 |