Summary
FIM ist ein neuartiger, kostengünstiger Imaging-System entwickelt, um kleine, bewegliche Objekte, wie C. verfolgen elegans, Planarien oder Drosophila-Larven. Die begleitende FIMTrack Programm wurde entwickelt, um eine schnelle und effiziente Datenanalyse zu liefern. Zusammen bieten diese Tools ermöglichen Hochdurchsatz-Analyse von Verhaltensmerkmalen.
Abstract
Die Analyse der neuronalen Netzwerkfunktion erfordert eine zuverlässige Messung der Verhaltensmerkmale. Da das Verhalten von frei umherlaufenden Tieren variabel ist, um einem gewissen Grad haben viele Tiere analysiert, um statistisch signifikante Daten zu erhalten. Dies wiederum erfordert eine computergestützte automatische Quantifizierung von Bewegungsmustern. Um Bilder mit hohem Kontrast von fast durchsichtig und kleine bewegte Objekte zu erhalten, wurde ein neuartiges bildgebendes Verfahren auf Basis von frustrierten Totalreflexion genannt FIM entwickelt. In dieser Konfiguration werden die Tiere nur mit Infrarotlicht an der sehr spezifischen Lage der Kontakt mit der darunter kriechen Fläche beleuchtet. Diese Methode führt zu einem sehr kontrastreiche Bilder. Anschließend werden diese Bilder mit hohem Kontrast mit etablierten Konturverfolgungsalgorithmen verarbeitet. Die FIMTrack Software, die eine Anzahl von Merkmalen benötigt extrahieren quantitativ zu beschreiben eine große Vielzahl von Bewegungs dient auf dieser Basis haben wirEigenschaften. Bei der Entwicklung dieser Software-Paket, konzentrieren wir unsere Bemühungen auf einem Open Source-Architektur ermöglicht die einfache Zugabe von weiteren Modulen. Das Programm arbeitet plattformunabhängig und wird durch eine intuitive Benutzeroberfläche, die den Benutzer über die Datenanalyse begleitet. Alle Bewegungsparameterwerte werden in Form von csv-Dateien die eine weitere Datenanalysen gegeben. Darüber hinaus bietet ein Ergebnisviewer in die Tracking-Software integriert die Möglichkeit, interaktiv überprüfen und stellen Sie den Ausgangs, wie man während der Stimulus-Integration erforderlich sein. Die Macht der FIM und FIMTrack wird durch das Studium der Fortbewegung von Drosophila-Larven zeigte.
Introduction
Die meisten Tiere besitzen die Fähigkeit, in einem hochentwickelten und kontrollierte Weise zu bewegen. Um die genetischen Grundlagen zugrunde liegenden Bewegungssteuerung zu entschlüsseln ist es zwingend notwendig die quantitative Erfassung unterschiedlicher Verhaltensmuster. In dieser Hinsicht kann Drosophila als ideales Vorbild dienen. Tracking der frei fliegenden Drosophila tantalizing 1-4 aber kriecht von Drosophila-Larven erfolgt in zwei Dimensionen bei relativ niedriger Geschwindigkeit und kann somit leicht kontrolliert werden. Kamerabasierte Setups in Kombination mit geeigneten Beleuchtung verwendet werden, um Bilder zu 5 zu erwerben. Sowohl Auf- oder Durchlicht wird in Verhaltensexperimenten 6,7 eingesetzt. Allerdings kann aufgrund der semi-transluzente Körper der Larven und mögliche Lichtreflexionen des kriechenden Oberfläche treue Aufzeichnung von Larven Bewegungen schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, haben einige komplexe Methoden entwickelt worden. Vor kurzem wurde der Dunkelfeldbeleuchtung eingeführt, um die Vorder- / Hintergrund cont verbessernrast 8. Als Alternative zum kamerabasierten Aufzeichnungslinsen weniger optischen Bildgebung und bildsensorlosen chipAkquisitionsTechniken eingeführt worden 9-11.
Mehrere Tracking-Programme haben vor kurzem eingeführt, darunter handelsübliche Software 12 und kundenspezifische Lösungen. Beispiele für die Hochdurchsatz-Tracking-Programme sind die Multi Worm Tracker (MWT) 13 und Multianimal Gang und Track (Magát) 8. Beide haben gemeinsam, dass mehrere Tiere in einem einzigen Freiflächen-Arena verfolgt werden, so dass kollidierende Tieren führen, mehrere neue Tier Identitäten. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurde eine Multi-Well-Aufbau eingeführt Trenn 12 Tiere in einzelne Vertiefungen 14. Präzise Quantifizierung der Fortbewegung von einzelnen Personen können durch die Verwendung eines beweglichen Verfolgungsstufe in Kombination mit einem Mikroskop 15 erreicht werden. Jedoch sind alle diese Ansätze entweder Kosten ineffizient, keine ausreichende WiederLösung oder zu zeitaufwendig für die Hochdurchsatz-Phänotypisierung.
Um die oben genannten Beschränkungen zu überwinden, die wir entwickelt haben FIM (FTIR-basierten Imaging-Verfahren), basierend auf frustrierte Totalreflexion (FTIR) 16 (Abbildung 1). Diese neuen bildgebenden Ansatz bietet einen beispiellosen hohen Kontrast und erlaubt sogar Mehrfarbaufzeichnung der kriechenden Tiere 16. Das zugrunde liegende Prinzip dieses handliche und effektive Methode ist einfach. Eine Acrylglasplatte ist lichtdurchflutet (zB 875 nm Infrarot). Wegen der unterschiedlichen Brechungsindices von Acrylglas und Luft, wird das Licht vollständig an der Glas / Luft-Grenze reflektiert wird. Keine Erwärmung der Acrylglas wird bemerkt 16. Nur dann, wenn Objekte mit einem höheren Brechungsindex berühren Sie die lichtdurchfluteten Tabelle können leuchten geben diese Objekte. Wenn die Tiere die Oberfläche berühren, wird das Licht reflektiert und von unten (Figur 1) erfasst werden. Folglich wird nur der KontaktBereich der Tiere erscheint als heller Fleck, der detaillierte Bildgebung mit einer Gesamt schwarzem Hintergrund ermöglicht. So erlaubt FIM-Bildgebung, um perfekte filme für Computer Vision Algorithmen erfassen. Die einfache und robuste Anwendung von FIM bringt nun detaillierte Hochdurchsatzanalyse von komplexen Verhalten der Tiere in Reichweite und kann für das Studium der Informationsverarbeitung eingesetzt werden: zB Geruchssinn 8, 16; Vision 17 oder thermosensation 18.
Abbildung 1. FIM-Setup mit Hitzereiz Integration und die zugrunde liegenden physikalischen Prinzipien. (A) Die FIM-Setup. Beleuchtungsstärke können am vorderen Bedienfeld geregelt werden. (B) Um einen Hitzereiz liefern, malte eine schwarze Aluminium-Platte, mit heißem und kaltem Wasser durchströmt auf beiden Seiten wird 2 mm über der Agar-Oberfläche platziert dieselbst ist 2 mm dick. Die Steigung ist auf dem Wärmestrahler Platte und der Agar durch die Temperaturunterschiede festgestellt (C) Das physikalische Prinzip der gestörten Totalreflexion:. Eine Acrylglasplatte wird mit Infrarotlicht beleuchtet. θ 1, θ 2 und θ 3 die Lichtreflexionswinkel. n A, n 1, n 2 und n 3 bezeichnen die Brechungsindizes von Luft, Acrylglas, Agar und Larven jeweils und erfüllen die Ungleichung n A <n 1 <n 2 <n 3. Aufgrund der Brechung ändert beim Übergang der Reflexionswinkel. Wenn der Winkel unterhalb des kritischen Winkels ist, wird das Licht nicht mehr reflektiert, können durch die Schichten hindurchtreten und von unten erfasst werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Die spectrum von Prozessen, die von der FIM analysiert werden können, ist breit. Ohne weitere Einstellungen können FIM Bildgebung verwendet werden, um alle Larvenstadien von Drosophila (5B) zu überwachen oder kann verwendet werden, um die Fußspuren der Erwachsenen folgen Drosophila 19. Ebenso sind die Trajektorien C. elegans oder die Bewegung der Planarie Plattwürmer leicht aufgenommen werden (5C). Auch die Analyse der Pilzhyphen oder Wurzelhaarwachstum möglich erscheint 19. In unserem aktuellen FIM Setup werden 4 x 16 Infrarot-Leuchtdioden (IR-LEDs) in eine 32 x 32 cm 2 Acrylglasplatte integriert, die so genannte Tracking-Tabelle (Abbildung 1). Die Intensität der IR-LEDs wird abhängig von dem Gewicht der Gegenstände auf dem Verfolgungstabelle, die leicht von einem Mikroregler mit der Schaltung über eine Pulsweitenmodulation (PWM) verbunden erfolgen kann eingestellt. FIM ergibt sehr kontrastreiche Bilder über einen weiten Bereich von Beleuchtungsstärken. Wichtiger ist, es genriert hervorragende Ergebnisse bei insgesamt bereits niedrigen Infrarot irridation.
Eine Kamera mit einem Infrarot-Filter ist unterhalb der Verfolgungstabelle, die die Integration von zusätzlichen Impulse in das Setup ermöglicht platziert. Wärmereize kann durch einen Wärmestrahlerplatte aufgebracht werden und Lichtreize werden durch ein LCD-Projektor verwendet. Auch Duftstoffe können in Gradienten mit einfachen Deckeln 8 enthalten sein. Für Wärmegradienten Experimenten wurde die Wärmestrahlerplatte wird mit warmem und kaltem Wasser auf beiden Seiten jeweils perfundiert und platziert 2 mm oberhalb der Larven (1B).
Die Erzeugung von hochauflösenden, qualitativ hochwertige Filme eröffnet die Möglichkeit für anspruchsvolle computergestützte Bildanalyse, damit wir die FIMTrack Software implementiert, um eine große Palette an Funktionen aus Bildern zu extrahieren (Abbildung 2). Ersten sechs Primärmerkmale wurden aus der Kontur des Tieres (3A) definiert ist. Diese Funktionen bieten die Grundliniezur weiteren Berechnung der sechs Sekundärmerkmale, die die Tiere Form und seine Position auf bestimmte Reize zu einem gegebenen Zeitpunkt (Figur 3B), beschreiben. Derzeit sind neun tertiären Merkmale berechnet, die Integration sind zeitliche Aspekte und so prägen die Fortbewegung der Tiere zusammen mit den primären und sekundären Funktionen (3C).
Abbildung 2. FIMTrack Übersicht, algorithmische Workflow und Larven Darstellung. (A) Wie FIMTrack verwenden. Die Bilder werden geladen. Grauwertschwelle und Larvengrößenschwellen zu definieren einzelne Larven müssen eingestellt werden. Die Larvenbereich muss in [min-Größe, max-size] sein. Tracking wird durch die hervorgehobene Schaltfläche (B) Tracking-Workflow gestartet.. Nachdem der Start-Taste angeklickt wird, wird das Hintergrundbild calculated (minimale Intensität über die Zeit). Solange gibt es Rahmen links werden die Larven auf der Grundlage der Grauschwelle und die Min- und Max-Größenschwelle segmentiert. Für alle Segmentierungen die Larvendarstellungen berechnet werden (im Vergleich zu (C)). Jedes neue Modell ist mit einer gegebenen Flugbahn verbunden, wenn eine gültige Strecke verfügbar ist. Wenn das letzte Bild erreicht ist, wird in Kürze Nachbearbeitung fertig durch die Ausgabe Generation gefolgt. (C) Larven Darstellung. Das Tier aus einem Kopf und einem Schwanz Punkt (h und t). Zwischen diesen Punkten eine beliebige ungerade Anzahl an Rückgrat Punkte s kann ich mit einem Radius r i eingestellt werden. Darüber hinaus ist die Mitte der Masse m und der Hauptkörper Biegewinkel γ berechnet. Mehrere Bewegung relevante Parameter sind durch violette Linien skizziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. Merkmale von FIMTrack berechnet. (A) Die wichtigsten Merkmale auf der Grundlage der Kontur der Tiere. (B) Sekundäre Funktionen, basierend auf dem primären Funktionen. (C) Tertiäre Funktionen, basierend auf dem primären Funktionen in aufeinanderfolgenden Rahmen und zusätzliche Eingänge Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur.
Protocol
Anmerkung: Hier wird die Verwendung von FIM für handliche Hochdurchsatzanalyse von Larven Lokomotion zum Screening in freibeweglichen Bedingungen und unter dem Einfluß eines Wärmereiz dargestellt. Andere Anwendungen wie Analyse der Geruchsreize angewiesen Fortbewegung oder hochauflösende Bildgebung von Walzen oder ein anderes Verhalten könnte subtile Änderungen des Protokolls, die auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden müssen.
1. Set-up of Experiments
- Verwenden Sie etwa 100 Larven pro Genotyp insgesamt (1 Std erforderliche Zeit), um statistisch aussagekräftige Werte zu erhalten. HINWEIS: Bei verglichen und an verschiedenen Tagen aufgezeichnet werden müssen mehrere Genotypen, erfassen die gleiche Anzahl von Larven pro Genotyp pro Tag.
- Für die meisten Anwendungen Rekord bei 10 Hz für Parameteranalyse. Für hochauflösende bildgebende Anwendungen, variieren Bildgebungsgeschwindigkeit, wenn nötig.
- Zur Verfolgung des dritten Larvenstadium, experimentieren etwa 120 Stunden nach der Eiablage. Stellen sure, die Kulturen zu erhalten genug Larven im Versuchszeitraum (siehe 4.3).
- Für nicht-Stimulus-Anwendungen, bereiten Sie einen kriechenden Oberfläche, durchscheinend-Agar (siehe Abschnitt 2). Um Larven im Konjunkturbereich für Wärmegefälle Anwendung enthalten, umgeben das Sichtfeld mit einem aversiven Salz-Agar-Schranke (siehe Abschnitt 3).
HINWEIS: Andere Anwendungen können unterschiedliche Oberflächen erfordern. - Achten Sie darauf, ein Zimmer mit konstanten Umgebungsbedingungen (Temperatur, Licht, Luftströmung, Luftfeuchte etc.) zu verwenden.
2. Crawling Oberflächenvorbereitung (transluzent Agar)
HINWEIS: In der FIM ein Setup Agaroberfläche wird zugegeben, um eine feuchte Crawling Oberfläche bereitzustellen. Zusätzlich verbessert auch Beleuchtungseigenschaften.
- Kochen Sie 0,8% Lebensmittelqualität Agar in deionisiertem Reinstwasser. Für Screening-Anwendung vorbereiten 400 ml.
- Gießen Agar bei 50 ° C (handwarm) auf einem separaten 33 cm x 33 cm acrylic-Glasplatte. Die Oberflächenspannung des Agars und damit die Temperatur wird die Dicke der Agar Platte definieren. Bei 50 ° C, sind 2 mm dicke Platten-Agar erhalten. Nach dem Kochen rühren Sie nicht und gießen ständig um Blasen zu vermeiden. Bereiten Sie frischen Agar-Platten für alle bildgebenden Zeitraum von etwa 4 Stunden.
- Füllen Standard 6 cm Petrischalen mit den restlichen 0,8% Agar-Lösung zu sortieren, reinigen und zu gewöhnen Larven vor dem Experiment (1 Teller pro Genotyp).
- Für den Fall, wird für die Anwendung der aversiven Agar Barriere erforderlich, Abschnitt 3 fortfahren.
- Schneiden Sie ungefähr 2 cm von dem Umfang der Agar-Platte, um eine ebene quadratische Fläche zur Aufzeichnung zu erhalten. Entfernen Sie das überschüssige Agar.
HINWEIS: Die Größe ist abhängig von der Applikation. - Übertragen Sie die Agar-Platte mit dem FIM-Setup direkt nach dem Abkühlen durch leichtes Drücken des Fliegen Agar über den Rand der Acrylglasplatte.
3. Optional: Hinzufügen eines Aversive Agar Barrier auf die Crawling Oberfläche (Kochsalz-Agar)
- Kochen Sie 2,5% Lebensmittelqualität Agar mit 3 M NaCl in entionisiertem ultrareinem Wasser. Für das Screening in einem Wärmegefälle vorbereiten 200 ml.
Hinweis: Die Lautstärke hängt von der Anwendung. - Schneiden eine 2 cm breite Kerbe in der zuvor gegossen kriechen umgebenden Fläche das Sichtfeld (22 x 22 cm).
HINWEIS: Je nach Anwendung können verschiedene Barriere Formen und Sichtfelder erforderlich. - Füllen Sie die Kerbe mit Salz-Agar 0,1 bis 0,3 cm über dem Tracking Oberfläche.
4. Fly Handhabung
- Rück fliegt in 25 ° C-Inkubator mit 12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus, um Zeit des Experiments auf Standard-fly Nahrung bei 65% Luftfeuchtigkeit eingestellt.
- Für Kreuze, betäuben 30 jungfräulichen weiblichen Fliegen und 8 Männern mit CO 2 und überqueren sie in 130 ml Kulturfläschchen mit 35 ml Essen.
HINWEIS: Eine 130 ml Kultur Fläschchen mit 35 ml Essen wird etwa 20-30 l ergebenaß dritten Larvenstadium innerhalb des Bildgebungs Spannweite von 4 Std. Imaging and Tracking Werke für alle Larvenstadium Stadien. - Lassen Sie ein wenig Wasser im Kulturfläschchen bis zum späten dritten Larvenstadium Larven Bewegung fahren und sammeln die größte Larven aus Fläschchen Wände mit einem kleinen Pinsel.
- 2-5 min vor der Aufnahme, Übertragung Larven für ein Video in einer Petrischale, die 0,8% Lebensmittelqualität Agar in deionisiertem Reinstwasser zu gewöhnen und reinigen.
5. Einstellen der FIM Imaging-Setup für Recordings (Non Stimulus-Bedingungen)
- Passen Sie Kameraobjektiv Fokus- und Blenden, wenn nötig. Stellen Sie die Belichtungszeit für die jeweilige Kamera.
HINWEIS: Diese Einstellungen müssen nicht während eines Experiments geändert werden. - Passen Beleuchtungsstärke um einen guten Kontrast durch Abbilden einer Larve zu erhalten.
- Halten Sie die Umgebungsbedingungen im Raum konstant während der Aufnahmen. Verdunkeln Sie den Raum nicht zu stören Larven mit gerichtetem Licht.
6. Optional: Einstellung der FIM Imaging-Setup für Recordings (stufenweise Temperatur Stimulus-Bedingungen)
HINWEIS: Der Wärmegefälle Gerät ist ein 42 x 42 x 0,2 cm 3 Aluminiumplatte mit einem matten schwarzen Anstrich und isolierendem Material auf der oberen Seite. Die Platte wird mit Wasser aus zwei verschiedenen Schaltungen zu Heizschlangen / Kühler und Pumpen an beiden Enden verbunden perfundiert (siehe Abbildung 1B). Die Temperaturen können von -5 bis +50 ° C geregelt werden.
- Schalten Sie die Wärmegefälle Gerät 1 Stunde vor den Experimenten und legen Sie es über das Setup, damit die Gründung der gewünschte Temperaturprofil und Komponenten ins Gleichgewicht.
- Übertragen Sie die Crawling Oberfläche Agar mit einem Salz Hindernis für die Einrichtung.
- Legen Sie die Kühlplatte über dem Agar und stellen Sie den Abstand zwischen der Platte und der kriechenden Oberfläche bis 2 mm (~ 1 mm über Larven).
- Einrichtung eines linearen Gradienten vonmindestens 0,8 ° C / cm über 34 ° C (ca. 2 cm von der Barriere in dem Blickfeld) bis 18 ° C (ca. 2 cm von der Barriere an der gegenüberliegenden Seite auf dem Sichtfeld) durch Einstellen der Temperatur der Wasserkreisläufe zu 1 ° C und 45 ° C.
HINWEIS: Unterschiedliche Gradienten Eigenschaften der Metallplatte erfordern unterschiedliche Temperaturen, die empirisch ermittelt werden müssen. Diese Einstellungen müssen nicht während der Experimente geändert werden. - Passen Sie die Einstellungen wie in Kapitel 5 beschrieben.
- Lassen Sie die Oberfläche kriechen, um in der Steigung für 20 Minuten ins Gleichgewicht kommen, bevor Experimente. Testen Sie das Temperaturgefälle mit einem Pyrometer.
- Fahren Sie mit Punkt 8.
7. FIM Imaging (Non Stimulus-Bedingungen)
- Verwenden Sie einen kleinen nassen Pinsel, um vorsichtig zu sammeln 15 Larven aus den Gewöhnungspetrischalen und sie auf die Mitte des Tracking-Oberfläche. Übertragen Sie keine Speisereste oder zu vielWasser (siehe 7.8).
- Nehmen Sie 1 bis 50 Larven auf einem 22 cm x 22 cm Tracking-Bereich. Verwenden Sie 15 Tiere pro Video für die meisten Screening-Anwendungen (zu statistischen Zwecken zu verwenden mindestens 100 Individuen pro Genotyp).
- Trennen Sie vorsichtig Larven und warten Sie etwa 10 bis 20 Sekunden, bis alle Larven begannen gerade zu bewegen, bevor die Aufnahme.
- Nehmen Larven Lokomotion für 2 min bei 10 Bildern pro Sekunde für die Nichtreizbedingungen. Verwenden unkomprimierten TIF-Bilder als Ausgabeformat.
- Während der Aufnahme sammeln Larven für die nächste Video von Fläschchen, um sie zu gewöhnen Kritisch:. Aufgezeichnet Larven mit Licht nicht stören.
- Nach der Aufnahme zu entfernen Larven mit einem großen Pinsel und werfen Sie sie in Übereinstimmung mit den Sicherheitsregeln und Vorschriften.
- Nach dem Entfernen Larven, verwenden Sie den Pinsel zu reinigen und zu befeuchten die Crawling Oberfläche mit ultrareinem deionisiertem Wasser.
- Kritisch: Halten Sie die Oberfläche feucht zu allen Zeiten, aber vermeiden Sie moisture, die als Halos oder Tropfen umgebenden Larven in Aufnahmen und stören Tracking gesehen werden kann.
8. Optional: FIM Imaging (Allmähliche Temperatur Stimulus-Bedingungen)
- Nach der Temperaturgradient aufgebaut (siehe Abschnitt 6), bereiten Sie die Aufnahme-Software für den sofortigen Aufnahme innerhalb von 20 Sekunden nach dem Platzieren des Larven auf der Krabbeloberfläche (siehe 8.2) zum Beispiel, setzen Sie die Anzahl der Bilder pro Video und definieren Sie den Speicherpfad.
- Heben Sie die Kühlplatte leicht und legen Sie die Larven bei 33 ° C 2 cm von der Salzbarriere. Siehe 6. und 7. für weitere allgemeine Hinweise. Senken Sie die Kühlplatte erneut und starten Sie die Aufnahme für 3-4 min direkt nach Larven begannen gerade zu bewegen.
- Nach der Aufnahme zu entfernen Larven direkt, sauberen und befeuchten die Oberfläche. Das Salz-Agar nicht berühren, um zu vermeiden, Verbreitung von NaCl.
- Kritisch: Halten Sie die Oberfläche feucht zu allen Zeiten aber vermeidenFeuchtigkeit, die als Halos oder Tropfen umgebenden Larven in Aufnahmen und stören Tracking gesehen werden kann.
- Lassen Sie die Agar-Oberfläche nach der Befeuchtung für 1-2 min wieder ins Gleichgewicht, beim Speichern von Bildern und vor der Vorbereitung für die nächste Video-Sammlung neue Tiere. Steuern Sie die Temperaturgradienten mit Pyrometer alle 5 Videos und stellen Sie Temperatur-Gerät bei Bedarf (Wassertemperatur, Höhe und xy Ausrichtung in Bezug auf den Tracking-Oberfläche).
9. Verfolgung von Larven Locomotion
HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der beigefügten Anleitung FIMTrack (Ergänzung). Für einen Programmablaufplan siehe Abbildung 2.
- Stellen Sie Tracking-Parameter für die jeweiligen Experimente unter Verwendung der Vorschauoption.
- Passen Sie die Pixel pro cm nach Kamera und Gesichtsfeld.
- Stellen Sie Frames pro Sekunde auf Basis der Kameraeinstellungen.
- Stellen Sie die Helligkeit so Schwellen thbei allen Tieren richtig erkannt (Rückmeldung wird in der Vorschau angegeben).
- Passen Larvenflächengröße Schwellen. Beachten Sie die Feedback-Möglichkeit in der Vorschau: Einzeltiere sind gelb markiert, kollidieren Larven sind rot markiert und die Fläche der einzelnen Tiere ist in blau angegeben.
- Start tracking über die Schaltfläche in der rechten unteren Ecke.
HINWEIS: Nach der erfolgreichen Verfolgung wird ein Bild mit Larven Tracks und eine CSV-Datei mit den berechneten Fortbewegung und Haltung Merkmale im Bild gespeichert. - Verwenden Sie die FIM Ergebnisse Viewer-Modul (Bearbeiten> Ergebnisse Anzeige ...) zu überprüfen und manuell anpassen, die Tracking-Ergebnisse. Bei Bedarf definieren Reiz Regionen auf Daten in Bezug auf den Stimulus-Regime zB auswerten, kriechen Orientierung in Bezug auf die Wärmegefälle oder die Entfernung von einem Duftstoff-Quelle. Für ausführlichere Beschreibung nutzen Sie bitte die Bedienungsanleitung (Ergänzung).
10. Bewertung der Daten
- Importieren Sie die CSV-Datei in Excel, Matlab oder ein anderes Programm für die weitere statistische Analyse.
Representative Results
Zum Abbilden verschiedenen Kameras mit unterschiedlichen Auflösungseigenschaften wurden (Abbildung 4) getestet. Alle Kameras, wo mit einem geeigneten IR-Filter ausgestattet. Gemäß der niedrigen Auflösung der günstigste Kamera in diesem Test wird das Sichtfeld 10 cm x 10 cm begrenzt. Die besten Ergebnisse wurden mit einem 4 Megapixel (MP) Kamera erhalten. Dies führt zu einer Auflösung von 100 Pixeln pro dritten Larvenstadium Larvenlänge und man ließ sie leicht erkennen internen Strukturen. Zusätzlich kann die Peristaltik des Tieres leicht extrahiert werden (4A). Allerdings kann man noch erhalten kontrastreiche Filme mit weniger teuren Kameras, die auch von FIMTrack analysiert werden kann. Mit einem 1,4-Megapixel-Kamera mit einer Tiefe von 8 Bit und einer Auflösung von 1392 x 1040 Bildpunkten ist etwa die Hälfte des Preises und ermöglicht eine Auflösung von 45 Pixeln pro dritten Larvenstadium Larvenlänge im Sehfeld. Der Kopf aber keine anderen internen Strukturen zu erkennen (4B). Verfolgung und Erfassung der Peristaltik ist möglich, aber die Genauigkeit reduziert wird (4B).
Mit einem noch günstiger 0,8-Megapixel-Kamera mit einer Auflösung vergleichbar mit der 1,4-Megapixel-Kamera, die Larvenkopf nicht mehr originalgetreu (4C) erkannt werden. Verfolgen und Peristaltik Analyse ist möglich, aber mit mehr Jitter auf der Grundlage der erhöhten Lärm. Überraschenderweise bietet sogar eine niedrige Auflösung USB-Webcam ausreichender Qualität Filme zu Larven Trajektorien berechnen (0,3 MP-Kamera, unter 20 €, 4D). Die Peristaltik kann aus dem Bereich berechnet werden, aber Messungen sind sehr laut.
In unserem Setup routinemäßig verwenden wir die 4-Megapixel-Kamera. Für das Screening, ermöglicht diese Kamera die Überwachung eines 22 cm x 22 cm-Arena, die offensichtlich bietet die Möglichkeit, eine große Anzahl von Tieren gleichzeitig zu analysieren, so dass Hochdurchsatzanalyse möglich ist. Mit dieser Einstellung Larvenlänge is um 40 Pixel, die noch erlaubt die Aufzeichnung und Analyse der Peristaltik vertreten. Ein beispielhaftes Bild von 15 Larven Trajektorien in einem Wärmegefälle ist in 5A angegeben. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung eines Makro-Objektiv zur Bild Larven mit sehr hoher Auflösung, wo viele der inneren Organe sichtbar und Kopferkennung weiter verbessert wird (5B). Außerdem können diese für weitere detaillierte Analyse des Verhaltens eines weiten Bereichs 20 verwendet werden. Die gleiche Einstellung kann leicht zu Bild kriechen C eingesetzt werden elegans-Würmer (5C).
Abbildung 4. FIM Bildgebung und Tracking-Ergebnisse für verschiedene Kameras. (A) Links: FIM Abbildung von drei Larven kriechen auf einem 10 cm x 10 cm Verfolgungsstufe eingefangen mit einer 4-Megapixel-Kamera mit 10 fps. Mid:Clipping und Schwerpunktsbahn eines einzelnen Larve. Die Fläche des Tieres angezeigt wird. Rechts: Die Umgebung der Larve aufgetragen über 100 Bilder. Der rote Pfeil zeigt den Zeitpunkt des ausgeschnittenen Bild. (B) Entspricht (A), sondern erfasst mit einem 1,4-Megapixel-Kamera. (C) Entspricht (A), sondern erfasst mit einem 0,8-Megapixel-Kamera. (D) Entspricht ( A), sondern erfasst mit einem 0,3-Megapixel-Kamera. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 5. Wärmereiz, und Anwendungen mit hoher Auflösung. (A) Wärmereizapplikation (vergleiche Abbildung 1). Trajektorien über FI berechnetMtrack. (B) mit hoher Auflösung Anwendung Bild eines dritten, zweiten und ersten Larvenstadium mit einem Makro-Objektiv. Das dritte Larvenstadium Larvenlänge wird durch 400 Bildpunkte in einem Sichtfeld von 2,5 x 2,5 cm dargestellt. (C) A C elegans Wurm eingefangen mit FIM-Bildgebung. Maßstabsbalken angezeigt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Discussion
In Behavioral Neuroscience ist es zwingend erforderlich, um quantitativ zu entziffern komplexe Verhaltensmerkmale. So muss eine große Zahl von Personen mit hoher Auflösung beobachtet und automatisiert werden Verfahren für die statistische Analyse erforderlich. Hier wird FIM Bildgebung beschrieben, eine neuartige, einfache und robuste Bildaufbau, die die Mittel zur Fortbewegung von einer Vielzahl von Tieren Überwachung bietet. Die Wirksamkeit der FIM Imaging-Setup wurde mit Drosophila-Larven, Planarien Plattwürmer und C getestet elegans Würmer. Die FIM-Technologie bietet eigen hohen Kontrast, auch die internen Strukturen der Tiere, wie das Gehirn, Luftröhre, des Darms oder der Drüsen erkennen. Wichtig ist, dass diese inneren Strukturen robust identifiziert, so dass sie dazu dienen können, um die Ausrichtung des Tieres 19 automatisch zu identifizieren.
Die Qualität der Filme können durch zu viel Wasser auf der Oberfläche kriechen beeinflusst werden. So wichtig, ist esKontrolle der Feuchtigkeit des Agar. Zu alt Agar oder zu viel Wasser auf der Oberfläche kann Artefakte verursachen. Ebenso ist sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Krabbeloberfläche enthalten. Im Allgemeinen ist eine gut vorbereitete Agar-Oberfläche ermöglicht die Aufnahme von Filmen 4 Stunden.
Aufgrund der zugrunde liegenden physikalischen Prinzipien FIM-Bildgebung erzeugt nahezu rauschfreie Bildaufnahmen, was eine hervorragende Bildqualität. Dies wiederum erleichtert das nachfolgende computerbasierte Bildanalyse und ermöglicht einen hohen Durchsatz. Jedoch ist die Methode der Analyse Tiere, die direkt an die Agaroberfläche beschränkt. Die Tracking-Software wird von Tieren Bildung einer Ringform in Frage gestellt. Obwohl eine binäre Anzeige erkennt die Donut-Form, kann eine falsche Wirbelsäule berechnet werden.
Durch den modularen Aufbau der Verfolgungstabelle Dual- und Triple-Farbabbildung ist in Reichweite. Darüber hinaus können zusätzliche Reize (Licht, Geruchsstoffe, elektrische oder mechanische Reize) leicht delvon oben ivered. Die FIMTrack Programm entwickelt, um die Macht der FIM Bild passen einfach angenommen, um Drosophila-Larven, C. verfolgen elegans oder Planarien. Daher und aufgrund seiner einfachen und billigen Aufbau (siehe http://FIM.uni-muenster.de), FIM-Bildgebung möglich für eine breite Palette von biomedizinischen Anwendungen und insbesondere ermöglicht dringend benötigten hohen Durchsatzstudien.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren
Acknowledgments
Wir sind für die Hilfe beim Bau des FIM-Setup dankbar, S. Thomas, die dieses Projekt ins Leben gerufen hat, J. Hermann und U. Burgbacher. Diese Arbeit wurde von der DFG (SFB 629 B6) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FIM setup | Custom | details for construction or purchase of setups is available upon request | |
| Acrylic glass plate | Custom | Additional for agar pouring | |
| Heat radiator plate | Custom | Aluminum plate (paintet in matt black) perfusable on opposing sites with adjustable mounting | |
| Water calorifier/cooling pumps and hoses | Custom | based on GE healthcare MultiTempIII (No.: 18-1102-78) and Dr Bruno Lange GmBH (Typ: LTG013) | |
| Standard Camera (4 MP) | Basler | acA2040-25gm | Camera defaultly used for the FIM setup |
| Test Camera (1.4 MP) | QImaging | 1394 firewire (01- QIC-F-M-12 MONO) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.8 MP) | Point Grey | Dragonfly 2 (DR2-13S2M/C-CS) | Camera used for comparison |
| Test Camera (0.3 MP) | Sony | PS Eye USB2.0 camera | Camera used for comparison |
| Computer | Custom | equipped with at least i5 Intel processor or better, 16 GB RAM and sufficient HDD storage space [>1TB] | |
| Standard Fly food | Custom | ||
| Standard Fly vials 135 ml | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 78,895 | |
| Petri dishes 9 cm | Sarstedt AG&Co, Nümbrecht, Germany | 821,473 | |
| Ultrapure deionized water | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | Synergy | |
| NaCl | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 3957.2 | |
| Food grade agar | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A0917,5000 | |
| Paintbrush (small and large) | Milan | Aquarell 310 Size 0 and 2 | |
| Pyrometer | Trotec | BP20 |
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