The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
A junção neuromuscular (JNM) é o grande, sinapse relé colinérgicos através do qual os neurônios motores mamíferos controlar a contração muscular voluntária. As mudanças estruturais na JNM pode resultar em falha da neurotransmissão, resultando em fraqueza, atrofia e até mesmo a morte da fibra muscular. Muitos estudos têm investigado como modificações genéticas ou doença pode alterar a estrutura do JNM rato. Infelizmente, pode ser difícil comparar os resultados directamente a partir destes estudos, uma vez que eles frequentemente utilizados diferentes parâmetros e métodos analíticos. Três protocolos estão descritos aqui. O primeiro utiliza projecção de intensidade máxima imagens confocais para medir a área de receptor de acetilcolina (AChR) da membrana pós-sinápticos domínios ricos em na placa terminal e a área de coloração das vesículas sinápticas no terminal do nervo pré-sináptico sobrejacente. O segundo protocolo compara as intensidades relativas de imunocoloração para proteínas sinápticas na membrana pós-sináptica. O terceiro protocol usa Transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para detectar alterações na embalagem de AChRs pós-sinápticos na placa motora. Os protocolos foram desenvolvidos e aperfeiçoados ao longo de uma série de estudos. Fatores que influenciam a qualidade e consistência dos resultados são discutidos e dados normativos são fornecidos para NMJs em ratos adultos jovens e saudáveis.
A junção neuromuscular (JNM) é a sinapse relé crítico que medeia a comunicação entre o sistema nervoso e no músculo esquelético. Ela é necessária para todo o movimento voluntário. A microscopia de fluorescência tem sido utilizada para estudar os efeitos de transgenes no rato JNM 1-3 ou para comparar os efeitos da idade, dieta, exercício e doença agravada por NMJs roedor 4-11. Tais estudos têm nos ensinado muito sobre a fisiologia e fisiopatologia da JNM, mas os diversos parâmetros relatados (por exemplo, a área AChR, área de placa motora, comprimento perímetro, os índices de fragmentação), muitas vezes tornam difícil comparar os resultados desses estudos. Existe a expectativa de aumentar para os investigadores pré-clínicos para ser capaz de demonstrar a reprodutibilidade, particularmente em estudos com modelos de roedores de doença 12. Os protocolos descritos aqui foram refinados através de uma série de estudos que investigaram ch desenvolvimento, fisiológico e fisiopatológicoanges ao JNM. Tais estudos exigem medição da área de especializações sinápticas na placa motora do mouse, a densidade relativa de embalagem de proteínas sinápticas dentro especializações pós-sinápticos 13-15.
A utilidade destes métodos é ilustrada por estudos recentes em um modelo de rato anti-almíscares miastenia gravis. Injeções diárias de IgG de miastenia anti-Musk-positivo gravis pacientes em camundongos adultos fez com que eles se tornam fracos dentro de 2 semanas 16. Imagens de projecção máxima das secções confocais musculares que foram duplamente marcadas para a sinaptofisina (a-terminais nervosas) e pós-sinápticos AChRs revelou um declínio progressivo na área de coloração AChR como a principal alteração. É importante salientar a taxa de declínio foi suficiente para explicar declínios comparáveis na amplitude dos potenciais sinápticos, falha da transmissão sináptica e fraqueza muscular 17,18. Qualitativamente achados semelhantes foram relatados por outros grupos de pesquisa10,19. Os mesmos métodos de medição JNM já foram utilizadas para avaliar o impacto de três fármacos para o tratamento anti-almíscares miastenia gravis neste modelo de ratinho 20,21.
Envelhecimento sedentário pode levar à perda de conexões neuromusculares. Os protocolos descritos aqui revelaram um declínio associado à idade na área do terminal nervoso synaptophysin em placas motoras como ratos progredir na velhice. Os mesmos métodos revelou que o exercício voluntário poderia, em grande parte impedir a redução da área terminal do nervo pré-sináptico 22, de acordo com o trabalho anterior por outros grupos de quatro. Perda de conexões neuromusculares também ocorre no modelo de rato SOD1G93A esclerose lateral amiotrófica 9,23.
Os estudos citados demonstram que uma variedade de condições de saúde pode levar a reduções na área de uma das especializações pré ou pós-sinápticos no NMJ. Isso pode resultar em diversão sináptica prejudicadacção ou podem anunciar perda completa da ligação neuromuscular. Três protocolos estão descritos que permitem a quantificação da área e densidade de especializações sinápticos. O objectivo do primeiro protocolo é o de proporcionar uma medida prática e reprodutível das áreas de pré- e pós-sinápticos especializações e o seu alinhamento em NMJs de mamífero, utilizando microscopia de fluorescência. Bidimensionais imagens máximos projeção confocal e análise de imagem com NIH ImageJ é usado para detectar mudanças na área de coloração synaptophysin (vesículas sinápticas), AChRs pós-sinápticos e área de sobreposição sináptica. Parâmetros confocal de imagem (ganho e nível de deslocamento) são optimizados para cada NMJ de modo a maximizar a informação visual usado para discernir a área de especialização sináptica. Falha neuromuscular também pode resultar de alterações na densidade do RACh pós-sináptico e / ou outras proteínas sinápticas. O segundo protocolo pode ser aplicado para detectar alterações na densidade relativa de proteínas pós-sinápticos taiscomo almíscares, rapsyn, distroglicana, fosforilado Src quinase e fosforilado AChR 18,21.
Em pacientes com miastenia gravis, uma densidade reduzida de AChR dentro da membrana pós-sináptica é a causa imediata da falha sináptica e fraqueza muscular. O terceiro protocolo descreve um método de transferência de Fluorescência de Ressonância Energia (FRET) para avaliar mudanças na proximidade do AChRs adjacentes dentro das membranas pós-sinápticos 14,15. Este método detecta transferência de energia entre AChRs vizinhos marcados com fluorescência-α-bungarotoxina (BGT). FRET ocorre apenas quando os doadores e aceitadores de sondas fluorescentes estão a menos de 10 nm de intervalo. Isso pode revelar alterações submicroscópicas () no aperto de embalagem AChR que podem se relacionam diretamente com a amplitude dos potenciais sinápticos.
Estes três protocolos, refinados ao longo da última década, fornecer medidas complementares a integridade NMJ de uma forma consistente e reproduzível. A utilização de protocolos padronizados dend parâmetros deve facilitar a comparação dos efeitos dos genes e intervenções ambientais sobre a JNM mamíferos.
Os protocolos descritos aqui nos permitiram medir de forma confiável e quantificar mudanças nas propriedades do NMJ através de uma série de condições, incluindo estados normais de envelhecimento e doenças. Os métodos descritos para en enfrentar imagens JNM vai permitir aos pesquisadores comparar a área de especializações pré e pós-sinápticos e da área de sináptica sobreposição / alinhamento. Para comparar a intensidade relativa de proteínas pré e pós-sinápticos O segundo protocolo, que usa cortes ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
Zeiss | LSM 510 Meta | ||
Leica | SPE-II | ||
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |