Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

doi: 10.3791/52220 Published: December 26, 2014

Abstract

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è il grande, sinapsi relè colinergici attraverso cui i neuroni motori mammiferi controllano la contrazione muscolare volontaria. I cambiamenti strutturali del NMJ possono causare insufficienza neurotrasmissione, con conseguente debolezza, atrofia e persino la morte della fibra muscolare. Molti studi hanno indagato come modificazioni genetiche o malattie possono alterare la struttura del NMJ mouse. Purtroppo, può essere difficile confrontare direttamente i risultati di questi studi, perché spesso utilizzati diversi parametri e metodi analitici. Tre protocolli sono descritte qui. Il primo utilizza massima intensità di proiezione immagini confocale per misurare l'area di acetilcolina recettore (AChR) ricchi di domini di membrana postsinaptici alla placca e la zona della vescicola sinaptica colorazione nella terminazione nervosa presinaptica sovrastante. Il secondo protocollo confronta le intensità relative di immunocolorazione per proteine ​​sinaptiche nella membrana postsinaptica. Il terzo protocol utilizza Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per rilevare i cambiamenti nel confezionamento di AChRs postsinaptici alla placca. Sono stati sviluppati e raffinato in una serie di studi I protocolli. I fattori che influenzano la qualità e la coerenza dei risultati vengono discussi e dati normativi sono previste NMJs in soggetti sani giovani topi adulti.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi relè critico che media la comunicazione tra il sistema nervoso e muscolo scheletrico. E 'richiesto per tutti i movimenti volontari. La microscopia a fluorescenza è stato a lungo utilizzato per studiare gli effetti della transgeni del mouse NMJ 1-3 o per confrontare gli effetti di età, la dieta, esercizio fisico e le malattie sul NMJs roditori 4-11. Tali studi hanno insegnato molto sulla fisiologia e fisiopatologia della NMJ, ma i diversi parametri segnalati (ad esempio, zona AChR, zona endplate, la lunghezza del perimetro, indici di frammentazione) spesso rendono difficile il confronto dei risultati di questi studi. C'è un'aspettativa crescente per i ricercatori pre-clinici per essere in grado di dimostrare la riproducibilità, in particolare in studi con modelli di roditori di malattia 12. I protocolli descritti qui sono state affinate attraverso una serie di studi che ha indagato sviluppo, fisiologico e fisiopatologico changes al NMJ. Tali studi richiedono misurazione della zona di specializzazioni sinaptiche alla placca motore mouse e la densità relativa di imballaggio, di proteine ​​sinaptiche all'interno specializzazioni postsinaptici 13-15.

L'utilità di questi metodi è illustrato da studi recenti in un modello murino di anti-MuSK miastenia gravis. Iniezioni giornaliere di IgG da miastenia anti-MuSK-positivi gravis pazienti in topi adulti hanno causato loro di diventare deboli entro 2 settimane 16. Confocale immagini di massima proiezione di sezioni muscolari che sono stati doppio etichettati per sinaptofisina (in nervosi terminali) e post-sinaptici AChRs rivelato un progressivo declino nella zona del recettore colorazione come il cambiamento primario. È importante sottolineare che il tasso di declino è stato sufficiente a spiegare calo comparabili in ampiezza dei potenziali sinaptici, il fallimento della trasmissione sinaptica e debolezza muscolare 17,18. Qualitativamente Risultati simili sono stati riportati da altri gruppi di ricerca10,19. Gli stessi metodi di misurazione NMJ allora sono stati utilizzati per valutare l'impatto di tre farmaci per il trattamento anti-MuSK miastenia grave in questo modello di topo 20,21.

Invecchiamento sedentario può portare alla perdita di connessioni neuromuscolari. I protocolli descritti hanno rivelato un declino associato all'età in materia di terminazione nervosa synaptophysin a placche motrici come topi progrediscono in età avanzata. Gli stessi metodi hanno rivelato che l'esercizio fisico volontario potrebbe in gran parte prevenire la riduzione della zona terminale nervoso presinaptico 22, in linea con il lavoro precedente di altri gruppi 4. La perdita delle connessioni neuromuscolari si verifica anche nel modello murino SOD1G93A di sclerosi laterale amiotrofica 9,23.

Gli studi di cui sopra dimostrano che una varietà di condizioni di salute può portare a riduzioni in materia di specializzazioni sia pre o post-sinaptici al NMJ. Ciò può comportare divertimento sinaptica alterataction o può preannunciare la perdita completa della connessione neuromuscolare. Tre protocolli sono descritte che permettono quantificazione della superficie e la densità di specializzazioni sinaptici. Lo scopo del primo protocollo è quello di fornire una misura pratica e riproducibile delle aree di pre e post-sinaptici specializzazioni e il loro allineamento a NMJs di mammifero, utilizzando microscopia a fluorescenza. Bidimensionali immagini massimi proiezione confocale e analisi di immagine con NIH ImageJ è utilizzato per rilevare i cambiamenti nel settore della sinaptofisina colorazione (vescicole sinaptiche), AChRs post-sinaptici e area di sovrapposizione sinaptica. Parametri confocale (gain e offset di livello) sono ottimizzati per ogni NMJ in modo da massimizzare le informazioni visive utilizzate per discernere l'area di specializzazione sinaptica. Insufficienza neuromuscolare può anche derivare da variazioni di densità del recettore postsynaptic e / o di altre proteine ​​sinaptiche. Il secondo protocollo può essere applicata per rilevare variazioni nella densità relativa di proteine ​​postsinaptici talicome muschio, rapsyn, distroglicano, fosforilata Src chinasi e fosforilata AChR 18,21.

In miastenia grave, una densità ridotta del recettore nella membrana post-sinaptica è la causa immediata del fallimento sinaptica e debolezza muscolare. Il terzo protocollo descrive un metodo Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per valutare i cambiamenti in prossimità di AChRs adiacenti all'interno delle membrane postsinaptiche 14,15. Questo metodo rileva il trasferimento di energia tra AChRs vicini etichettati con fluorescenti-α-bungarotossina (BGT). FRET avviene solo quando le sonde donatore e accettore fluorescenti sono meno di 10 nm a parte. Questo può rivelare (submicroscopiche) delle modifiche, la tenuta di AChR imballaggio che possono riguardare direttamente l'ampiezza dei potenziali sinaptici.

Questi tre protocolli, raffinati negli ultimi dieci anni, prevedono misure complementari di integrità NMJ in modo coerente e riproducibile. L'utilizzo di protocolli standardizzati unParametri nd dovrebbero facilitare il confronto degli effetti di geni e interventi ambientali su mammifero NMJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOTA: Progettazione, gestione e rendicontazione di esperimenti sugli animali dovrebbero tenere conto degli orientamenti attuali 24. Tale lavoro deve essere preventivamente approvato dalle autorità locali il benessere degli animali (nel nostro caso il comitato della University of Sydney Etica Animale).

1. L'eutanasia dell'animale e Muscle Dissection

  1. Trasferire il mouse dalla camera di conservazione ad una camera separata dove è eutanasia con una iniezione intraperitoneale di soluzione pentobarbitone (30 mg / kg) utilizzando il metodo di movimentazione del mouse dettagliato da Shimizu 25. Posizionare il mouse di nuovo nella sua gabbia.
  2. Una volta che il respiro del mouse è fermato per più di 1 min, testare il riflesso piede-ritiro pizzicando delicatamente il piede, e il riflesso corneale mediante spazzolatura leggermente la cornea. Solo quando risposte riflesse sono assenti il ​​mouse può essere preparata per la dissezione.
  3. Consultare un atlante di anatomia roditore quali Chiasson 26 e / o chiedere l'aiuto di un espeanatomista ced prima di tentare dissezione del muscolo di interesse. In ciascun caso rimuovere i peli dalla pelle sovrastante usando un piccolo rasoio elettrico prima di aprire la pelle per esporre il muscolo.
    NOTA: La dissezione sarà diverso per ogni muscolo-anatomicamente distinti.
  4. Utilizzando pinze smussato liberare il muscolo dalla sovrastante membrane e dei tessuti circostanti. Afferrare e tagliare il tendine distale per separare il muscolo dalla sua inserzione.
  5. Stuzzicare delicatamente e tagliare il muscolo privo di tessuto circostante destra torna alla sua origine. Brevemente posizionare il muscolo appena sezionato in soluzione 0,1 M tampone fosfato salino (PBS) o soluzione di Ringer prima dell'ulteriore lavorazione.

2. Preparare il muscolo per criosezionamento

NOTA: conservazione strutturale ottimale può essere ottenuto mediante perfusione intero animale come precedentemente descritto 27, o immersione fissaggio (per piccoli muscoli) come descritto al punto 2.1 opzionale. Tuttavia,4% di fissazione paraformaldeide può compromettere la successiva colorazione con molte sonde anticorpi e fluorescenti-BGT. Glutaraldeide particolare dovrebbe essere evitato. Se muscoli non sono da fissare devono essere immediatamente congelati a scatto (procedere 2.3).

  1. Fissaggio Opzionale immersion: Pin il muscolo di cera in una capsula di Petri a lungo a riposo. Coprire il muscolo con 2% w / v paraformaldeide (appena sciolto in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con 3 cambi di PBS oltre 30 min (3 x 10 min) quindi sostituire il PBS con 30% w / v di saccarosio in PBS e incubare O / N a 4 ° C.
  2. Rendere stampi ('barche') in anticipo piegando due centimetri x 1,5 cm pezzi di fogli di alluminio come mostrato in figura 1. Posizionare un pezzo di membrana di nitrocellulosa sul fondo della barca. Versare delicatamente criostato incorporamento matrice (tabella materiali) in barca ad una profondità di 2 mm, avendo cura di evitare bolle d'aria. Posizionare il muscolo nella barca, allineandola con la penna linee sfera sula nitrocellulosa. Aggiungere più matrice incorporamento in modo da coprire completamente i muscoli (Figura 1).
  3. Tubi in polipropilene pre-label con un pennarello indelebile. Inserire una goccia d'acqua in ciascuna provetta e raffreddare il tubo in azoto liquido.
    NOTA: La goccia d'acqua congelata mantiene la tensione di vapore ed evita essiccazione durante prolungata -80 ° C di stoccaggio
  4. Utilizzando una visiera, guanti protettivi spessi e un grande paio di pinze smussato, parzialmente abbassare un piccolo bicchiere di metallo (3 cm di diametro, a 8 cm di profondità) contenente 2 cm Profondità di isopentano in un contenitore di azoto liquido per 30 sec. Togliere il bicchiere e posizionarlo sul banco. Utilizzando un paio di pinze piccolo smussato posizionare lo stampo contenente il muscolo e l'incorporamento di matrice in isopentano raffreddato. Fare attenzione ad evitare la miscelazione azoto liquido con l'isopentano.
  5. Lasciare 2 min per il blocco di congelare completamente prima di usare pinze smussato per sollevare il blocco congelato fuori e sigillarlo nel pr correttoe-etichettati e tubi pre-raffreddata (passo 2,3).
  6. Conservare le provette temporaneamente nella azoto liquido prima del trasferimento a -80 ° C. Entra tutti i campioni in un foglio di calcolo di contenuti freezer.

3. criosezionamento e fluorescenza colorazione per en face Immagini di NMJs

  1. Sbucciare via lo stampo in alluminio. All'interno della camera di -20 ° C criostato fissare il blocco congelato al mandrino criostato in modo da tagliare 20 micron criosezioni parallele all'asse lungo delle fibre muscolari (Figura 1). Raccogliete le sezioni su poli-L-lisina o gelatina rivestito vetrini da microscopio.
  2. NOTA: Omettere questo passo se il tessuto è fissato prima del congelamento. Dopo 30 min per permettere sezioni asciugare sui vetrini, fissarli mettendo una goccia del 2% paraformaldeide in PBS su ciascuna sezione per 15 minuti a RT.
  3. Lavare i vetrini 3 x 10 min in PBS in una vaschetta Coplin, e poi immergere i vetrini in PBS contenente 0,1 M glicina per 30 minuti per bloccare gruppi aldeide residui.
  4. Lavare i vetrini per 10 minuti in PBS, poi immergere in metanolo (raffreddata a -20 ° C) per 7 min. Questo passaggio permeabilizzazione è una parte di routine della doppia marcatura con fluorescenti-BGT e anti-sinaptofisina ma può influenzare negativamente immunocolorazione per alcune altre proteine.
  5. Lavare i vetrini 2 x 10 min in PBS poi posto ogni diapositiva in una camera umidificata stabile e livellato. Coprire immediatamente ogni sezione con 20 ml di soluzione di blocco (0,2% Triton X-100, 2% di siero albumina bovina (BSA) in PBS) per 1 ora a RT. Le sezioni non devono essere lasciati ad asciugare in qualsiasi fase del processo di immunocolorazione.
  6. Effettuare l'incubazione primaria: Prendere un vetrino alla volta rimuovere con attenzione la soluzione di saturazione in eccesso su ogni sezione e sostituirlo con 20 ml di coniglio anti-sinaptofisina (diluito 1: 200 nella soluzione di blocco).
  7. Includere un vetrino negativo di controllo che saranno incubate con blocco unica soluzione. Questo 'no-primario controllo dell'anticorpo'È fondamentale in ogni corsa immunocolorazione.
  8. Facendo attenzione che l'anticorpo primario rimane in vigore su ogni sezione, chiudere la camera umidificata e incubare per 1-2 giorni a 4 ° C.
  9. Ispezionare ogni sezione per confermare che l'anticorpo primario rimane al suo posto. Utilizzare una pipetta Pasteur per lavare delicatamente ogni diapositiva con PBS e metterlo in una vaschetta Coplin. Lavare tutte le diapositive 3 x 10 min in PBS.
  10. Effettuare incubazione secondaria. Prendere un vetrino alla volta, rimuovere con attenzione l'eccesso di PBS, si trovava nella camera umidificata e coprire ogni sezione con 20 ml di una miscela contenente IgG FITC-coniugato asino anti-coniglio e BGT coniugato tetrametil rodamina o un'altra fluoroforo rosso (TRITC- / redBGT; 5 g / ml) diluito in soluzione bloccante. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
  11. Lavare i vetrini 3 x 10 min in PBS in vaschette Coplin.
  12. Prendere un vetrino alla volta, rimuovere con attenzione l'eccesso di PBS e montare con un coprioggetto utilizzando un volume minimo di, glycerobasata l-, fade-resistente mezzo di montaggio. Sigillare i bordi dei vetrini con vernice trasparente per unghie. Lasciare asciugare duro.
  13. Conservare i vetrini al buio a 4 ° C per un massimo di una settimana, oppure a -20 ° C per periodi di conservazione più lunghi (fino a diversi mesi).

4. imparziale Campionamento e En Face Imaging di Motor placche

  1. Accecare le diapositive etichettando ogni diapositiva con un numero di codice casuale che resta noto solo a un secondo ricercatore (non coinvolta nell'analisi). Come risultato l'operatore rimane ciechi ai gruppi di trattamento fino quantificazione dei parametri NMJ è completa per tutti i campioni.
  2. Posizionare il vetrino sul palco microscopio e vederlo sotto illuminazione campo largo con il set di filtri TRITC (63X olio 1,3 obiettivo NA). Spostare progressivamente (campo per campo) da sinistra a destra e viceversa fino a quando un endplate appare nel campo (Figura 2A).
    Criterio di campionamento:: NOTA Ogni struttura AChR macchiato che è relativamentepiatta e si trova di fronte l'obiettivo (ad esempio, si estende <15 m nel z-dimensione) è considerato un piatto vertebrale ed è ripreso per l'analisi (mezzelune di AChR colorazione rappresentano sezioni tramite piastre laterali e sono quindi esclusi).
  3. Con il set pinhole confocale a 1,0 unità di Airy e potenza laser a bassa ottimizzare il guadagno e offset livelli per TRITC / rosso-BGT (laser 532 nm) al endplate che deve essere ripreso. Avanti ottimizzare FITC / fluorescenza synaptophysin utilizzando il laser 488 nm. Raccogliere un z-stack della placca con un intervallo di 0,7 micron tra ogni fetta ottica. Salvare le immagini con un nome di file che include la data della sessione di imaging, il nome in codice della diapositiva e il numero della placca.
    NOTA: Le scansioni utilizzando il 488 nm e 532 nm laser (FITC e TRITC) devono essere raccolti in sequenza (non contemporaneamente) per evitare la contaminazione del canale FITC con la fluorescenza del fluoroforo rosso e viceversa (sanguinare-through).
  4. Ripetere il campionamento di unnd imaging passi 4,2-4,3 fino al 20 piastre laterali sono raccolti dalla diapositiva / campione.
  5. Passare alla diapositiva successiva codificato e ripetere 4,2-4,4. Ripetere per ciascuno dei vetrini codificati.
  6. Raccogliere alcune immagini di placche dal vetrino di controllo (no-primario di controllo degli anticorpi) utilizzando le impostazioni confocale che sono stati trovati ottimale per le diapositive sperimentali (il canale di fluorescenza FITC dovrebbe apparire scuro).
  7. Alla fine della sessione confocale trasferimento i file di immagine in un altro computer e il backup dei file originali su un drive esterno o un server.

5. Misurare l'area di Synaptic Specializzazioni in en face Immagini

  1. Utilizzare NIH ImageJ freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) per preparare la massima proiezione (MIP) immagini da ogni z-stack. Salvarli come file tiff (Figura 2A & B). I nomi dei file dovrebbero includere la data della sessione immagine, codice di esempio, il numero e il canale endplate fluorescenti (ad esempio, 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. Aprite l'immagine z-proiezioni in ImageJ. Selezionare il canale dell'immagine recettore dell'acetilcolina (figura 3A) e selezionare: Immagine> Tipo> 8-bit per convertire l'immagine di colore RGB a 24 bit in tre immagini in scala di grigi a 8 bit sullo schermo.
  3. Utilizzando lo strumento poligono ImageJ disegnare un abbozzo intorno alla placca di interesse per il redBGT macchiato (ACHR) del canale in modo da includere tutte le regioni colorate apparenti particolare placca individuo, ignorando qualsiasi colorazione che non provengono dalla placca di interesse ( Figura 3C).
  4. Applicare una soglia minima di intensità all'immagine selezionando: Immagine> Regola> Soglia (Figura 3E e screenshots ImageJ associati).
  5. Regolare il livello di soglia in modo da isolare le parti AChR-macchiati escludendo circostante segnale di fondo come sub-soglia (Figura 3E). Aprire un secondo ventoow l'immagine originale (tono continuo) con immediatamente accanto alla finestra per il confronto, per facilitare la decisione circa il valore di soglia. Registrare il valore di soglia per un uso successivo in colocalization analisi.
  6. Mantenendo il contorno del poligono intorno alla placca selezionare: Analizza> Analizzare particelle. Nel menu a comparsa specificare l'intervallo di formati come: 50 a Infinity pixel (questo elimina piccoli manufatti derivanti da disturbi elettrici nel fotomoltiplicatore).
  7. Analizza il comando particelle genera una finestra con un elenco di aree sovra-soglia discreti e loro valori di intensità di fluorescenza numerata come appaiono nell'immagine binaria (Figura 3G e associato ImageJ screenshot). Copiare questi dati in un foglio di calcolo con etichetta.
  8. Misurare l'area placca totale (area all'interno del poligono) selezionando: Analizza> Misura. Questo produce la superficie totale placca. Copiare e incollare i dati per aree AChR e intensità inun foglio di calcolo facendo attenzione a etichettare le colonne in modo appropriato, sarà utilizzato per le righe placche individuali per diapositive specifiche.
  9. Passare al canale di fluorescenza anti-sinaptofisina e ripetere i passaggi 5,1-5,5, ma per il canale FITC (Figura 3B, D e F). L'obiettivo è quello di regolare la soglia in modo che crea un'immagine binaria che, il più possibile, corrisponde ai confini di colorazione come percepito dall'occhio. Registrare il valore di soglia.
  10. Misurare l'area di sovrapposizione, applicando le seguenti operazioni: Aprire il file originale contenente le due immagini del canale e dividerlo in due immagini separate selezionando: Immagine> Stack> Stack di immagini.
  11. Utilizzando il plugin Colocalizzazione (scaricato e installato dal sito ImageJ) Seleziona: Pluggin> Colocalizzazione e immettere i valori di soglia precedentemente registrati per i canali AChR e nervosi nel rispettivo canale di query bbue. Ciò produrrà un'immagine sovrapposizione in pixel bianchi (figura 3H e screenshot ImageJ associati).
  12. Convertire dell'immagine sovrapposizione appena creata in un formato scala di grigi e applicare una soglia al valore massimo. La soglia massima selezionerà solo i pixel bianchi, corrispondente alla zona di sovrapposizione dei due canali precedenti. Record nel foglio il valore dell'area risultante 'colocalizzazione', che rappresenta l'area di sovrapposizione in pixel.
  13. Preparare un foglio di calcolo di medie campionarie di dati, calcolare e tracciare le deviazioni standard e gli errori standard come istogrammi o grafici a dispersione 20,22. Si noti che il valore di n rappresenta generalmente il numero di topi per gruppo campione a fini statistici.
  14. Endplate Plot aree AChR come grafici a dispersione o istogrammi di frequenza per determinare se i dati sono distribuiti normalmente prima del test statistico (Figura 6).

6. colorazione relativaLe intensità rispetto Utilizzando sezioni ottiche trasversali

NOTA: Per questo processo protocollo tutti i campioni muscolari insieme e immagine in una singola sessione confocale. Nel pianificare un esperimento di consentire fino a tempo di imaging 30 min per campione muscolare.

  1. Tagliare 15 micron criosezioni trasversale all'asse lungo delle fibre muscolari e raccogliere su vetrini come descritto al punto 3.1.
  2. Effettuare la colorazione in fluorescenza come descritto nei passaggi 3,2-3,13.
  3. Codice del vetrini colorati in modo che l'imaging e le analisi vengono realizzati con l'operatore cieca gruppo di trattamento, come descritto al punto 4.1.
  4. Utilizzando un obiettivo di fluorescenza 40X (NA 0.75) brevemente rilevare una sezione ogni diapositiva per determinare un unico guadagno e offset impostazione del livello per il recettore che sarà adatto per tutte le placche terminali attraverso tutte le diapositive di esempio. La placca luminosa dovrebbe poi essere appena sotto 256 grigi sulla scala. Questa ottimizzazione dovrebbe essere fatto separatamente per il secondo fluorescence canale (raccolte successivamente). Registrare il guadagno fisso e offset impostazioni di livello e non li altera in tutta la sessione di imaging.
  5. Raccogliere immagini di un vetrino standard di fluorescenza (ad esempio, perline fluorescenti non sbiancanti), utilizzando gli stessi parametri, all'inizio e alla fine della sessione confocale per rilevare eventuali fluttuazioni di intensità laser.
  6. Utilizzare il canale AChR per eseguire la scansione della diapositiva progressivamente per individuare placche.
  7. Focus di trovare il piano di sezione ottica singolo in ogni campo del microscopio che contiene il maggior numero di piastre laterali AChR-macchiati.
  8. Scansione questa singola sezione ottica due volte e salvare l'immagine in media (Figura 4G).
  9. Mantenendo lo stesso interruttore piano focale al secondo canale di fluorescenza (proteina di interesse) e raccogliere l'immagine come al punto 6.8. Salvare il file di immagine, anche nel nome del file: data della sessione di imaging, codice di esempio, il numero di immagini e un simbolo per indicare il canale di fluorescenza. F mostra esempi della distribuzione placca di AChR rispetto al rapsyn, muschio o -dystroglycan (-DG).
  10. Spostare il palco per il campo successivo che contiene uno o più piastre laterali e ripetere il punto 6,8-6,9. Ripetere questo fino a un totale di 60 endplates vengono esposte.
  11. Alla fine del trasferimento sessione di imaging di tutti i file in un altro computer ed eseguirne il backup.
  12. Aprire ogni file immagine originale e durante la visualizzazione del canale AChR, selezionare: Immagine> Stack> Stack di immagini, di dividere i canali.
  13. Seleziona: Immagine> Tipo> 8bit da convertire in formato in scala di grigi a 8 bit sullo schermo. Fate questo per entrambi i canali di fluorescenza.
  14. Seleziona: Immagine> Stacks> Immagini per impilare. Aprire una nuova pila da due immagini precedentemente separate 8 bit. Si può quindi passare tra i due canali di fluorescenza all'interno della finestra singola convenientemente.
  15. Utilizzare lo strumento Poligono per disegnare un line stretto attorno al perimetro della colorazione AChR (figura 4I).
  16. Seleziona: Analizza> Misura per misurare l'intensità media dei pixel per AChR all'interno della zona delimitata (notare l'importanza di tracciare la linea ermeticamente). Copiare questo valore in un foglio di calcolo con etichetta.
  17. Mantenendo lo stesso profilo poligonale (per definire l'area da misurare), passare al secondo canale fluorescenti (ad esempio, la Figura 4B, D, F) e selezionare: Analizza> misura. Ciò produrrà l'intensità media di colorazione per la proteina di interesse nella zona sinaptica definita da AChR colorazione.
  18. Scegli una zona fuori dal visibile endplate colorazione quindi selezionare: Analizza> Misura per misurare l'intensità media fluorescenza di fondo. Ripetere l'operazione per l'altro canale di fluorescenza / s e copiare i valori di fondo nel foglio di calcolo dei valori di fluorescenza.
  19. Subtratto i valori medi di fondo dai valori endplate per ottenere le intensità corrette per AChR e la proteina di interesse ad ogni endplate.
  20. Dividere i valori di intensità endplate corretti per la proteina di interesse per l'intensità di fluorescenza BGT corretta per dare i rapporti di intensità di fluorescenza 14,21

7. Confrontando densità postsinaptica membrana AChR Uso FRET

NOTA: Questo protocollo valuta la misura in cui AChRs sono strettamente imballati (<10 nm spaziatura) nella membrana postsinaptica. La combinazione donatore e accettore fluoroforo preciso è fondamentale per questo test FRET. Nomi e dettagli dei fluorofori sono riportati nella tabella dei materiali. Le loro proprietà spettrali, in relazione FRET, sono discussi nelle nostre precedenti documenti 14,15.

  1. Preparare criosezioni trasversali fissi come descritto nella sezione 6.1. Tutti i gruppi di campioni devono essere trattati insieme e l'immagined nella stessa sessione confocale.
  2. Mescolare accuratamente 2,5 g / ml rosso-BGT (FRET donatore) con 10 g / ml lontano rosso-BGT (FRET accettatore) con soluzione bloccante in un piccolo tubo di plastica pipettando su e giù per 12 volte. Questa miscela 1: 4 molare massimizza l'efficienza della FRET 14.
  3. Mettere ciascun vetrino in una camera umidificata, coprire accuratamente ogni sezione con una goccia (12 ml) della miscela sopra e incubare per 1,5 ore a temperatura ambiente.
  4. Sezioni di controllo: riguardano un numero limitato di sezioni con 2,5 g / ml rosso-BGT (unico donatore; controlli C1 etichettati), e anche alcune sezioni con 10 g / ml far-red-BGT (solo accettore; controlli C2 etichettati). Incubare questi controlli come al punto 7.3.
  5. Lavare i vetrini 3 x 10 min in PBS e montare in base glicerolo-, fade-resistente mezzo di montaggio (vedi punto 3.12).
  6. Eseguire il campionamento delle placche come al punto 6.7. Fluorescenza dal donatore e accettore deve essere perfettamente co-localizzato a piastre laterali a causa del caso di legame delle molecole fluorescenti-BGT.
  7. Immagini di controllo: Utilizzare l'obiettivo 40X e bassa laser di potenza ottimizzare il guadagno e offset redBGT impostazioni del livello di placche da un C1 cursore. Ottimizzare guadagno lontano redBGT e offset livelli di placche di comando di scorrimento C2. Conferma assenza di fluorescenza a spurgo attraverso.
  8. Senza cambiare la potenza del laser, guadagnano o impostazioni a livello di compensazione si spostano le diapositive sperimentali e raccogliere immagini (pre-photobleach) per entrambi i canali di fluorescenza.
  9. Photobleach selettivamente lontano-rosso-BGT su una porzione di un singolo endplate ingrandendo l'area di scansione poi 10 volte la scansione con il laser 633 nm a 100% di potenza. La fluorescenza nell'area scansionata dovrebbe diventare dim.
  10. Ripristina la potenza del laser e lo zoom e raccogliere le immagini post-candeggina su entrambi i canali fluorescenti utilizzando le impostazioni confocale stabiliti a 7,7.
  11. Calcolare l'efficienza FRET (E) dal l'aumento percentuale dei donatori (rosso-BGT) di fluorescenza a seguito photobleach del accettore (far-red-BGT) secondo la seguente formula *:
    Equazione 1
    * Per tutte le situazioni in cui la fluorescenza del donatore aumenta dopo photobleaching accettore.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Misura di Synaptic Area al NMJ

Qualsiasi stima della zona si basa sul disegno di un contorno per definire l'estensione di specializzazioni sinaptici. Nei giovani adulti sani muscoli immagini NMJ dovrebbero visualizzare i confini ben definiti sia per AChR e synaptophysin colorazione (Figura 2A e B). Intensità di fluorescenza sia per AChR e synaptophysin aumenta sensibilmente al confine tra la porzione peri-sinaptica e sinaptica del endplate motore (Figura 5A 'e B'). Per tali immagini una soglia minima (appena sopra sfondo extrasinaptica fluorescenza) prontamente isolare l'area AChR-ricco o ricco sinaptofisina della placca (linee tratteggiate in orizzontale (Figura 5A 'e B')). Nei topi anziani e in qualche colorazione stati patologici endplate per AChR può essere meno intensa, i bordi del cluster AChR possono apparire sfocata e lare possono essere più elevati livelli di autofluorescenza extrasinaptica (Figura 5D; 17,22). Fluorescenza colorazione con confini indistinti può introdurre errori nella stima di superficie sinaptica. In tutte le situazioni l'obiettivo è quello di scegliere una soglia che produce un'immagine binaria simile per forma e dimensioni alla AChR- o zone ricche sinaptofisina come appaiono all'occhio l'immagine originale, tono continuo in. Esecuzione ciechi analisi al gruppo di trattamento dovrebbe ridurre il rischio di polarizzazione personale al passo soglia (passo 4.1). A volte le immagini endplate deboli o sfocate possono derivare dalla lavorazione sub-ottimali. Figura 2C e D mostra un esempio di un'immagine a bassa endplate qualità da un sano 2 mesi di età del mouse. Bordi sfocati e debole synaptophysin colorazione sono sorti in questo caso da scongelamento parziale e ricongelamento del muscolo prima criosezionamento. Alcune sezioni del giovane (controllo positivo) muscolo sano dovrebbe essere sezionato unnd trasformati in parallelo con i campioni sperimentali per garantire che evidente nelle immagini NMJ qualsiasi valore non è causa di problemi con immunocolorazione. Gruppi di immagini compromessi da lavorazione sub-ottimali devono essere esclusi dalle analisi.

Per en images z-stack faccia, 15-20 placche è un campione ragionevole per stimare le zone sinaptiche. Una grande diversità nelle forme e dimensioni di NMJs si trovano all'interno di un determinato muscolo. Scatterplot rivelano una notevole gamma nell'area AChR ricchi tra piastre laterali del muscolo tibiale anteriore di ogni individuo mouse (Figura 6A). Tuttavia, l'area AChR media (basata su 15-20 en images face endplate) era simile tra i sette topi campione (~ 200 m 2; Figura 6A). L'area di endplate synaptophysin colorazione anche varia considerevolmente tra placche di un determinato muscolo. Ancora una volta, utilizzando un campione di 15-20 endplates l'area media di endplate sinaptofisina era similar tra il 7 topi studiato (~ 170m 2; Figura 6B). Istogrammi di frequenza dei dati raccolti hanno rivelato distribuzioni o meno normali per la zona di endplate AChR e sinaptofisina (figura 6A 'e B'). Tuttavia una normale distribuzione delle zone sinaptiche non può essere assunto in stati patologici, come la miastenia gravis 16,20. Ciò può influenzare la scelta del test statistico.

Tabella I elenca le aree di specializzazione pre e post-sinaptici per NMJs per salutare 2 mesi di età (giovani adulti) di sesso femminile C57Bl / 6J da studi precedenti. Le aree di specializzazione sia pre- e post-sinaptici diminuiti con l'invecchiamento sedentario 22. Zona AChR stato anche notevolmente ridotta nei topi iniettati con IgG da anti-MuSK miastenia grave pazienti 17,21. Miasteniche topi trattati con il farmaco inibitore della colinesterasi, pyridostigmine, visualizzate una ulteriore significativa riduzione endplate AChR zona 20 </ Sup>.

Intensità relativa placca terminale fluorescenza Labeling

L'intensità relativa di etichettatura immunofluorescenza può rivelare variazioni nella densità di interesse proteina-di-sinaptica con l'età, il genotipo e / o lo stato di malattia. AChR fluorescenza (rosso-BGT o far-red-BGT) vengono inizialmente utilizzati per definire la posizione del NMJ. La luminosità della fluorescenza nell'area AChR ricchi 8 bit viene quindi utilizzata per valutare cambiamenti nella concentrazione della proteina di interesse, rispetto agli animali di controllo. Nelle sezioni trasversali dei AChRs endplate tipicamente appaiono come una forma di mezzaluna, ma questa forma è spesso irregolare (4A, C, E, H). Bassa intensità fluorescenza solito rivela se una patch di AChR colorazione rappresenta un singolo endplate, o due piastre laterali separati situati fibre muscolari adiacenti. Molte proteine ​​sinaptiche (come rapsyn, muschio e Src) sonocolocalized con AChR alla placca (Figura 4A - D). Immunofluorescenza con anticorpi fosfo-specifici può anche essere usato per confrontare l'effetto di interventi sperimentali sullo stato di fosforilazione di particolari proteine ​​di membrana postsinaptica 21.

L'affidabilità e la riproducibilità della misurazione dell'intensità di fluorescenza dipende pesantemente su l'integrità del muscolo congelato e la qualità della immunocolorazione. I muscoli devono essere sezionati e subito snap-congelati o paraformaldeide-fisso (a pochi minuti dalla morte dell'animale) per evitare alterazioni degenerative al NMJ. Immunostaining dipende fortemente dalla qualità dei reagenti e ottimizzare il protocollo di colorazione per anticorpi specifici. Per ogni nuovo lotto di anticorpi primario esperimenti pilota di immunoistochimica sono necessari. Criosezioni Appena tagliato di giovani sani muscoli vengono incubate con diluizioni seriali 2-fold dell'anticorpo primario. Lanoto anticorpo secondario affidabile viene utilizzata ed i risultati vengono confrontati. Se la proteina di interesse è noto per essere limitato al NMJ poi la migliore concentrazione di anticorpi è quella che produce il più alto rapporto di intensità di fluorescenza NMJ rispetto a quella presente nelle parti extrasinaptica del muscolo (fluorescenza di fondo). Extrasinaptica (presumibilmente non specifico) intensità della fluorescenza non deve superare il 15% dell'intensità endplate fluorescenza. Allo stesso modo 'nessun controllo primario di anticorpi' sezioni (incubate solo con anticorpo secondario) dovrebbe apparire scuro, a conferma che l'anticorpo secondario non legano non specifico. La qualità dei diversi lotti di anticorpi secondari (policlonali) possono variare lotti di anticorpi secondari marcatamente così alternativi dovrebbe essere confrontato prima di stabilire un protocollo standard. Il test ideale per la specificità di immunofluorescenza implica un confronto diretto di sezioni di topi wild-type e le sezioni negativi di controllo da topi tcappello manca la (gene knockout) proteina-di-interessi. I seguenti riferimenti descrivono quantificazione di endplate fluorescenza colorazione per MuSK, rapsyn, distroglicano, src e AChR 13,14,18,21.

Piccole dimensioni del campione introducono errore in stime di intensità di fluorescenza relativa. Placche individuali variano notevolmente di intensità di fluorescenza. Presumibilmente questa variabilità fra piastre laterali in un determinato muscolo riflette la diversità delle NMJ struttura e possibilità differenze nella sezione ottica campionato. Tuttavia, aumentando il numero di placche campione risultati in una stima più stabile dell'intensità di fluorescenza media (Figura 7). Per stimare l'intensità media di fluorescenza endplate 40-60 placche di ogni campione muscolo devono essere mediate.

AChR-AChR FRET

Ogni AChR è un pentamero con due siti di legame per BGT (situati uno su ogni subunità alfa). Il legame dired-BGT e far-rosso-BGT a questi due luoghi darebbe una separazione donatore-accettore di circa 9nm 28-30. Così bassa efficienza FRET può essere rilevata anche prima AChRs assemblano in cluster 14. Tuttavia, l'efficienza di FRET a placche murini all'incirca raddoppiato dopo la nascita, coerente con l'incorporazione più efficiente degli AChR in un fitto reticolo 14 postsinaptico membrane. Utilizzando rosso-BGT e far-red-BGT come il donatore e accettore FRET (rispettivamente), le placche di 1-2 mesi i topi hanno prodotto rendimenti medi FRET che vanno 20-37% (Tabella 2). Efficienze tasto della o superiore al 20% sono pensati per rappresentare stretto imballaggio AChRs 14. Efficienza della placca terminale FRET è stata leggermente ridotta dopo denervazione 14, e notevolmente ridotto dopo i topi sono stati iniettati con IgG da miastenia anti-MuSK-positivi gravis pazienti 18. Queste sono le condizioni in cui i singoli AChRs sono meno fitto in postsyMembrana naptic scaffold dal sistema MuSK / rapsyn postsynaptic 31.

Figura 1
Figura 1. Incorporare e muscoli congelamento per criosezionamento (1-5) Preparare stampi ('barche') prima del congelamento di una serie di muscoli:. (1) di alluminio viene tagliato in rettangoli (2,0 x 3,0 centimetri) e (2). Piegato come incriminato per creare uno stampo / barca (3). (4) I rettangoli di carta immunoblotting nitrocellulosa sono tagliati per adattarsi nello stampo e una penna a sfera è usato per governare linee per orientare il muscolo. (5) Il rettangolo nitrocellulosa viene posizionato nello stampo. (6-8) Incorporare e congela i muscoli: (6) criostato fluido matrice incorporamento viene delicatamente colato nello stampo (in cima alla nitrocellulosa) ad una profondità di 2 mm. (7) pinza sottile sono usati per abbassare il muscolo, dal suo tendine nella matrice incorporamento, in allineamento con l'nitrocelluperdere sentenze, (8) a matrice embedding supplementare è delicatamente colato nello stampo per coprire il muscolo, avendo cura di evitare la creazione di bolle. Il muscolo incorporato viene poi congelato a scatto, sigillato in tubi e conservati a -80 ° C, come descritto nel testo. (9-12) Preparazione criosezionamento: (9) pinza sottile sono utilizzati per staccarsi lo stampo in alluminio e il blocco congelato sia stato riposto nella -20 ° C camera criostato, (10) Le marcature della nitrocellulosa vengono utilizzati per allineare il muscolo parallela alla faccia del mandrino (11) di sezionamento longitudinale (12). Una goccia di medie cryo incorporamento liquida è utilizzato per fissare il blocco al mandrino raffreddato. Pinze Blunt sono utilizzati per manipolare il blocco muscolare congelato. Per ottenere sezioni trasversali, il blocco viene invece montato in modo che il muscolo è perpendicolare alla superficie del mandrino (non mostrato).

Figura 2
FIGURA 2. En visi di NMJs dal muscolo tibiale anteriore di 2 mesi di età topi C57Bl6J femminili. Il muscolo fresca era scatto congelato e sezioni fissate sul vetrino come descritto al punto 3.2. Immagini di proiezione massima intensità di z-stacks sono stati ottenuti come descritto nel primo protocollo. (A) rosso-BGT colorazione rivela un'unica placca motore composto da due serie di AChR-ricchi grondaie postjunctional primari (it faccia vista). (B) Synaptophysin colorazione con anticorpo secondario FITC-coniugato rivela il terminale nervoso presinaptico, occupando le grondaie sinaptiche primarie. Una parte del assone pre-terminale è anche visibile nella parte superiore del pannello. (C & D) Un esempio di immagine scadente NMJ qualità da un giovane topo sano. La colorazione è debole ed i confini delle specializzazioni pre e post-sinaptici sono sfocate. Questo è stato attribuito a carenze in tegli lavorazione del tessuto e / o il tempo insufficiente consentito per l'incubazione anticorpo primario. Bar Scala in pannello D rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Passi nel trattamento di en face immagini NMJ (come indicato nel protocollo 1). (A & B) originali immagini tono MIP continue mostrano fluorescenza rossa-BGT rivelando AChR e immunofluorescenza verde per synaptophysin rispettivamente. (C) AChR colorazione dopo la conversione di un'immagine in scala di grigi a 8 bit e l'uso dello strumento del poligono di delineare la placca (linea gialla sottile). (D) della placca terminale linea di confine riportato all'immagine synaptophysin verde. (E) Applicazione di un comando soglia minima di intensità per creare un'immagine binaria che isola suprathreshold rosso-BGT (AChR) fluorescenza. La sequenza di ImageJ screenshot dell'interfaccia utente viene visualizzato a sinistra delle immagini. (F) immagine synaptophysin binario dopo l'applicazione di una soglia separata. (G) Identificazione di suprathreshold discreto AChR-ricchi domini all'interno della placca dalla applicazione del comando Analizza particelle all'immagine rosso-BGT binario. Il corrispondente ImageJ (a sinistra del pannello (G) mostra i dati di input richiesti. La dimensione minima delle aree di pixel suprathreshold richieste devono essere inseriti. (H) Identificazione delle regioni di sovrapposizione della sinaptofisina binario e immagini AChR. Overlap è rappresentato da pixel bianchi . ImageJ screenshot dell'interfaccia utente (sotto pannello H) mostrano i passi per arrivare l'immagine sovrapposizione binaria. I valori di soglia minima intensità scelti per ciascuna di fluorescenza channel deve essere inserito all'interno finestra 'Colocalizzazione'. Bar Scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Esempi di sezioni trasversali ottici utilizzati per confrontare intensità di fluorescenza relativa (protocollo 2). Il muscolo è stato congelato a scatto e le sezioni fisse sul vetrino come descritto al punto 3.2. (A e B) Una singola endplate doppio etichettati con lontano -Red-BGT (AChR, mostrata qui in blu pseudocolore) e FITC-anti-rapsyn illustra la co-localizzazione di queste due proteine ​​che interagiscono nella membrana postsinaptica (C & D) Due piastre laterali su fibre muscolari adiacenti visualizzazione co-localizzata AC. hR e muschio. (E & F) Un endplate doppio marcato per AChR e -dystroglycan (-DG). Il -DG estende proprio lungo il perimetro fibra muscolare, ma è arricchito al endplate (barra della scala in F, per pannelli AF: 25 micron) (G - I) Isolare una placca per la misurazione dell'intensità (G) Un campo tipico microscopio,.. contenente tre piastre laterali far-red-BGT-macchiati (bar scala in Pannello G: 40 micron (H) Un'immagine ingrandita del endplate boxed (I) La stessa placca convertito in un'immagine in scala di grigi a 8 bit e delinea con il poligono.. . Strumento di ImageJ (sottile linea gialla) Intensità media di fluorescenza è misurata all'interno di questa linea di confine. (barra di scala per H & I: 10 micron) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

ONTENUTO "fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 5
Figura 5. Influenza della qualità di immagine nella valutazione zona sinaptica. (A & B) di alta qualità en immagini di volti di una NMJ sano da 2 mesi del mouse visto sul rosso-BGT e canali di fluorescenza anti-sinaptofisina. (A '& B ') intensità fluorescenza Profili di corrispondente alla linea tracciata attraverso la placca per A e B, rispettivamente. La linea rossa tratteggiata orizzontale indica la soglia minimo utilizzato per creare l'immagine binaria. (C & D) della placca terminale da un mouse anziani. Placca terminale sinaptofisina colorazione generalmente è meno intenso. (C '& D') profili di intensità mostrano un alto livello di extrasinaptica (baseline) fluorescenza fluttuazione del synaptophysin (CIC) canale (indietroterra) che colpisce la determinazione di una soglia adeguata. Molto di questo è ad ampio spettro autofluorescenza dei tessuti. Barre di scala rappresentano il 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. La variabilità delle zone sinaptiche tra NMJs all'interno di un muscolo e tra i topi. (A) a dispersione mostrano la AChR-ricchi superficie totale endplates dal muscolo tibiale anteriore di sette ingenui 2 mesi di età femminile C57BL / 6J ottenuti per autore NT. Ogni simbolo rappresenta una placca. Ogni barra rappresenta la media ± SD per placche campionati da un mouse. (B) a dispersione mostra la zona ricca di sinaptofisina per le stesse placche terminali. (A ') (B ') la distribuzione di frequenza per l'area ricca di sinaptofisina di placche (dati aggregati). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 7
Figura 7. Effetto della dimensione del campione su stime di intensità di fluorescenza endplate. Sezioni trasversali ottiche sono stati utilizzati per misurare l'intensità di fluorescenza (in unità arbitrarie) a 40 60 endplates dal muscolo tibiale anteriore di una sana 2 mesi mouse. Medie cumulativi sono tracciati rispetto al numero di placche inclusi nella media. (A) della placca terminale rosso-BGT fluorescenza ottenuta dall'autore AV. (B) Anti-synaptophysin intensità immunofluorescenza per le stesse placche terminali come in pannello A. intensità (C) della placca terminale lontano-rosso-BGT fluorescenza ottenuto da un secondo campione di muscolo per autore NG. (D) Anti-rapsyn intensità immunofluorescenza dalle stesse piastre laterali come nel pannello C.

Studio Muscolo numero di topi Zona AChR Zona sinaptofisina Zona di sovrapposizione
media ± SD (μm2) media ± SD (μm2) media ± SD (μm2)
Morsch et al. (2012) 1 gastrocnemio 3 181 ± 7 163 ± 24
diaframma 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch et al. (2013) 1 tibiale anteriore 3 166 ± 26 117 ± 21 nd
Cheng et al. (2013) 2 tibiale anteriore 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
Tse (inedito) 2 tibiale anteriore 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
1 ripreso su un microscopio Meta Zeiss LSM 510 ma con guadagno fisso e compensare i livelli. Thresholding e aree sinaptiche misurazioni utilizzati Metamorph software da MM.
2 ripreso su un microscopio Leica DM IRE2 e analizzati seguendo il protocollo attuale dal primo autore indicato, cieco per gruppo di trattamento.
ND: non determinato.

Tabella 1. zone sinaptiche per NMJs di 2 mesi di età femminile C57BL / 6J (controlli sani)

Studio Muscolo FRET efficienza (%) * Range (%)
(Media ± SEM)
Brockhausen et al. (2008) tibiale anteriore 24 ± 1 n / a
Cole et al. 2010 tibiale anteriore 26 ± 1 22 - 30
Morsch (inedito) diaframma 37 ± 1 24-47
Ghazanfari (inedito) tibiale anteriore 30 ± 1 20 - 45
* FRET tra il rosso-BGT e far-rosso-BGT (raggio Förster per FRET coppia = 51 bis (Life Technologies).
dati na non disponibile

Tabella 2. Efficienza per AChR FRET da giovani topi adulti C57Bl6J topi

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I protocolli descritti qui ci hanno permesso di misurare in modo affidabile e quantificare i cambiamenti nelle proprietà del NMJ tutta una serie di condizioni, tra cui l'invecchiamento e le malattie normali stati. I metodi descritti per en face immagini NMJ consentiranno ai ricercatori di confrontare l'area di specializzazioni pre- e post-sinaptici e la zona di sinaptica sovrapposizione / allineamento. Per confrontare l'intensità relativa di proteine ​​pre- e post-sinaptici il secondo protocollo, che utilizza sezioni ottiche trasversali, è preferito. Il terzo protocollo test specifico per cambiamenti nella vicinanza di imballaggio AChR nella membrana postsinaptica.

Specificità controlli sono vitali in immunofluorescenza. Quando si utilizza alcun anticorpo primario per immunofluorescenza indiretta è necessario garantire in primo luogo che si lega specificamente alla sua proteina bersaglio in sezioni muscolari. Diversi tipi di lavorazione dei tessuti e la fissazione può differenziale alterare la specificitàanticorpi. È importante confermare che colorazione immunofluorescenza (per esempio rapsyn) realmente è concentrata con recettore al endplate motore. Sezioni di controllo negativo devono essere controllati per assicurare che il legame anticorpo è specifico. Per esempio, il miglior controllo negativo per rapsyn immunofluorescenza sarebbe sezioni da rapsyn - / - mice. Questi dovrebbero mostrare alcuna colorazione placca anti-rapsyn. La fluorescenza non specifica può derivare anche da sostanze chimiche fluorescenti endogeni nel tessuto (autofluorescenza) o dal legame non specifico dal fluorescente coniugato anticorpo secondario. Tale fluorescenza è spesso aggravata dalla fissazione di aldeide. Inoltre, TRITC-BGT colorazione di placche a volte può essere rilevato nel canale di fluorescenza FITC e questo fluorescenti sanguinare-through potrebbe essere confusa con specifico immunofluorescenza FITC. Per difendersi da queste ultime tre forme di fluorescenza non specifica, ogni lotto di diapositive che sono macchiato dovrebbe includere un po 'nsezioni di controllo degli anticorpi o-primario "(passi 3.7 e 4.6). Immagini di placche di queste sezioni di controllo devono essere confrontati con quelli dalle diapositive sperimentali al fine di garantire che la colorazione immunofluorescenza indiretta di NMJs rispecchia veramente il legame dell'anticorpo primario.

Trasversale sezioni confocali sono particolarmente utili per valutare le differenze nell'intensità relativa della immunocolorazione alla sinapsi. Nelle sezioni trasversali confocale è più facile giudicare preciso co-localizzazione delle proteine ​​sinaptiche. Il profilo placca a forma di mezzaluna rappresenta solo un esempio cut-through la NMJ in questione. Tuttavia, lo sfondo (extrasinaptica) fluorescenza è generalmente inferiore rispetto a en images z-proiezione faccia. Quindi, può essere più facile discriminare 'reale' (specifico) immunocolorazione e stabilire guadagno confocale fisso e valori di offset utilizzando trasversali sezioni ottiche 13-15,18. Ad esempio, in un modello murino di miastenia grave (where endplate AChR colorazione è notevolmente ridotta) placche erano chiaramente delineati in trasversali sezioni ottiche 18,21. Le differenze di intensità media di fluorescenza a NMJ probabilmente riflettere densità alterata della proteina bersaglio all'interno della specializzazione sinaptica. Un avvertimento è che, in alcune situazioni, un cambiamento strutturale della proteina bersaglio o l'occlusione del legame da proteine ​​confinanti anticorpo potrebbe spiegare l'intensità di colorazione alterata.

La progettazione di esperimenti richiede qualche considerazione. In molti casi l'esperimento avrebbe lo scopo di testare l'impatto di un transgene, knockdown gene o stato di malattia delle dimensioni del NMJ. Il campione sperimentale potrebbe quindi essere paragonato al giovane sana (wild-type) topi dello stesso sesso e background genetico. I valori basali per l'area di endplate sinaptofisina, AChR e sovrapposizione sinaptica per diversi muscoli sono riportati nella tabella 1. La dimensione del campione dipenderà dal grado di animalivariazione -a-animale all'interno di gruppi di trattamento e la dimensione dell'effetto (differenza di mezzi per la sperimentale contro gruppi di controllo per la deviazione standard). Quando l'analisi è limitata a immagini di buona qualità è stato trovato un buon grado di coerenza significa che il campione per aree endplate tra 2 mesi topi C57Bl6J femmine sani (Figura 6A e B). Così, è stato possibile dimostrare significative riduzioni 30-40% nella zona sinaptica in topi iniettati con IgG da miastenia anti-MuSK-positive gravis pazienti, rispetto ai controlli con un campione di tre topi 17,20,32. Topi anziani visualizzati maggiore variazione da animale a animale parametri endplate di giovani topi 22. Di conseguenza, gli esperimenti che coinvolgono età topi potrebbero richiedere campioni di dimensioni più grandi.

Se la preoccupazione principale è quella di misurare le dimensioni del volto endplate en poi il guadagno e impostazioni del livello di offset deve essere ottimizzato per ogni individuo NMJ. IndivNMJs idual possono variare notevolmente nella luminosità di AChR e sinaptofisina colorazione, in particolare quando si esaminano stati di malattia. Inoltre l'intensità di extra-sinaptica (non specifico) fluorescenza è spesso più elevato e più variabile nei muscoli degli animali invecchiamento, rispetto a quelle di animali giovani sani (Figura 5C e D). La 1 a 256 in scala di grigi dovrebbe essere pienamente sfruttato in modo da massimizzare le informazioni tonali che sarà trattenuta nelle immagini finali. Ciò comporterà regolando il guadagno e offset livelli per ogni NMJ per cui un z-stack è da raccogliere. Figura 5D mostra un esempio di un'immagine NMJ dove informazioni tonali potrebbe essere critico nel definire i confini della zona di pre e post- specializzazioni sinaptici.

Misurazioni di aree sinaptiche possono essere applicati a diverse preparazioni muscolari ed esperimenti. La maggior parte delle nostre misure di zone sinaptiche hanno impiegato criosezioni longitudinali di scatto muscoli congelati. Congelamento muscolo prima del fissaggio mantiene l'antigenicità di una vasta gamma di proteine. Quando compatibili con l'antigene, paraformaldeide fissaggio e infiltrazione saccarosio prima criosezionamento (passo 2.1) può fornire una migliore conservazione della struttura NMJ. Conservazione strutturale ottimale può essere ottenuta tramite perfusione cardiaca con paraformaldeide. Artefatti di congelamento e di sezionamento possono essere completamente evitati endplates etichettatura sulla superficie del muscolo e di imaging NMJs intatte in fascetti presi in giro dal muscolo fissa 21. Indipendentemente dalla preparazione, le procedure di campionamento, imaging e zona quantificazione rimangono invariati (protocollo passaggi 4-5). Applicazione uniforme dei protocolli di campionamento, di imaging e di analisi non vedenti (con diversi operatori, diversi campioni di topi e tempi diversi), può portare a valori medi abbastanza riproducibili (confrontare Cheng et al. E Tse risultati nella tabella 1).

"> Placche sono stati descritti come diventare 'frammentato' in una varietà di stati patologici. Ad esempio, nell'invecchiamento muscoli mouse, sporadica degenerazione di una fibra muscolare (seguita da sua rigenerazione) portato rimodellamento del pretzel-come endplate AChR placca formare più piccolo cluster AChR 6. Nei topi iniettati con IgG da anti-MuSK miastenia gravis pazienti, frammentazione della placca era piuttosto diverso. La placca AChR pretzel in gran parte dispersa, lasciando dietro di sé una costellazione di piccole (<4 m 2) microaggregati AChR ' '20,21. Questi due esempi evidenziano la necessità di confrontare le distribuzioni di dimensione per i cluster AChR a placche di controllo contro animali da esperimento 21.

Altri metodi sono stati segnalati per la valutazione dell'area synaptic o macchie intensità al NMJ. Placche motrici possono a volte essere piegati in modo che le immagini z-proiezione bidimensionale utilizzati qui potrebbero sottovalutare synaree aptiche. Ricostruzioni confocale tridimensionali potrebbero fornire misure più accurate se zona sinaptica assoluta deve essere definito 33. Uno dei principali vantaggi del protocollo z-proiezione qui descritto, tuttavia, è la sua relativa semplicità, che ha consentito un gran numero di placche da misurare da più gruppi di trattamento e sicura identificazione di potenziali variazioni. Il protocollo per la comparazione intensità di colorazione endplate può essere adattato per studiare variazioni nei livelli di molte proteine ​​sinaptiche differenti. Il metodo è limitata, tuttavia, l'esigenza che tutti i campioni siano trattati per immunofluorescenza poi ripreso durante la stessa sessione confocale. Un recente studio condotto da Yampolsky et al. 5 descrive un metodo per misurare endplate AChR densità che potrebbe aiutare a superare questa limitazione. In questo studio, gli stessi campi di piastre laterali sono stati ripresi in diverse impostazioni di potenza laser diversi. La pendenza del rapporto tra potenza del laser e rhodamine-BGT intensità di fluorescenza è stato utilizzato per valutare relativi cambiamenti di densità AChR a piastre laterali in diversi topi 5. Questo metodo può essere utile per confrontare l'intensità AChR in campioni impressi in tempi diversi nel corso di uno studio prolungato.

AChR-AChR FRET fornisce informazioni specifiche e complementari sull'organizzazione del AChRs endplate. Electron autoradiografia microscopio con 125. I-α-BGT ha dimostrato AChRs da imballare saldamente con una densità di 10 planare 4 m -2 immediatamente sotto ogni sito presinaptica del rilascio del trasmettitore, mentre adiacenti ripiegamenti membrane contengono molto più basse densità di AChR 34. AChR-AChR FRET rende relativamente facile per rilevare (sub-microscopiche) cambiamenti nelle AChR imballaggio. Una riduzione di efficienza FRET riflette una ridistribuzione sub-microscopica degli AChR nella membrana postsinaptica che potrebbero non essere rilevati dai cambiamenti di intensità media di fluorescenza BGT. Multipla fattori potrebbero causare un cambiamento della efficienza della FRET. Questi includono la spaziatura donatore-accettore e relativi orientamenti, nonché l'ambiente molecolare 35,36. Una riduzione dell'efficienza endplate FRET potrebbe eventualmente derivare da un cambiamento nella geometria del reticolo recettore. Tuttavia, probabilmente sarebbe causa di una riduzione della percentuale di AChRs che vengono confezionati in nanoscala reticolo molecolare postsinaptico 14.

Perdita della connessione tra motoneuroni e fibre muscolari sembra essere la causa immediata della debolezza muscolare in malattia dei motoneuroni e nell'invecchiamento sedentaria 9,22,23. Metodi condivisi e parametri per NMJs misura dovrebbe rendere più facile per i diversi gruppi di ricerca per confrontare e risultati di contrasto pubblicato. La condivisione di protocolli dettagliati (e futuri miglioramenti su di loro) può contribuire ad accelerare il progresso nella comprensione dei meccanismi di manutenzione NMJ e come può essere influenzata in stati di malattia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter