Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन

doi: 10.3791/52220 Published: December 26, 2014

Abstract

neuromuscular जंक्शन (NMJ) स्तनधारी मोटर न्यूरॉन्स स्वैच्छिक मांसपेशियों में संकुचन को नियंत्रित जिसके माध्यम से बड़े, कोलीनर्जिक रिले अन्तर्ग्रथन है। NMJ में संरचनात्मक परिवर्तन कमजोरी, शोष और मांसपेशियों के फाइबर की भी मौत में जिसके परिणामस्वरूप, neurotransmission विफलता में परिणाम कर सकते हैं। कई अध्ययनों से आनुवंशिक संशोधन या रोग माउस NMJ की संरचना बदल सकते हैं कि कैसे जांच की है। दुर्भाग्य से, यह सीधे वे अक्सर विभिन्न मापदंडों और विश्लेषणात्मक तरीकों कार्यरत क्योंकि इन अध्ययनों के निष्कर्षों से तुलना करने के लिए मुश्किल हो सकता है। तीन प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित हैं। पहले acetylcholine रिसेप्टर (ACHR) के क्षेत्र को मापने के लिए अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण confocal छवियों का उपयोग करता है endplate और overlying प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनल में synaptic पुटिका धुंधला के क्षेत्र में अमीर पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली डोमेन। दूसरा प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में synaptic प्रोटीन के लिए immunostaining के रिश्तेदार तीव्रता तुलना करती है। तीसरे जनसंपर्कotocol endplate पर पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs की पैकिंग में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल विकसित किया है और अध्ययन की एक श्रृंखला से अधिक परिष्कृत किया गया है। गुणवत्ता और परिणाम की स्थिरता को प्रभावित करने वाले कारकों पर विचार विमर्श कर रहे हैं और प्रामाणिक डेटा स्वस्थ युवा वयस्क चूहों में NMJs के लिए प्रदान की जाती हैं।

Introduction

neuromuscular जंक्शन (NMJ) तंत्रिका तंत्र और कंकाल की मांसपेशी के बीच संचार की मध्यस्थता करता है कि महत्वपूर्ण रिले अन्तर्ग्रथन है। यह सब स्वैच्छिक आंदोलन के लिए आवश्यक है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लंबे NMJ 1-3 माउस पर ट्रांसजीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए या कृंतक NMJs 4-11 पर उम्र, आहार, व्यायाम और रोग के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस तरह के अध्ययन NMJ के फिजियोलॉजी और pathophysiology के बारे में हमें ज्यादा सिखाया है, लेकिन विविध मानकों (जैसे, ACHR क्षेत्र, endplate क्षेत्र, परिधि की लंबाई, विखंडन सूचकांकों) अक्सर यह मुश्किल इन अध्ययनों के निष्कर्षों की तुलना करने के लिए बनाने की सूचना दी। पूर्व नैदानिक ​​शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से बीमारी 12 के कृंतक मॉडल के साथ पढ़ाई में, reproducibility के प्रदर्शित करने के लिए सक्षम होने के लिए एक बढ़ती हुई उम्मीद नहीं है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल, विकासात्मक शारीरिक और pathophysiological चर्चा की जांच की है कि अध्ययन की एक श्रृंखला के माध्यम से परिष्कृत किया गयाNMJ को anges। इस तरह के अध्ययन माउस मोटर endplate पर synaptic विशेषज्ञताओं का क्षेत्र और postsynaptic विशेषज्ञताओं 13-15 भीतर synaptic प्रोटीन की पैकिंग के सापेक्ष घनत्व की माप की आवश्यकता होती है।

इन तरीकों की उपयोगिता मियासथीनिया ग्रेविस विरोधी कस्तूरी की एक माउस मॉडल में हाल के अध्ययनों से यह साफ है। विरोधी कस्तूरी पॉजिटिव myasthenia से आईजीजी के दैनिक इंजेक्शन वयस्क चूहों में रोगियों के लिए उन्हें दो सप्ताह 16 के भीतर कमजोर बनने के लिए कारण कामला। पेशी (तंत्रिका-टर्मिनलों में) synaptophysin के लिए डबल लेबल रहे थे कि वर्गों और पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs के confocal अधिकतम प्रक्षेपण छवियों प्राथमिक परिवर्तन के रूप में ACHR धुंधला के क्षेत्र में एक प्रगतिशील गिरावट का पता चला। गिरावट की महत्वपूर्ण बात यह दर सिनेप्टिक क्षमता, synaptic प्रसारण और मांसपेशियों में कमजोरी 17,18 की विफलता के आयाम में तुलनीय गिरावट आती है समझाने के लिए पर्याप्त था। गुणात्मक इसी तरह के निष्कर्ष अन्य अनुसंधान समूहों द्वारा सूचित किया गया है10,19। एक ही NMJ माप तरीकों के बाद से इस माउस मॉडल 20,21 में कामला विरोधी कस्तूरी myasthenia के इलाज के लिए तीन दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

आसीन उम्र बढ़ने न्यूरोमस्कुलर कनेक्शनों की हानि हो सकती है। चूहों बुढ़ापे में प्रगति के रूप में यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मोटर endplates में तंत्रिका टर्मिनल synaptophysin के क्षेत्र में एक उम्र जुड़े गिरावट से पता चला है। एक ही तरीके का स्वैच्छिक व्यायाम काफी हद तक अन्य समूहों 4 द्वारा पिछले काम के साथ संगत प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनल क्षेत्र 22 में कमी, रोकने सकता है कि पता चला। न्यूरोमस्कुलर कनेक्शनों की हानि भी amyotrophic पार्श्व काठिन्य 9,23 के SOD1G93A माउस मॉडल में होता है।

जैसा कि ऊपर उल्लेख पढ़ाई स्वास्थ्य की स्थिति की एक किस्म NMJ पर पूर्व या बाद synaptic विशेषज्ञताओं या तो के क्षेत्र में कटौती करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि प्रदर्शित करता है। इस बिगड़ा अन्तर्ग्रथनी मज़ा में हो सकता हैction के न्यूरोमस्कुलर कनेक्शन का पूरा नुकसान का सूत्रपात हो सकता है या। तीन प्रोटोकॉल क्षेत्र और synaptic विशेषज्ञताओं के घनत्व के quantitation की अनुमति है कि वर्णित हैं। पहले प्रोटोकॉल का उद्देश्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग, पूर्व और बाद synaptic विशेषज्ञताओं और स्तनधारी NMJs पर अपने संरेखण के क्षेत्रों में से एक व्यावहारिक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपाय प्रदान करना है। दो आयामी अधिकतम प्रक्षेपण confocal छवियों और एनआईएच ImageJ के साथ छवि विश्लेषण synaptophysin धुंधला (synaptic vesicles), पोस्टअन्तर्ग्रथनी AChRs और synaptic ओवरलैप क्षेत्र के क्षेत्र में परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। अन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता के क्षेत्र विचार करने के लिए प्रयोग किया जाता है दृश्य सूचना को अधिकतम करने के लिए इतनी के रूप में confocal इमेजिंग मानकों (लाभ और स्तर ऑफसेट) प्रत्येक NMJ के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। Neuromuscular विफलता भी पोस्टअन्तर्ग्रथनी ACHR और / या अन्य अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन के घनत्व में परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं। दूसरा प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रोटीन इस तरह के सापेक्ष घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए आवेदन किया जा सकता हैकस्तूरी, rapsyn, dystroglycan, phosphorylated एसआरसी kinase और phosphorylated ACHR 18,21 के रूप में।

मियासथीनिया ग्रेविस में, पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली के भीतर ACHR का एक कम घनत्व अन्तर्ग्रथनी विफलता और मांसपेशियों में कमजोरी का तात्कालिक कारण है। तीसरे प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली 14,15 भीतर आसन्न AChRs की निकटता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) विधि का वर्णन है। इस विधि फ्लोरोसेंट-α-bungarotoxin (BGT) के साथ लेबल पड़ोसी AChRs के बीच ऊर्जा हस्तांतरण का पता लगाता है। फ्लोरोसेंट दाता और स्वीकर्ता जांच कम से कम 10 एनएम के अलावा हैं जब झल्लाहट ही होता है। यह सीधे सिनेप्टिक क्षमता के आयाम से संबंधित हो सकता है कि ACHR पैकिंग की जकड़न में (submicroscopic) परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं।

पिछले एक दशक से अधिक परिष्कृत ये तीन प्रोटोकॉल, एक सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ते में NMJ अखंडता के पूरक के उपाय प्रदान करते हैं। मानकीकृत प्रोटोकॉल एक का प्रयोग करेंएन डी मापदंडों स्तनधारी NMJ पर जीन और पर्यावरण के हस्तक्षेप के प्रभाव की तुलना की सुविधा होनी चाहिए।

Protocol

नोट: पशु प्रयोगों के डिजाइन, आचरण और रिपोर्टिंग मौजूदा दिशा-निर्देशों 24 के खाते में रखना चाहिए। इस तरह के काम (हमारे मामले सिडनी विश्वविद्यालय के पशु आचार समिति में) स्थानीय पशु कल्याण प्राधिकारी द्वारा अग्रिम में अनुमोदित किया जाना चाहिए।

पशु और स्नायु विच्छेदन के 1. इच्छामृत्यु

  1. यह शिमिजु 25 द्वारा विस्तृत माउस हैंडलिंग पद्धति का उपयोग pentobarbitone समाधान की intraperitoneal इंजेक्शन (30 मिग्रा / किग्रा) के साथ euthanized है जहां एक अलग कमरे को पकड़े हुए कमरे से माउस स्थानांतरण। अपने पिंजरे में वापस माउस रखें।
  2. माउस की सांस लेने और अधिक से अधिक एक मिनट के लिए बंद कर दिया गया है, धीरे हल्के से कॉर्निया brushing द्वारा पैर, और corneal पलटा pinching द्वारा पैर-आहरण पलटा परीक्षण। पलटा प्रतिक्रियाओं अनुपस्थित रहे हैं केवल जब माउस विच्छेदन के लिए तैयार किया जा सकता है।
  3. Chiasson 26 के रूप में कृंतक शरीर रचना ऐसी की एक एटलस से परामर्श करें और / या एक अनुभव की मदद की तलाशब्याज की पेशी के विच्छेदन प्रयास करने से पहले CED शरीर-रचना। प्रत्येक मामले में पेशी को बेनकाब करने के लिए त्वचा को खोलने से पहले एक छोटी इलेक्ट्रिक शेवर का उपयोग कर overlying त्वचा से बालों को हटा दें।
    नोट: विच्छेदन प्रत्येक anatomically-अलग पेशी के लिए अलग होगा।
  4. कुंद संदंश का प्रयोग झिल्ली overlying और आसपास के ऊतकों से पेशी मुक्त। समझ और अपनी प्रविष्टि से पेशी अलग करने के लिए बाहर का पट्टा काटा।
  5. धीरे तंग और सही वापस अपने मूल करने के लिए आसपास के ऊतकों से मुक्त पेशी धज्जी। संक्षेप में आगे की प्रक्रिया के लिए पहले 0.1 एम फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) समाधान या घंटी समाधान में नव विच्छेदित पेशी जगह है।

2. Cryosectioning के लिए मांसपेशियों की तैयारी

नोट: वैकल्पिक कदम 2.1 में वर्णित के रूप में पहले 27 में विस्तृत, या (छोटे मांसपेशियों के लिए) विसर्जन निर्धारण के रूप में इष्टतम संरचनात्मक संरक्षण पूरे पशु छिड़काव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि,4% paraformaldehyde के निर्धारण के कई एंटीबॉडी जांच के साथ और फ्लोरोसेंट-BGT के साथ बाद धुंधला ख़राब कर सकते हैं। Glutaraldehyde विशेष रूप से बचा जाना चाहिए। मांसपेशियों वे तुरंत जमे हुए तस्वीर होना चाहिए तय होने के लिए नहीं कर रहे हैं (2.3 करने के लिए आगे बढ़ना)।

  1. वैकल्पिक विसर्जन निर्धारण: पिन विश्राम लंबाई में एक पेट्री डिश में मोम के लिए मांसपेशियों। 2% आरटी पर 2 घंटे के लिए (हौसले पीबीएस में भंग) / वी paraformaldehyde के w के साथ मांसपेशियों को कवर किया। फिर पीबीएस में 30% w / वी sucrose के साथ पीबीएस की जगह है और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते 30 मिनट (3 एक्स 10 मिनट) पर पीबीएस के तीन परिवर्तन के साथ इसे धो लें।
  2. चित्रा 1 में दिखाया गया है एल्यूमीनियम पन्नी के 2 सेमी x 1.5 सेमी टुकड़े तह द्वारा अग्रिम में नए नए साँचे ('नौकाओं') बनाओ नाव के तल में nitrocellulose झिल्ली का एक टुकड़ा रखें। धीरे हवा के बुलबुले से बचने के लिए, देखभाल करने के 2 मिमी की गहराई तक नाव में cryostat embedding मैट्रिक्स (सामग्री तालिका) डालना। पर गेंद सूत्रीय कलम लाइनों के साथ यह aligning, नाव में पेशी रखेंnitrocellulose। पूरी तरह से मांसपेशियों (चित्रा 1) कवर करने के लिए इतनी के रूप में अधिक embedding मैट्रिक्स जोड़ें।
  3. एक अमिट मार्कर के साथ प्री-लेबल polypropylene ट्यूब। प्रत्येक ट्यूब में पानी की एक बूंद प्लेस और तरल नाइट्रोजन में ट्यूब चिल।
    नोट: जमे हुए पानी की बूंद वाष्प दबाव बनाए रखता है और लंबे समय तक -80 डिग्री सेल्सियस भंडारण के दौरान सुखाना रोकता
  4. एक चेहरा ढाल, मोटी सुरक्षात्मक दस्ताने और कुंद संदंश की एक बड़ी जोड़ी का उपयोग, आंशिक रूप से 30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन का एक कंटेनर में isopentane के 2 सेमी गहराई से युक्त एक छोटे से धातु बीकर (8 सेमी गहरी 3 सेमी व्यास,) कम है। बीकर निकालें और बेंच शीर्ष पर जगह है। कुंद संदंश के एक छोटे जोड़ी का उपयोग ढालना पेशी से युक्त और ठंडा isopentane में मैट्रिक्स embedding जगह है। Isopentane के साथ तरल नाइट्रोजन के मिश्रण से बचने के लिए ध्यान रखना।
  5. बाहर जमे हुए ब्लॉक उठा और सही जनसंपर्क में इसे सील करने कुंद संदंश का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से फ्रीज करने के लिए ब्लॉक के लिए दो मिनट की अनुमति देंई-लेबल और पूर्व ठंडा ट्यूब (2.3 कदम)।
  6. डिग्री सेल्सियस -80 के लिए स्थानांतरण करने से पहले तरल नाइट्रोजन में अस्थायी रूप से ट्यूब की दुकान। फ्रीजर सामग्री की एक स्प्रेडशीट में सभी नमूनों लॉग ऑन करें।

3. Cryosectioning और प्रतिदीप्ति धुंधला NMJs के एन फेस चित्र के लिए

  1. एल्यूमीनियम मोल्ड दूर छील। 20 माइक्रोन cryosections मांसपेशी फाइबर की लंबी अक्ष (चित्रा 1) के समानांतर कटौती करने के लिए इतनी के रूप में -20 डिग्री सेल्सियस cryostat कक्ष के भीतर cryostat चक करने के लिए जमे हुए ब्लॉक देते हैं। पाली एल Lysine या जिलेटिन लेपित खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों उठाओ।
  2. नोट: ऊतक ठंड करने से पहले तय हो गई है कि अगर यह कदम न आना। वर्गों स्लाइड पर सुखाने के लिए के लिए 30 मिनट की अनुमति के बाद, आरटी पर 15 मिनट के लिए प्रत्येक खंड पर पीबीएस में 2% paraformaldehyde की एक बूंद रखकर उन्हें ठीक।
  3. धो एक coplin जार में पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट स्लाइड, और 30 मिनट के अवशिष्ट एल्डिहाइड समूहों को ब्लॉक करने के लिए तो 0.1 एम ग्लाइसिन युक्त पीबीएस में स्लाइड्स विसर्जित कर दिया।
  4. सात मिनट के लिए (-20 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा) मेथनॉल में विसर्जित कर दिया तो, पीबीएस में 10 मिनट के लिए स्लाइड धो लें। इस permeabilization के कदम फ्लोरोसेंट-BGT के साथ डबल लेबलिंग और विरोधी synaptophysin का एक नियमित हिस्सा है, लेकिन यह प्रतिकूल कुछ अन्य प्रोटीन के लिए immunostaining प्रभावित कर सकता है।
  5. धो तो एक स्थिर और समतल humidified कक्ष में प्रत्येक स्लाइड जगह पीबीएस में 2 एक्स 10 मिनट स्लाइड। इसके तत्काल बाद अवरुद्ध समाधान के 20 μl के साथ प्रत्येक अनुभाग को कवर (0.2% ट्राइटन X-100, 2% गोजातीय सीरम albumin पीबीएस में (बीएसए)) आरटी पर 1 घंटे के लिए। धारा immunostaining के प्रक्रिया के किसी भी चरण में बाहर सुखाने के लिए अनुमति नहीं दी जानी चाहिए।
  6. प्राथमिक ऊष्मायन के लिए बाहर ले: एक समय में एक स्लाइड लेते हुए ध्यान से प्रत्येक अनुभाग भर से अतिरिक्त अवरुद्ध समाधान निकालने और खरगोश विरोधी synaptophysin के 20 μl के साथ बदलें (: 200 अवरुद्ध समाधान में एक पतला)।
  7. केवल अवरुद्ध समाधान के साथ incubated किया जाएगा कि एक नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड शामिल करें। इस 'नहीं-प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण'हर immunostaining समय में आवश्यक है।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी प्रत्येक खंड से अधिक जगह में रहता है, देखभाल करने के humidified कक्ष को बंद करने और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 दिनों के लिए सेते हैं।
  9. प्राथमिक एंटीबॉडी जगह में रहता है कि पुष्टि करने के लिए प्रत्येक अनुभाग का निरीक्षण किया। धीरे पीबीएस के साथ प्रत्येक स्लाइड कुल्ला और एक coplin जार में जगह के लिए एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग करें। सभी स्लाइड पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट धो लें।
  10. माध्यमिक ऊष्मायन के लिए बाहर ले। एक समय में एक स्लाइड ले रहा है, ध्यान से, अतिरिक्त पीबीएस हटाने के humidified कक्ष में रखना और FITC संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश आईजीजी और BGT rhodamine tetramethyl संयुग्मित या किसी अन्य लाल fluorophor युक्त एक मिश्रण के 20 μl के साथ प्रत्येक खंड (TRITC- कवर / redBGT, 5 ग्राम / एमएल) अवरुद्ध समाधान में पतला। 2 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
  11. धो coplin जार में पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट स्लाइड।
  12. एक समय में एक स्लाइड ले रहा है, ध्यान से अतिरिक्त पीबीएस निकालें और, glycero की एक न्यूनतम मात्रा का उपयोग करते हुए एक coverslip के साथ माउंटएल आधारित, फीका-विरोध मध्यम बढ़ते। स्पष्ट नेल वार्निश के साथ coverslips के किनारों को सील। यह मुश्किल सूखे की अनुमति दें।
  13. अब भंडारण अवधि (कई महीनों तक) के लिए एक सप्ताह के लिए, या -20 पर डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्लाइड्स स्टोर।

4. निष्पक्ष सैम्पलिंग और मोटर endplates के एन अंकित इमेजिंग

  1. (नहीं विश्लेषण में शामिल) एक दूसरे अनुसंधानकर्ता को ही मालूम रहता है कि एक यादृच्छिक कोड नंबर के साथ प्रत्येक स्लाइड लेबल करके स्लाइड अंधा। NMJ मापदंडों के quantitation सभी नमूनों के लिए पूरा हो गया है जब तक एक परिणाम के रूप में ऑपरेटर उपचार समूहों को अंधा बना हुआ है।
  2. खुर्दबीन मंच पर स्लाइड प्लेस और TRITC फिल्टर सेट (63X तेल 1.3 एनए उद्देश्य) के साथ विस्तृत क्षेत्र रोशनी के तहत यह देखने के लिए। सही करने के लिए और वापस एक endplate क्षेत्र (2A चित्रा) में प्रकट होता है जब तक छोड़ दिया (क्षेत्र द्वारा क्षेत्र) उत्तरोत्तर ले जाएँ।
    नोट: सैम्पलिंग कसौटी: अपेक्षाकृत है कि हर ACHR से सना हुआ संरचनाफ्लैट और उद्देश्य के चेहरे एक endplate माना जाता है और (ACHR धुंधला की crescents endplates के माध्यम से पार वर्गों का प्रतिनिधित्व करते हैं और इसलिए बाहर रखा गया है) के विश्लेषण के लिए imaged है (यानी, <जेड आयाम में 15 मीटर में फैली हुई है)।
  3. 1.0 हवादार इकाई और कम लेजर सत्ता में confocal पिनहोल सेट के साथ imaged किया जा रहा है कि endplate पर TRITC / लाल-BGT (532 एनएम लेजर) के लिए स्तरों के लाभ का अनुकूलन और ऑफसेट। अगला अनुकूलन FITC / 488 एनएम लेजर का उपयोग synaptophysin प्रतिदीप्ति। प्रत्येक ऑप्टिकल टुकड़ा के बीच एक 0.7 माइक्रोन अंतराल के साथ endplate की एक z ढेर लीजिए। इमेजिंग सत्र की तारीख, स्लाइड का कोड नाम और endplate की संख्या भी शामिल है कि एक फ़ाइल नाम के साथ छवियों को बचाने के लिए।
    नोट: 488 एनएम का उपयोग कर स्कैन और 532 एनएम लेज़रों (FITC और TRITC) लाल फ्लोरोफोरे और इसके विपरीत (खून बहाना के माध्यम से) से प्रतिदीप्ति द्वारा FITC चैनल के संक्रमण से बचने के लिए क्रमिक रूप से नहीं है (एक साथ) एकत्र किया जाना चाहिए।
  4. नमूना एक दोहरानेएन डी कदम की इमेजिंग 4.2-4.3 20 तक endplates स्लाइड / नमूना से एकत्र कर रहे हैं।
  5. अगले कोडित स्लाइड को बदलें और 4.2-4.4 दोहराएँ। कोडित स्लाइड्स में से प्रत्येक के लिए इस दोहराएँ।
  6. प्रयोगात्मक स्लाइड (FITC प्रतिदीप्ति चैनल अंधेरा दिखाई देनी चाहिए) के लिए इष्टतम पाया गया कि confocal सेटिंग्स का उपयोग करते हुए नियंत्रण स्लाइड (कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण) से endplates के कुछ छवियों को ले लीजिए।
  7. छवि फ़ाइलों को किसी अन्य कंप्यूटर करने के लिए और वापस एक बाहरी ड्राइव या सर्वर पर मूल फाइलों को confocal सत्र हस्तांतरण के अंत में।

5. एन फेस चित्र में Synaptic विशेषज्ञताओं के क्षेत्र को मापने

  1. प्रत्येक z ढेर से अधिकतम प्रक्षेपण (एमआईपी) छवियों को तैयार करने के लिए एनआईएच ImageJ फ्रीवेयर (http://imagej.nih.gov/ij/) का प्रयोग करें। झगड़ा फ़ाइलें (2A चित्रा एंड बी) के रूप में उन्हें बचाने के लिए। Filenames छवि सत्र तारीख, नमूना कोड, endplate संख्या और फ्लोरोसेंट चैनल (जैसे, 060414_57 शामिल होना चाहिए23_7_FITC.tiff)।
  2. ImageJ में Z-प्रक्षेपण छवि खोलें। Acetylcholine रिसेप्टर छवि चैनल (चित्रा 3 ए) का चयन करें और चुनें: छवि> स्क्रीन पर तीन 8 बिट स्केल छवियों में 24 बिट आरजीबी रंगीन छवि बदलने के लिए> 8 बिट टाइप करें।
  3. ब्याज की endplate से ही शुरू नहीं करता है कि किसी भी धुंधला छोड़कर whilst के विशेष व्यक्ति endplate के सभी स्पष्ट रूप से सना हुआ क्षेत्रों, शामिल करने के लिए इतनी के रूप में ImageJ बहुभुज उपकरण का उपयोग ((ACHR) चैनल दाग redBGT में ब्याज की endplate के आसपास किसी न किसी रूपरेखा आकर्षित चित्रा -3 सी)।
  4. चयन करके छवि के लिए एक न्यूनतम तीव्रता दहलीज लागू करें: छवि> समायोजित> थ्रेसहोल्ड (चित्रा 3E और संबद्ध ImageJ स्क्रीनशॉट)।
  5. उप दहलीज (3E चित्रा) के रूप में आसपास पृष्ठभूमि संकेत छोड़कर जबकि ACHR से सना हुआ अंश को अलग-थलग करने के लिए इतनी के रूप में दहलीज स्तर को समायोजित करें। एक दूसरे हवा खोलेंदहलीज मूल्य के बारे में निर्णय की सुविधा के लिए, तुलना के लिए खिड़की के बगल में तुरंत मूल (सतत टोन) छवि के साथ ओ। Colocalization में बाद में उपयोग के विश्लेषण के लिए दहलीज मूल्य रिकार्ड।
  6. चयन endplate के आसपास बहुभुज रूपरेखा बनाए रखने:> कणों का विश्लेषण विश्लेषण। (इस फोटोमल्टिप्लायर में बिजली के शोर से उत्पन्न होने वाले छोटे कलाकृतियों समाप्त) अनंत पिक्सल के लिए 50: पॉप-अप मेनू में के रूप में आकार की सीमा निर्दिष्ट करें।
  7. विश्लेषण कण आदेश असतत पूर्व दहलीज क्षेत्रों की एक सूची के साथ एक खिड़की उत्पन्न करता है और वे बाइनरी छवि (चित्रा 3 जी और जुड़े ImageJ स्क्रीनशॉट) में दिखाई देते हैं के रूप में उनके प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्यों गिने। एक लेबल स्प्रेडशीट में इस डेटा को कॉपी करें।
  8. चयन करके कुल endplate क्षेत्र (बहुभुज के भीतर क्षेत्र) उपाय: विश्लेषण> उपाय। इस कुल endplate क्षेत्र पैदावार। ACHR क्षेत्रों और तीव्रता में के लिए कॉपी और पेस्ट डेटाउचित कॉलम लेबल करने के लिए सुनिश्चित करते हुए एक स्प्रेडशीट, पंक्तियों विशिष्ट स्लाइड्स के लिए अलग-अलग endplates के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  9. विरोधी synaptophysin प्रतिदीप्ति चैनल में स्विच और दोहराने 5.1 कदम - 5.5, लेकिन FITC के चैनल के लिए (चित्रा 3 बी, डी और एफ)। उद्देश्य यह आंख द्वारा कथित रूप, यथासंभव, धुंधला की सीमाओं से मेल खाता है कि एक द्विआधारी छवि बनाता है तो यह है कि सीमा से समायोजित करने के लिए है। दहलीज मूल्य रिकार्ड।
  10. छवियाँ करने के लिए ढेर> छवि> ढेर: निम्न चरणों को लागू करने से ओवरलैप के क्षेत्र उपाय: दो चैनल छवियों युक्त मूल फ़ाइल को खोलें और चयन करके दो अलग छवियों में विभाजित।
  11. Pluggin> colocalization और इनपुट दहलीज मूल्यों को पहले संबंधित चैनल क्वेरी बी में ACHR और तंत्रिका चैनलों के लिए दर्ज की गई है: (ImageJ वेबपेज से डाउनलोड और स्थापित) colocalization प्लगइन का चयन का प्रयोगबैल। यह सफेद पिक्सल (चित्रा 3H और संबद्ध ImageJ स्क्रीनशॉट) में एक ओवरलैप छवि निकलेगा।
  12. एक स्केल प्रारूप में नव निर्मित ओवरलैप छवि बदलने के लिए और अधिकतम मूल्य के लिए एक सीमा से लागू होते हैं। अधिकतम सीमा से केवल पिछले दो चैनलों के ओवरलैप क्षेत्र के लिए इसी सफेद पिक्सल का चयन करेंगे। स्प्रेडशीट में रिकॉर्ड पिक्सल में ओवरलैप के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है जो 'colocalization' के परिणामस्वरूप क्षेत्र मूल्य,।
  13. , डेटा नमूना मतलब है की एक स्प्रेडशीट को तैयार गणना और histograms या scatterplots 20,22 के रूप में मानक विचलन और मानक त्रुटियों साजिश है। N के मूल्य आम तौर पर सांख्यिकीय प्रयोजनों के लिए नमूना समूह प्रति चूहों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है कि ध्यान दें।
  14. Scatterplots या आवृत्ति histograms के रूप में प्लॉट endplate ACHR क्षेत्रों डेटा सामान्य रूप से सांख्यिकीय परीक्षण (चित्रा 6) से पहले वितरित किया जाता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए।

6. सापेक्ष धुंधलातीव्रता अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों का प्रयोग तुलना

नोट: एक एकल confocal सत्र में इस प्रोटोकॉल सभी मांसपेशी नमूने एक साथ प्रक्रिया और छवि के लिए। एक प्रयोग की योजना बना में पेशी नमूना प्रति 30 मिनट इमेजिंग समय के लिए अनुमति देते हैं।

  1. मांसपेशी फाइबर की लंबी अक्ष के अनुप्रस्थ 15 माइक्रोन cryosections काटें और 3.1 कदम पर वर्णित के रूप में स्लाइड पर इकट्ठा।
  2. चरणों 3.2-3.13 में वर्णित के रूप में प्रतिदीप्ति धुंधला बाहर ले।
  3. संहिता कदम 4.1 में वर्णित के रूप में है कि इमेजिंग और विश्लेषण, उपचार समूह के लिए ऑपरेटर अंधा के साथ किए जाते हैं ताकि दाग स्लाइड।
  4. संक्षेप में प्रत्येक स्लाइड से एक अनुभाग सर्वेक्षण 40X प्रतिदीप्ति उद्देश्य (एनए 0.75) का उपयोग करते हुए एक भी लाभ का निर्धारण और सभी नमूना स्लाइड भर में सभी endplates के लिए उपयुक्त हो जाएगा कि ACHR के लिए स्तर सेटिंग ऑफसेट करने के लिए। प्रतिभाशाली endplate फिर पैमाने पर बस के नीचे 256 ग्रे होना चाहिए। यह अनुकूलन दूसरा fluorescenc के लिए अलग से किया जाना चाहिएई चैनल (क्रमिक एकत्र)। तय लाभ रिकार्ड और स्तर सेटिंग्स ऑफसेट और इमेजिंग सत्र के दौरान उन्हें बदल नहीं है।
  5. लेजर तीव्रता में किसी भी संभावित उतार-चढ़ाव का पता लगाने की शुरुआत और confocal सत्र के अंत में, एक ही मापदंड का उपयोग कर, एक प्रतिदीप्ति मानक स्लाइड (जैसे, गैर विरंजन फ्लोरोसेंट मोती) की छवियों को ले लीजिए।
  6. Endplates पता लगाने के लिए उत्तरोत्तर स्लाइड स्कैन करने के लिए ACHR चैनल का उपयोग करें।
  7. ACHR से सना हुआ endplates की सबसे अधिक संख्या में शामिल है कि प्रत्येक खुर्दबीन क्षेत्र में एक ऑप्टिकल अनुभाग विमान को खोजने के लिए ध्यान दें।
  8. दो बार इस एकल ऑप्टिकल खंड स्कैन और औसतन छवि (चित्रा 4 जी) को बचाने के।
  9. दूसरा प्रतिदीप्ति चैनल के लिए एक ही फोकल हवाई जहाज़ स्विच (ब्याज की प्रोटीन) में रखते हुए और कदम 6.8 के रूप में छवि को इकट्ठा। इमेजिंग सत्र की तारीख, नमूना कोड, छवि संख्या और फ्लोरोसेंट चैनल इंगित करने के लिए एक प्रतीक: फ़ाइल नाम सहित, छवि फ़ाइल सहेजें। एफ rapsyn, कस्तूरी या -dystroglycan (-DG) की तुलना में ACHR की endplate वितरण के उदाहरण से पता चलता है।
  10. एक या एक से अधिक endplates वाले अगले क्षेत्र के लिए मंच ले जाएँ और कदम 6.8-6.9 दोहराएँ। 60 endplates की कुल imaged हैं जब तक इस दोहराएँ।
  11. इमेजिंग सत्र हस्तांतरण के अंत में सभी को किसी अन्य कंप्यूटर करने के लिए फ़ाइलों और उन्हें वापस ऊपर।
  12. प्रत्येक मूल छवि फ़ाइल को खोलने और ACHR चैनल को देखते हुए, चयन: छवि> ढेर> चैनलों को विभाजित करने की छवियाँ के लिए हो चुकी है।
  13. चुनें: छवि> प्रकार> 8bit स्क्रीन पर 8 बिट स्केल प्रारूप में बदलने के लिए। दोनों प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए यह करो।
  14. चुनें: छवि> ढेर> चित्र चिति करने के लिए। दो पहले से अलग कर 8 बिट छवियों से एक नया स्टैक खोलें। एक तो एकल खिड़की के भीतर दो प्रतिदीप्ति चैनलों के बीच आसानी से स्विच कर सकते हैं।
  15. एक लिन आकर्षित करने के लिए बहुभुज उपकरण का प्रयोग करेंई कसकर ACHR धुंधला (चित्रा 4i) की सीमा के आसपास।
  16. का चयन करें: संलग्न क्षेत्र के भीतर ACHR के लिए औसत पिक्सेल तीव्रता को मापने के लिए उपाय> विश्लेषण (कसकर रेखा खींचने के महत्व पर ध्यान दें)। एक लेबल स्प्रेडशीट में इस मूल्य को कॉपी करें।
  17. एक ही बहुभुज रूपरेखा (क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए मापा जा सकता है) बनाए रखना है, (उदाहरण के लिए, चित्रा 4 बी, डी, एफ) दूसरे फ्लोरोसेंट चैनल के लिए स्विच और का चयन करें: विश्लेषण> उपाय। इस ACHR धुंधला द्वारा परिभाषित अन्तर्ग्रथनी क्षेत्र के भीतर ब्याज की प्रोटीन के लिए औसत धुंधला तीव्रता निकलेगा।
  18. औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए उपाय> विश्लेषण करें: चयन तो दूर से दिखाई दे endplate धुंधला से एक क्षेत्र चुनें। अन्य प्रतिदीप्ति चैनल / एस के लिए इस दोहराएँ और प्रतिदीप्ति मूल्यों की स्प्रेडशीट में पृष्ठभूमि मूल्यों की प्रतिलिपि।
  19. उपACHR के लिए सही तीव्रता और प्रत्येक endplate पर ब्याज की प्रोटीन प्राप्त करने के लिए endplate मूल्यों से औसत पृष्ठभूमि मूल्यों पथ।
  20. प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात 14,21 उपज के लिए सही BGT प्रतिदीप्ति तीव्रता से ब्याज की प्रोटीन के लिए सही endplate तीव्रता मूल्यों फूट डालो

7. झल्लाहट का प्रयोग में postsynaptic झिल्ली ACHR घनत्व की तुलना

नोट: इस प्रोटोकॉल पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में जो AChRs बारीकी से पैक कर रहे हैं करने के लिए इस हद तक (<10 एनएम अंतर) का आकलन है। सटीक दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोफोरे संयोजन इस झल्लाहट परख के लिए महत्वपूर्ण है। नाम और fluorophores के विवरण सामग्री तालिका में दिया जाता है। उनके वर्णक्रमीय गुण, झल्लाहट के संबंध में हमारे पिछले कागजात 14,15 में चर्चा कर रहे हैं।

  1. खंड 6.1 में वर्णित के रूप में तय अनुप्रस्थ cryosections तैयार करें। सभी नमूना समूहों को एक साथ और छवि संसाधित किया जाना चाहिएएक ही confocal सत्र में डी।
  2. अच्छी तरह से जी 10 के साथ 2.5 ग्राम / मिलीलीटर लाल-BGT (झल्लाहट दाता) मिश्रण / एमएल दूर लाल-BGT (स्वीकर्ता झल्लाहट) 12 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा एक छोटे से प्लास्टिक ट्यूब में अवरुद्ध समाधान के साथ। इस 1: 4 दाढ़ मिश्रण झल्लाहट 14 की दक्षता अधिकतम हो।
  3. ध्यान से ऊपर के मिश्रण की एक बूंद (12 μl) के साथ प्रत्येक अनुभाग को कवर किया और आरटी पर 1.5 घंटे के लिए सेते हैं, एक humidified कक्ष में प्रत्येक स्लाइड रखें।
  4. नियंत्रण वर्गों:; तथा 10 ग्राम / मिलीलीटर दूर-लाल-BGT के साथ कुछ वर्गों / एमएल लाल-BGT (लेबल C1 के नियंत्रण दाता केवल) जी 2.5 के साथ वर्गों की कम संख्या को कवर (केवल स्वीकर्ता; लेबल वाले सी 2 नियंत्रण)। कदम 7.3 में के रूप में इन नियंत्रणों को सेते हैं।
  5. धो पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट स्लाइड में माउंट ग्लिसरॉल आधारित, फीका-विरोध बढ़ते मध्यम (कदम 3.12 देखें)।
  6. कदम 6.7 में के रूप में endplates के नमूने प्रदर्शन करते हैं। दाता और स्वीकर्ता से प्रतिदीप्ति कारण फ्लोरोसेंट-BGT अणुओं की यादृच्छिक बंधन को पूरी तरह से endplates पर सह स्थानीय होना चाहिए।
  7. नियंत्रण छवियों: 40x उद्देश्य और कम लेजर शक्ति का अनुकूलन redBGT लाभ का उपयोग और एक नियंत्रण स्लाइड सी 1 से endplates के लिए स्तर सेटिंग्स ऑफसेट। दूर-redBGT लाभ का अनुकूलन और नियंत्रण स्लाइड सी 2 से endplates के लिए स्तरों ऑफसेट। किसी भी प्रतिदीप्ति खून के माध्यम से की अनुपस्थिति की पुष्टि करें।
  8. लेजर सत्ता बदलने के बिना, लाभ या ऑफसेट-स्तर सेटिंग्स प्रयोगात्मक स्लाइड करने के लिए कदम है और दोनों प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए छवियों (पूर्व photobleach) इकट्ठा।
  9. चुनिंदा तो 100% बिजली पर 633 एनएम लेजर के साथ 10 बार स्कैनिंग स्कैन क्षेत्र में zooming द्वारा एक एकल endplate के एक हिस्से से अधिक दूर-लाल-BGT photobleach। स्कैन किए गए क्षेत्र में प्रतिदीप्ति मंद हो जाना चाहिए।
  10. लेजर शक्ति रीसेट और ज़ूम और 7.7 पर स्थापित confocal सेटिंग्स का उपयोग करते हुए दोनों फ्लोरोसेंट चैनलों पर पोस्ट-ब्लीच छवियों को इकट्ठा।
  11. स्वीकर्ता (दूर-लाल-बी के photobleach निम्नलिखित दाता में प्रतिशत वृद्धि से (लाल-BGT) प्रतिदीप्ति झल्लाहट दक्षता (ई) की गणनानिम्न सूत्र * के अनुसार जीटी):
    1 समीकरण
    * दाता की प्रतिदीप्ति स्वीकर्ता photobleaching के बाद बढ़ जाती है, जहां सभी परिस्थितियों के लिए।

Representative Results

NMJ पर synaptic क्षेत्र के मापन

क्षेत्र के किसी भी अनुमान अन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञताओं की हद को परिभाषित करने के लिए एक सीमा के ड्राइंग पर निर्भर करता है। स्वस्थ युवा वयस्क मांसपेशियों में NMJ छवियों ACHR और synaptophysin धुंधला (2A चित्रा और बी) दोनों के लिए अच्छी तरह से परिभाषित सीमाओं को प्रदर्शित करना चाहिए। ACHR और synaptophysin दोनों के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता मोटर endplate (चित्रा 5 ए 'और बी') की-पेरी अन्तर्ग्रथनी और synaptic हिस्से के बीच सीमा पर तेजी से बढ़ जाता है। ऐसी छवियों (बस extrasynaptic पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से ऊपर) के लिए एक न्यूनतम सीमा के लिए आसानी से endplate ((चित्रा 5 ए 'और बी') में क्षैतिज धराशायी लाइनों) के ACHR अमीर या synaptophysin युक्त क्षेत्र को अलग करेगा। वृद्ध चूहों में और ACHR के लिए कुछ रोग राज्यों endplate धुंधला में कम तीव्र हो सकता है, ACHR क्लस्टर किनारों धुंधला दिखाई देते हैं और हो सकता हैफिर से उच्च extrasynaptic autofluorescence के स्तर (; 17,22 चित्रा 5D) हो सकता है। अस्पष्ट सीमाओं के साथ प्रतिदीप्ति धुंधला अन्तर्ग्रथनी क्षेत्र के अनुमानों में त्रुटि लागू कर सकते हैं। सभी स्थितियों में उद्देश्य वे मूल, सतत टोन छवि में आंख दिखाई देते हैं के रूप में AChR- या synaptophysin अमीर क्षेत्रों के आकार और आकार में इसी तरह के एक द्विआधारी छवि पैदावार कि एक सीमा से चयन करने के लिए है। इलाज के समूह के लिए विश्लेषण अंधे का आयोजन thresholding कदम (कदम 4.1) पर व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह के जोखिम को कम करना चाहिए। कभी कभी बेहोश हो या धुंधला endplate छवियों उप इष्टतम प्रसंस्करण से परिणाम कर सकते हैं। चित्रा -2 और डी एक स्वस्थ 2 महीने पुराने माउस से एक कम गुणवत्ता endplate छवि का एक उदाहरण से पता चलता है। धुंधला किनारों और बेहोश synaptophysin धुंधला Cryosectioning करने से पहले पेशी के आंशिक विगलन और से इस उदाहरण में पैदा हुई है हो सकता है। युवा स्वस्थ (सकारात्मक नियंत्रण) मांसपेशी के कुछ वर्गों sectioned किया जाना चाहिए एकएन डी प्रयोगात्मक नमूनों के साथ समानांतर में संसाधित NMJ छवियों में स्पष्ट किसी भी हानि immunostaining के साथ समस्याओं के कारण नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए। उप इष्टतम प्रसंस्करण से समझौता छवियों के बैच विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।

चेहरा Z ढेर छवियों एन के लिए, 15-20 endplates अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों के आकलन के लिए एक उचित नमूना आकार है। आकृति और NMJs के आकार में एक व्यापक विविधता किसी भी मांसपेशियों के भीतर पाए जाते हैं। Scatterplots किसी भी व्यक्ति माउस (चित्रा 6A) के tibialis पूर्वकाल पेशी के endplates बीच ACHR युक्त क्षेत्र में एक काफी रेंज प्रकट करते हैं। फिर भी, (चेहरा endplate छवियों एन 15-20 पर आधारित) औसत ACHR क्षेत्र सात नमूना चूहों (; चित्रा 6A ~ 200 मी 2) के बीच इसी तरह की थी। endplate synaptophysin धुंधला के क्षेत्र में भी एक दिया पेशी से endplates के बीच काफी विविध। एक बार फिर, 15-20 का एक नमूना आकार का उपयोग endplate synaptophysin का मतलब क्षेत्र सिमी था endplatesसात चूहों के बीच लोकप्रिय अध्ययन (~ 170m 2; चित्रा 6B)। जमा डेटा की आवृत्ति histograms endplate ACHR और synaptophysin (चित्रा 6A 'और बी') के क्षेत्र के लिए मोटे तौर पर सामान्य वितरण का पता चला। हालांकि अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों में से एक सामान्य वितरण रोग राज्यों में ग्रहण जैसे myasthenia 16,20 कामला नहीं किया जा सकता। इस सांख्यिकीय परीक्षण के चुनाव को प्रभावित कर सकता है।

टेबल मैं पिछले अध्ययनों से स्वस्थ 2 महीने पुराने (युवा वयस्क) महिला C57BL / 6J चूहों के लिए NMJs के लिए पूर्व और बाद synaptic विशेषज्ञताओं के क्षेत्रों को सूचीबद्ध करता है। पूर्व और बाद synaptic दोनों विशेषज्ञताओं के क्षेत्रों आसीन 22 की उम्र बढ़ने के साथ गिरावट आई है। ACHR क्षेत्र में भी स्पष्ट रूप से विरोधी कस्तूरी myasthenia से आईजीजी के साथ इंजेक्शन चूहों में कम हो गया था रोगियों 17,21 कामला। Cholinesterase अवरोध करनेवाला दवा, pyridostigmine के साथ इलाज Myasthenic चूहे, endplate ACHR क्षेत्र 20 <में एक और महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित/ Sup>।

Endplate प्रतिदीप्ति लेबलिंग के रिश्तेदार तीव्रता

immunofluorescence लेबलिंग के रिश्तेदार तीव्रता उम्र, जीनोटाइप और / या रोग राज्य के साथ एक synaptic प्रोटीन के हित के घनत्व में परिवर्तन प्रकट कर सकते हैं। ACHR प्रतिदीप्ति (लाल-BGT या दूर-लाल-BGT) पहली NMJ के स्थान को परिभाषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। 8-बिट ACHR युक्त क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति की चमक तो जानवरों को नियंत्रित करने के रिश्तेदार ब्याज की प्रोटीन की एकाग्रता में परिवर्तन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। अनुप्रस्थ वर्गों में endplate AChRs आम तौर पर एक अर्द्ध चंद्राकार आकार के रूप में दिखाई देते हैं, लेकिन इस आकार अक्सर (चित्रा -4 ए, सी, ई, एच) अनियमित है। कम तीव्रता पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति आमतौर पर ACHR धुंधला की एक पैच एक एकल endplate का प्रतिनिधित्व करता है, या आसन्न मांसपेशी फाइबर पर स्थित दो अलग-अलग endplates कि क्या पता चलता है। (जैसे rapsyn, कस्तूरी और एसआरसी) के रूप में कई अन्तर्ग्रथनी प्रोटीनendplate (- डी चित्रा -4 ए) में ACHR साथ colocalized। Phospho विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunofluorescence धुंधला भी विशेष पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली प्रोटीन 21 के फास्फारिलीकरण स्थिति पर प्रयोगात्मक हस्तक्षेप के प्रभाव की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रतिदीप्ति तीव्रता माप की विश्वसनीयता और reproducibility जमे हुए पेशी की अखंडता और immunostaining की गुणवत्ता पर काफी निर्भर करता है। स्नायु विच्छेदित और तुरंत तस्वीर जमी या paraformaldehyde के तय (पशु की मौत के मिनट के भीतर) NMJ को अपक्षयी परिवर्तन से बचने के लिए किया जाना चाहिए। Immunostaining अभिकर्मकों की गुणवत्ता और विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए धुंधला प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर अत्यधिक निर्भर करता है। प्राथमिक एंटीबॉडी पायलट immunostaining के प्रयोगों के किसी भी नए बैच के लिए आवश्यक हैं। स्वस्थ युवा मांसपेशियों के हौसले कटौती cryosections प्राथमिक एंटीबॉडी के धारावाहिक दो गुना dilutions के साथ incubated रहे हैं। एकनाम से जाना जाता विश्वसनीय माध्यमिक एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया जाता है और परिणाम की तुलना में कर रहे हैं। ब्याज की प्रोटीन NMJ के लिए प्रतिबंधित किया जा करने के लिए जाना जाता है, तो सबसे अच्छा प्रतिरक्षी एकाग्रता मांसपेशियों (पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति) की extrasynaptic भागों में पाया कि के सापेक्ष NMJ प्रतिदीप्ति तीव्रता के उच्चतम अनुपात जो पैदावार है। Extrasynaptic (संभवतः गैर विशिष्ट) प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्य रूप से endplate प्रतिदीप्ति तीव्रता का 15% से अधिक नहीं होना चाहिए। इसी प्रकार 'कोई प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण' (माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ ही incubated) वर्गों माध्यमिक एंटीबॉडी गैर-विशेष रूप से बाध्य नहीं किया, पुष्टि है कि अंधेरा दिखाई देनी चाहिए। (पॉलीक्लोनल) माध्यमिक एंटीबॉडी स्पष्ट रूप से इतना वैकल्पिक माध्यमिक एंटीबॉडी बैचों भिन्न हो सकते हैं के विभिन्न बैचों की गुणवत्ता में एक मानक प्रोटोकॉल की स्थापना से पहले तुलना की जानी चाहिए। इम्यूनोफ्लोरेसेंस की विशिष्टता के लिए आदर्श परीक्षण चूहों टी से जंगली प्रकार चूहों और नकारात्मक नियंत्रण वर्गों से वर्गों में से एक प्रत्यक्ष तुलना शामिलटोपी प्रोटीन के हित (जीन पीटा) की कमी है। निम्न संदर्भ कस्तूरी, rapsyn, dystroglycan, एसआरसी और ACHR 13,14,18,21 के लिए endplate प्रतिदीप्ति धुंधला के quantitation का वर्णन है।

छोटा सा नमूना आकार रिश्तेदार प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुमानों में त्रुटि परिचय। व्यक्तिगत endplates प्रतिदीप्ति तीव्रता में काफी विविध। मुमकिन है कि किसी दिए गए पेशी के भीतर endplates के बीच इस परिवर्तनशीलता नमूना ऑप्टिकल अनुभाग में NMJ संरचना और मौका मतभेद की विविधता को दर्शाता है। हालांकि, औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (चित्रा 7) के एक अधिक स्थिर अनुमान में endplates नमूना परिणामों की संख्या बढ़ रही है। प्रत्येक पेशी नमूना से 40-60 endplates औसतन किया जाना चाहिए औसत endplate प्रतिदीप्ति तीव्रता का अनुमान है।

ACHR-ACHR झल्लाहट

प्रत्येक ACHR (प्रत्येक अल्फा-सबयूनिट पर एक स्थित) BGT के लिए दो बाध्यकारी साइटों के साथ एक pentamer है। के बंधनलाल BGT और दूर-लाल-BGT के बारे में 9nm 28-30 के एक दाता स्वीकर्ता जुदाई उपज होगा इन दो साइटों के लिए। इस प्रकार कम दक्षता झल्लाहट AChRs समूहों 14 में इकट्ठा पहले भी पता लगाया जा सकता है। हालांकि, murine endplates पर झल्लाहट की दक्षता में मोटे तौर पर एक कसकर बांध पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली जाली 14 में AChRs के अधिक कुशल समावेश के साथ संगत, postnatally दोगुनी हो। झल्लाहट दाता और स्वीकर्ता (क्रमशः) के रूप में लाल-BGT और दूर-लाल-BGT का प्रयोग, 1-2 महीने पुराने चूहों के endplates 20-37% (तालिका 2) से लेकर औसत झल्लाहट क्षमता का उत्पादन किया। 20% या उससे अधिक की झल्लाहट क्षमता AChRs 14 से तंग पैकिंग प्रतिनिधित्व करने के लिए लगा रहे हैं। चूहों विरोधी कस्तूरी पॉजिटिव myasthenia से आईजीजी साथ थे इंजेक्शन के बाद endplate झल्लाहट दक्षता थोड़ा वितंत्रीभवन 14 निम्नलिखित कम है, और स्पष्ट रूप से कम हो गया था रोगियों 18 कामला। ये व्यक्ति AChRs कम कसकर postsy में पैक कर रहे हैं, जिसमें शर्तें हैंपोस्टअन्तर्ग्रथनी कस्तूरी / rapsyn प्रणाली 31 से naptic झिल्ली पाड़।

चित्रा 1
चित्रा 1. एम्बेड और Cryosectioning के लिए ठंड की मांसपेशियों को (1-5) के नए नए साँचे की तैयारी ('नौकाओं') की मांसपेशियों के एक बैच ठंड करने से पहले:। (1) एल्यूमिनियम पन्नी आयतों (2.0 एक्स 3.0 सेमी) और में कट जाता है (2)। एक फफूंदी / नाव बनाने के लिए अभ्यारोपित के रूप में तह (3)। (4) nitrocellulose immunoblotting के कागज की आयतों के सांचे में फिट करने के लिए काट रहे हैं और एक गेंद बिंदु कलम पेशी orientating के लिए लाइनों शासन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (5) nitrocellulose आयत मोल्ड में रखा गया है। (6) cryostat embedding मैट्रिक्स द्रव धीरे (nitrocellulose के शीर्ष पर) मोल्ड में डाल दिया है 2 मिमी की गहराई तक: Embedding और मांसपेशियों को ठंड (6-8)। (7) ठीक संदंश nitrocellu के साथ खेलते, embedding मैट्रिक्स में अपने कण्डरा द्वारा, मांसपेशियों को कम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं(8) अतिरिक्त एम्बेड मैट्रिक्स धीरे बुलबुले बनाने से बचने के ख्याल रख रही है, मांसपेशियों को कवर करने के लिए मोल्ड में डाल दिया है, फैसलों खो देते हैं। एम्बेडेड पेशी फिर ट्यूब में सील और पाठ में वर्णित के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, जमे हुए तस्वीर है। (9-12) Cryosectioning के लिए तैयारी: (9) ठीक संदंश एल्यूमीनियम मोल्ड दूर छील करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं और जमे हुए ब्लॉक तब -20 सी cryostat कक्ष रहेंगे, nitrocellulose में (10) चिह्नों संरेखित करने के लिए उपयोग किया जाता है में रखा गया है अनुदैर्ध्य सेक्शनिंग (12) के लिए चक (11) का सामना करने के लिए पेशी समानांतर। तरल क्रायो embedding माध्यम की एक बूंद ठंडा चक करने के लिए ब्लॉक संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है। कुंद संदंश जमे हुए पेशी ब्लॉक में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। अनुप्रस्थ वर्गों को प्राप्त करने के लिए, ब्लॉक बजाय मांसपेशियों चक की सतह को सीधा है कि इतनी मुहिम शुरू की है () नहीं दिखाया।

चित्रा 2
एफदो महीने पुराने महिला C57Bl6J चूहों के tibialis पूर्वकाल पेशी से NMJs की igure 2. एन चेहरा छवियों। ताजा पेशी जमी तस्वीर थी और 3.2 कदम पर वर्णित के रूप में वर्गों स्लाइड पर तय की। पहली प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में जेड के ढेर की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण छवियों प्राप्त किया गया। (ए) लाल-BGT धुंधला (चेहरा देखें एन) ACHR युक्त प्राथमिक postjunctional गटर के दो सेट से मिलकर एक भी मोटर endplate पता चलता है। (बी) Synaptophysin FITC संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला प्राथमिक अन्तर्ग्रथनी gutters के कब्जे प्रीसानेप्टिक तंत्रिका टर्मिनल का पता चलता है। पूर्व टर्मिनल अक्षतंतु के एक हिस्से को भी पैनल के ऊपरी भाग में दिखाई देता है। (सी एंड डी) के एक जवान स्वस्थ माउस से एक गरीब गुणवत्ता NMJ छवि का एक उदाहरण है। धुंधला कमजोर है और पूर्व और बाद synaptic विशेषज्ञताओं की सीमाओं को धुंधला कर रहे हैं। यह टी में कमियों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया थावह ऊतक और / या अपर्याप्त समय के प्रसंस्करण प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए अनुमति दी। पैनल डी में स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा (प्रोटोकॉल एक में उल्लिखित) चेहरा NMJ छवियों एन के प्रसंस्करण में 3. कदम। (ए एंड बी) के मूल निरंतर स्वर एमआईपी छवियों ACHR और क्रमशः synaptophysin के लिए हरी इम्यूनोफ्लोरेसेंस खुलासा लाल-BGT प्रतिदीप्ति दिखा। (सी) endplate चित्रित करने के लिए बहुभुज उपकरण की एक 8 बिट ग्रे पैमाने पर छवि के लिए रूपांतरण और उपयोग के बाद ACHR धुंधला (पतली पीली लाइन)। (डी) endplate सीमा रेखा हरी synaptophysin छवि को खत्म किया। (ई) Applएक न्यूनतम तीव्रता दहलीज कमांड के ication suprathreshold लाल-BGT (ACHR) प्रतिदीप्ति आइसोलेट्स कि एक द्विआधारी छवि बनाने के लिए। ImageJ का यूजर इंटरफेस स्क्रीनशॉट का अनुक्रम छवियों के बाईं ओर प्रदर्शित किया जाता है। (एफ) एक अलग दहलीज के आवेदन के बाद बाइनरी synaptophysin छवि। विश्लेषण कणों आदेश के आवेदन के द्वारा endplate भीतर असतत suprathreshold ACHR युक्त डोमेन की (जी) पहचान द्विआधारी लाल-BGT छवि के लिए। पैनल की बाईं इसी ImageJ ((जी)। आवश्यक suprathreshold पिक्सेल क्षेत्रों का न्यूनतम आकार दर्ज किया जाना चाहिए आवश्यक इनपुट डेटा से पता चलता है। (एच) द्विआधारी synaptophysin और ACHR छवियों के ओवरलैप के क्षेत्रों की पहचान। ओवरलैप सफेद पिक्सल का प्रतिनिधित्व करती है बाइनरी ओवरलैप छवि पर पहुंचने के लिए कदम दिखाने। चुना न्यूनतम तीव्रता दहलीज मूल्यों प्रत्येक प्रतिदीप्ति ग के लिए (पैनल एच नीचे)। ImageJ का यूजर इंटरफेस स्क्रीनशॉटhannel 'colocalization' खिड़की के भीतर दर्ज होना चाहिए। स्केल बार 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा रिश्तेदार फ्लोरोसेंट तीव्रता तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों (प्रोटोकॉल 2) 4. उदाहरण। मांसपेशी जमे हुए और स्लाइड पर तय वर्गों कदम 3.2। (ए एंड बी) के अब तक के साथ डबल लेबल एक एकल endplate में वर्णित के रूप में तस्वीर थी -लाल-BGT (ACHR, नीले pseudocolor में यहाँ दिखाया गया है) और FITC-विरोधी rapsyn पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में इन दो बातचीत प्रोटीन की सह स्थानीयकरण दिखाता है (सी एंड डी) प्रदर्शन एसी सह स्थानीय आसन्न मांसपेशी फाइबर पर दो endplates। मानव संसाधन और कस्तूरी। (ई और एफ) एक endplate ACHR और -dystroglycan (-DG) के लिए डबल लेबल। -DG (पैनल वायुसेना के लिए, एफ में पैमाने पर पट्टी: 25 माइक्रोन) सही मांसपेशी फाइबर परिधि के चारों ओर फैली हुई है लेकिन endplate में समृद्ध है (जी - मैं) तीव्रता माप के लिए एक endplate अलग (जी) एक ठेठ माइक्रोस्कोप क्षेत्र,।। पैनल जी में तीन दूर-लाल-BGT से सना हुआ endplates (पैमाने बार युक्त: 40 माइक्रोन (एच) बॉक्सिंग endplate के बढ़े हुए छवि (मैं) एक ही endplate बहुभुज का उपयोग कर एक 8 बिट स्केल छवि को बदला है और चित्रित।। । ImageJ (पतली पीली लाइन) के उपकरण औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता इस सीमा रेखा के भीतर मापा जाता है। (एच और मैं के लिए पैमाने पर पट्टी: 10 माइक्रोन) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ontent "के लिए: रख-together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 5
अन्तर्ग्रथनी क्षेत्र का आकलन करने में छवि गुणवत्ता की चित्रा 5. प्रभाव। (ए एंड बी) लाल-BGT और विरोधी synaptophysin प्रतिदीप्ति चैनलों पर देखा एक दो महीने पुराने माउस से एक स्वस्थ NMJ का चेहरा छवियों एन उच्च गुणवत्ता। (ए 'एंड बी ') प्रतिदीप्ति तीव्रता क्रमश: ए और बी के लिए endplate भर में खींची गई रेखा को इसी प्रोफाइल। क्षैतिज लाल धराशायी लाइन। द्विआधारी छवि बनाने के लिए इस्तेमाल किया न्यूनतम सीमा को इंगित करता है एक बुजुर्ग माउस से (सी एंड डी) endplate। Endplate synaptophysin धुंधला आम तौर पर कम तीव्र है। (सी 'और' डी) तीव्रता प्रोफाइल को वापस (synaptophysin (FITC) चैनल में extrasynaptic (आधारभूत) प्रतिदीप्ति उतार-चढ़ाव का एक उच्च स्तरीय दिखानेएक उपयुक्त दहलीज के निर्धारण को प्रभावित करता है, जो जमीन)। यह बहुत व्यापक स्पेक्ट्रम ऊतक autofluorescence है। स्केल सलाखों 10 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. एक मांसपेशी के भीतर और चूहों के बीच NMJs के बीच अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों की परिवर्तनशीलता। (ए) Scatterplots लेखक NT द्वारा प्राप्त सात अनुभवहीन दो महीने पुराने महिला C57BL / 6J चूहों के tibialis पूर्वकाल पेशी से endplates की कुल ACHR युक्त क्षेत्र दिखाते हैं। प्रत्येक प्रतीक एक endplate का प्रतिनिधित्व करता है। हर बार एक माउस से जांचा endplates के लिए एसडी ± मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। (बी) Scatterplots एक ही endplates के लिए synaptophysin युक्त क्षेत्र दिखा। (ए ') (बी ') endplates (जमा डेटा) की synaptophysin-समृद्ध क्षेत्र के लिए आवृत्ति वितरण के लिए आवृत्ति वितरण। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा endplate प्रतिदीप्ति तीव्रता के अनुमानों पर नमूना आकार की 7. प्रभाव। अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों के लिए एक स्वस्थ 2 महीने पुराने माउस का tibialis पूर्वकाल पेशी से 40 से 60 endplates पर (मनमाना इकाइयों में) प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया। संचयी औसत के औसत में शामिल endplates की संख्या बनाम प्लॉट किए जाते हैं। (ए) endplate लाल-BGT प्रतिदीप्ति तीव्रता लेखक ए वी के द्वारा प्राप्त की। (बी) विरोधी synaptophysiपैनल के रूप में ही endplates लिए immunofluorescence तीव्रता एन। लेखक प्राकृतिक गैस मंत्रालय द्वारा एक दूसरे पेशी नमूना से प्राप्त (सी) endplate दूर-लाल-BGT प्रतिदीप्ति तीव्रता। (डी) पैनल सी के रूप में ही endplates से विरोधी rapsyn इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीव्रता।

अध्ययन मांसपेशी चूहों की संख्या ACHR क्षेत्र Synaptophysin क्षेत्र ओवरलैप क्षेत्र
एसडी ± मतलब (μm2) एसडी ± मतलब (μm2) एसडी ± मतलब (μm2)
Morsch एट अल। (2012) 1 gastrocnemius 3 181 ± 7 163 ± 24
डायाफ्राम 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch एट अल। (2013) 1 tibialis पूर्वकाल 3 166 ± 26 117 ± 21 एन डी
चेंग एट अल। (2013) 2 tibialis पूर्वकाल 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
त्से (अप्रकाशित) 2 tibialis पूर्वकाल 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
एक एक Zeiss एल एस एम 510 मेटा माइक्रोस्कोप पर है, लेकिन निश्चित लाभ के साथ imaged और स्तरों ऑफसेट। थ्रेशोल्डिंग और synaptic क्षेत्रों माप Metamorph softwar इस्तेमाल कियाएम एम द्वारा ई।
दो उपचार समूह के लिए अंधा संकेत दिया पहले लेखक ने मौजूदा प्रोटोकॉल के बाद एक Leica डीएम IRE2 माइक्रोस्कोप पर imaged और विश्लेषण किया।
एन डी निर्धारित नहीं।

दो महीने पुराने महिला C57BL / 6J चूहों के NMJs के लिए तालिका 1. Synaptic क्षेत्रों (स्वस्थ नियंत्रण)

अध्ययन मांसपेशी * दक्षता (%) झल्लाहट रेंज (%)
(± SEM के मतलब है)
Brockhausen एट अल। (2008) tibialis पूर्वकाल 24 ± 1 NA
अल। 2010 कोल एट tibialis पूर्वकाल 26 ± 1 22-30
Morsch (अप्रकाशित) डायाफ्राम 37 ± 1 24-47
Ghazanfari (अप्रकाशित) tibialis पूर्वकाल 30 ± 1 20-45
* झल्लाहट जोड़ी = 51A के लिए लाल BGT और दूर-लाल-BGT (फोर्स्टर त्रिज्या (जीवन टेक्नोलॉजीज) के बीच झल्लाहट।
उपलब्ध नहीं NA डेटा

तालिका 2 ACHR के लिए क्षमता युवा वयस्क चूहों C57Bl6J चूहों से झल्लाहट

Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल मज़बूती से मापने के लिए और सामान्य उम्र बढ़ने और रोग राज्यों सहित स्थितियों की एक श्रृंखला भर में NMJ के गुणों में परिवर्तन यों के लिए सक्षम है। एन के लिए वर्णित विधि NMJ छवियों शोधकर्ताओं पूर्व और postsynaptic विशेषज्ञताओं का क्षेत्र और synaptic ओवरलैप / संरेखण के क्षेत्र की तुलना करने की अनुमति देगा का सामना। पूर्व और postsynaptic प्रोटीन अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों का उपयोग करता है जो दूसरे प्रोटोकॉल के रिश्तेदार तीव्रता तुलना करने के लिए, पसंद किया जाता है। तीसरे प्रोटोकॉल विशेष रूप से पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में AChRs की पैकिंग की निकटता में परिवर्तन के लिए परीक्षण।

विशिष्टता नियंत्रण immunofluorescence माइक्रोस्कोपी में महत्वपूर्ण हैं। अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए किसी भी प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय यह पहली बार यह मांसपेशियों वर्गों में अपने लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशेष रूप से बांधता कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। ऊतक प्रसंस्करण और निर्धारण के विभिन्न प्रकार के विभिन्न की विशिष्टता को बदल सकते हैंएंटीबॉडी। यह वास्तव में मोटर endplate पर ACHR साथ ध्यान केंद्रित किया है (कहना rapsyn के लिए) है कि immunofluorescence धुंधला पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है। नकारात्मक नियंत्रण वर्गों भी बाध्यकारी एंटीबॉडी विशिष्ट है कि यह सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए। / - - चूहों उदाहरण के लिए, rapsyn इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए सबसे अच्छा नकारात्मक नियंत्रण rapsyn से वर्गों के लिए किया जाएगा। इन विरोधी rapsyn के साथ कोई endplate धुंधला दिखाई देना चाहिए। गैर-विशिष्ट प्रतिदीप्ति भी ऊतक (autofluorescence) में या फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी साधना द्वारा गैर विशिष्ट बंधन से अंतर्जात फ्लोरोसेंट रसायनों से पैदा कर सकते हैं। इस तरह के प्रतिदीप्ति अक्सर एल्डिहाइड निर्धारण से बदतर है। इसके अलावा, endplates की TRITC-BGT धुंधला कभी कभी FITC प्रतिदीप्ति चैनल में पता लगाया जा सकता है और इस फ्लोरोसेंट खून के माध्यम से विशिष्ट FITC इम्यूनोफ्लोरेसेंस के साथ भ्रमित किया जा सकता है। गैर विशिष्ट प्रतिदीप्ति के उत्तरार्द्ध तीन रूपों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए, दाग रहे हैं कि स्लाइड के हर बैच में कुछ 'एन शामिल होना चाहिएओ-प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण 'वर्गों (3.7 और 4.6 कदम)। इन पर नियंत्रण वर्गों से endplates की छवियाँ NMJs के अप्रत्यक्ष immunofluorescent धुंधला सही मायने में प्राथमिक एंटीबॉडी के बंधन को दर्शाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगात्मक स्लाइड से उन लोगों की तुलना की जानी चाहिए।

ट्रांसवर्स confocal वर्गों अन्तर्ग्रथन में immunostaining के रिश्तेदार तीव्रता में अंतर का आकलन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं। अनुप्रस्थ confocal वर्गों में यह अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन की सटीक सह स्थानीयकरण न्याय करने के लिए आसान है। चंद्राकार endplate प्रोफाइल सिर्फ एक नमूना कट के माध्यम से NMJ प्रश्न में प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, पृष्ठभूमि (extrasynaptic) प्रतिदीप्ति आम तौर पर कम चेहरे Z-प्रक्षेपण छवियों एन की तुलना में है। इस प्रकार, यह 'असली' (विशिष्ट) immunostaining के भेदभाव और निश्चित confocal लाभ की स्थापना और अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों 13-15,18 का उपयोग कर मूल्यों ऑफसेट करने के लिए आसान हो सकता है। उदाहरण के लिए, myasthenia की एक माउस मॉडल में (wher कामलाई endplate ACHR धुंधला स्पष्ट रूप से कम हो जाता है) endplates स्पष्ट रूप से अनुप्रस्थ ऑप्टिकल वर्गों 18,21 में चित्रित किया गया था। NMJ पर प्रतिदीप्ति की औसत तीव्रता में अंतर अन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञता के भीतर लक्ष्य प्रोटीन की बदल घनत्व को प्रतिबिंबित करने की संभावना है। एक चेतावनी है कि कुछ स्थितियों में, लक्ष्य प्रोटीन या पड़ोसी प्रोटीन से बाध्यकारी एंटीबॉडी की आड़ में एक संरचनात्मक परिवर्तन बदल धुंधला तीव्रता व्याख्या हो सकती है, कि है।

प्रयोगों के डिजाइन में कुछ विचार की आवश्यकता है। कई मामलों में प्रयोग NMJ के आकार पर एक transgene, जीन पछाड़ना या रोग राज्य के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए लक्ष्य होगा। प्रयोगात्मक नमूना समूह तो एक ही लिंग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के स्वस्थ युवा (जंगली प्रकार) चूहों की तुलना में किया जा सकता है। Endplate synaptophysin, ACHR और कई मांसपेशियों के लिए अन्तर्ग्रथनी ओवरलैप के क्षेत्र के लिए आधारभूत मूल्यों तालिका 1 में दिया जाता है। नमूना आकार जानवर की डिग्री पर निर्भर करेगाउपचार समूहों के भीतर -to-पशु विभिन्नता और (मानक विचलन प्रति नियंत्रण समूहों की तुलना में प्रयोगात्मक के लिए साधन में अंतर) प्रभाव आकार। विश्लेषण अच्छी गुणवत्ता की छवियों के लिए प्रतिबंधित है जब स्थिरता का एक उचित डिग्री नमूना स्वस्थ 2 महीने पुराने महिला C57Bl6J चूहों (चित्रा 6A और बी) के बीच endplate क्षेत्रों के लिए इसका मतलब है में पाया गया था। इस प्रकार, यह तीन चूहों 17,20,32 का एक नमूना आकार के साथ नियंत्रण की तुलना में, मरीजों कामला विरोधी कस्तूरी पॉजिटिव myasthenia से आईजीजी के साथ इंजेक्शन चूहों में synaptic क्षेत्र में उल्लेखनीय 30-40% कटौती प्रदर्शित करने के लिए संभव था। बुजुर्ग चूहों युवा चूहों 22 से endplate मापदंडों में अधिक से अधिक पशु-से-जानवर भिन्नता प्रदर्शित होता है। नतीजतन आयु वर्ग के चूहों से जुड़े प्रयोगों बड़ा नमूना आकार की आवश्यकता हो सकती है।

प्राथमिक चिंता का विषय तो एन चेहरा endplate लाभ और ऑफसेट स्तर सेटिंग्स के आकार को मापने के लिए है, तो हर व्यक्ति NMJ के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। व्यक्तिidual NMJs रोग राज्यों जांच कर रहे हैं, खासकर जब ACHR और synaptophysin धुंधला, की चमक में काफी भिन्न हो सकते हैं। इसके अलावा अतिरिक्त अन्तर्ग्रथनी (गैर विशिष्ट) प्रतिदीप्ति की तीव्रता स्वस्थ युवा जानवरों (चित्रा 5C और डी) के उन लोगों की तुलना में, अक्सर उच्च और उम्र बढ़ने जानवरों की मांसपेशियों में अधिक चर रहा है। अंतिम छवियों में बनाए रखा जाएगा कि तानवाला जानकारी को अधिकतम करने के लिए इतनी के रूप में 1-256 ग्रे पैमाने पर पूरी तरह से शोषण किया जाना चाहिए। यह लाभ का समायोजन शामिल है और एक z ढेर एकत्र किया जा रहा है जिसके लिए हर NMJ के लिए स्तरों भरपाई करेगा। चित्रा 5D तानवाला जानकारी के पूर्व और बाद के क्षेत्र की सीमाओं को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण हो सकता है, जहां एक NMJ छवि का एक उदाहरण से पता चलता है अन्तर्ग्रथनी विशेषज्ञताओं।

अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों का माप अलग मांसपेशी की तैयारियाँ और प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है। अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों के बारे में हमारी माप के अधिकांश तस्वीर से अनुदैर्ध्य cryosections कार्यरत है जमे हुए मांसपेशियों। निर्धारण करने से पहले पेशी बर्फ़ीली प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के प्रतिजनकता रखता है। जब पूर्व NMJ संरचना के बेहतर संरक्षण प्रदान कर सकते हैं (कदम 2.1) cryosectioning को प्रतिजन, paraformaldehyde के निर्धारण और सुक्रोज घुसपैठ के साथ संगत। इष्टतम संरचनात्मक संरक्षण paraformaldehyde के साथ हृदय छिड़काव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। ठंड और सेक्शनिंग की कलाकृतियों को पूरी तरह से निश्चित पेशी 21 से छेड़ा fascicles पर बरकरार मांसपेशियों और इमेजिंग NMJs की सतह पर लेबलिंग endplates से बचा जा सकता है। भले ही तैयारी की, नमूने, इमेजिंग और क्षेत्र quantitation के लिए प्रक्रियाओं (प्रोटोकॉल 4-5 कदम) अपरिवर्तित ही रहेंगे। अंधा नमूने, इमेजिंग और विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुरूप आवेदन काफी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य औसत मूल्यों (1 टेबल में चेंग एट अल। और त्से परिणामों की तुलना) में परिणाम कर सकते हैं, (विभिन्न ऑपरेटरों, चूहों और अलग अलग समय के विभिन्न नमूनों का प्रयोग करके)।

"> Endplates रोग राज्यों की एक किस्म में 'खंडित' बनने के रूप में वर्णित किया गया है। उदाहरण के लिए, माउस की मांसपेशियों, एक मांसपेशी फाइबर की छिटपुट अध: पतन उम्र बढ़ने में एक प्रकार की रोटी की तरह endplate ACHR पट्टिका के पुनर्गठन करने के परिणामस्वरूप (अपने उत्थान के बाद) छोटे कई ACHR समूहों 6 के रूप में। विरोधी कस्तूरी myasthenia से आईजीजी के साथ इंजेक्शन चूहों में, endplate का विखंडन नहीं बल्कि अलग रोगियों था GRAVIS। मोटे तौर पर छितरी endplate ACHR प्रकार की रोटी, छोटे (<4 मीटर 2) ACHR 'microaggregates की एक नक्षत्र के पीछे जा '20,21। ये दो उदाहरण प्रायोगिक पशुओं 21 बनाम नियंत्रण की endplates पर ACHR समूहों के लिए आकार वितरण की तुलना करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला।

अन्य तरीकों NMJ पर तीव्रता अन्तर्ग्रथनी क्षेत्र का आकलन करने या धुंधला करने के लिए सूचित किया गया है। यहां इस्तेमाल दो आयामी Z-प्रक्षेपण छवियों syn बहुत मूल्यवान समझना हो सकता है ताकि मोटर endplates कभी कभी तह किया जा सकताaptic क्षेत्रों में। पूर्ण अन्तर्ग्रथनी क्षेत्र 33 परिभाषित किया जाना चाहिए अगर तीन आयामी confocal पुनर्निर्माण और अधिक सटीक उपाय प्रदान हो सकता है। यहाँ वर्णित Z-प्रक्षेपण प्रोटोकॉल की एक प्रमुख लाभ, हालांकि, कई उपचार समूहों और संभावित परिवर्तनों के विश्वसनीय पहचान से मापा जा endplates की बड़ी संख्या की अनुमति दी है जो उसके रिश्तेदार सादगी है। endplate धुंधला तीव्रता की तुलना के लिए प्रोटोकॉल के कई अलग अलग अन्तर्ग्रथनी प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। विधि सभी नमूनों तो एक ही confocal सत्र के दौरान imaged इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए कार्रवाई कर रहे हैं कि आवश्यकता से, तथापि, सीमित है। Yampolsky एट अल। 5 के एक ताजा अध्ययन में इस सीमा को पार करने में मदद कर सकता है कि endplate ACHR घनत्व को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया। इस अध्ययन में, endplates के एक ही क्षेत्र में कई अलग अलग लेजर शक्ति सेटिंग्स पर imaged थे। लेजर शक्ति और rhodami के बीच के रिश्ते की ढलानNE-BGT प्रतिदीप्ति तीव्रता अलग चूहों 5 में endplates पर ACHR घनत्व में रिश्तेदार परिवर्तन का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि को एक लंबे समय तक अध्ययन के पाठ्यक्रम पर अलग अलग समय पर imaged नमूनों में ACHR तीव्रता की तुलना के लिए उपयोगी हो सकता है।

ACHR-ACHR झल्लाहट endplate AChRs के संगठन के बारे में विशिष्ट और पूरक जानकारी प्रदान करता है। 125 का उपयोग कर इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म autoradiography। मैं-α-BGT AChRs 10 4 मीटर का एक तलीय घनत्व के साथ मजबूती से पैक किया जा करने के लिए -2 तुरंत ट्रांसमीटर रिहाई के प्रत्येक प्रीसानेप्टिक साइट के अंतर्गत, आसपास झिल्ली infoldings ACHR 34 की बहुत कम घनत्व को शामिल करते हुए दिखाया गया है। ACHR-ACHR झल्लाहट यह अपेक्षाकृत आसान ACHR पैकिंग में (उप सूक्ष्म) परिवर्तन का पता लगाने के लिए बनाता है। झल्लाहट दक्षता में कमी औसत BGT प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन से नहीं पाया जा सकता है कि पोस्टअन्तर्ग्रथनी झिल्ली में AChRs की एक उप सूक्ष्म पुनर्वितरण को दर्शाता है। एकाधिक चअभिनेताओं झल्लाहट की दक्षता में एक परिवर्तन का कारण बन सकता है। ये दाता स्वीकर्ता रिक्ति और रिश्तेदार झुकाव है, साथ ही आणविक पर्यावरण 35,36 शामिल हैं। Endplate झल्लाहट दक्षता में कमी संभवतः ACHR जाली की ज्यामिति में एक परिवर्तन से पैदा हो सकता है। हालांकि, सबसे अधिक संभावना यह नैनो पैमाने पोस्टअन्तर्ग्रथनी आणविक जाली 14 में पैक कर रहे हैं कि AChRs के प्रतिशत में कमी की वजह से होगा।

मोटर न्यूरॉन्स और मांसपेशी फाइबर के बीच संबंध की हानि मोटर न्यूरॉन बीमारी में और गतिहीन उम्र बढ़ने 9,22,23 में मांसपेशियों में कमजोरी का तात्कालिक कारण हो रहा है। मापने NMJs के लिए साझा तरीकों और मापदंडों यह आसान विभिन्न अनुसंधान समूहों की तुलना और इसके विपरीत प्रकाशित निष्कर्षों के लिए करना चाहिए। विस्तृत प्रोटोकॉल (और उन पर भविष्य में सुधार) के बंटवारे यह रोग राज्यों में प्रभावित किया जा सकता है कि कैसे NMJ रखरखाव के तंत्र को समझने में प्रगति में तेजी लाने और मदद मिल सकती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
Neuromuscular जंक्शन: माप Synapse आकार, confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग Synaptic प्रोटीन घनत्व में विखंडन और परिवर्तन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter