The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Nevromuskulære krysset (NMJ) er den store, kolinerge relé synapse gjennom hvilke pattedyr motor nevroner styre frivillig muskel sammentrekning. Strukturelle endringer på NMJ kan resultere i nevrotransmisjon svikt, noe som resulterer i svakhet, atrofi og død av muskel fiber. Mange studier har undersøkt hvordan genetiske modifikasjoner eller sykdom kan endre strukturen av musen NMJ. Dessverre kan det være vanskelig å direkte sammenligne resultatene fra disse studiene fordi de ofte ansatt ulike parametere og analytiske metoder. Tre protokollene er beskrevet her. Den første bruker maksimal intensitet projeksjons konfokale bilder for å måle området av acetylkolin reseptor (AChR) -rike postsynaptiske membran domener på gavlen og arealet av synaptisk vesikkel farging i den overliggende presynaptiske nerveterminalen. Den andre protokollen sammenligner de relative intensiteter av farging for synaptiske proteiner i den postsynaptiske membranen. Den tredje protocol bruker fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) for å oppdage endringer i pakking av postsynaptiske AChRs på gavl. Protokollene har blitt utviklet og forbedret i løpet av en rekke studier. Faktorer som påvirker kvaliteten og konsistensen av resultatene blir diskutert og normative data er gitt for NMJs hos friske unge voksne mus.
Nevromuskulære krysset (NMJ) er den kritiske relé synapse som formidler kommunikasjon mellom nervesystemet og muskulatur. Det er nødvendig for all frivillig bevegelse. Fluorescens mikroskopi har lenge vært brukt til å studere effekter av transgener på musen NMJ 1-3 eller å sammenligne effektene av alder, kosthold, mosjon og sykdom på gnager NMJs 4-11. Slike studier har lært oss mye om fysiologi og patofysiologi av NMJ, men de ulike parametrene rapportert (f.eks AChR område, gavl areal, omkrets lengde, fragmentering indekser) ofte gjør det vanskelig å sammenligne resultatene av disse studiene. Det er et økende forventning for pre-kliniske forskere å være i stand til å demonstrere reproduserbarhet, særlig i studier med gnagermodeller av sykdommen 12. Protokollen beskrevet her ble videreutviklet gjennom en rekke studier som undersøkte utviklings, fysiologiske og patofysiologiske changes til NMJ. Slike studier krever måling av arealet av synaptiske fordypninger på mus motor gavl og den relative densitet for pakking av synaptiske proteiner i postsynaptiske fordypninger 13-15.
Anvendeligheten av disse fremgangsmåter er illustrert ved nylige studier i en musemodell av anti-moskus myasthenia gravis. Daglige injeksjoner av IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis pasienter i voksen mus fikk dem til å bli svak innen 2 uker 16. Konfokale maksimum-projeksjonsbilder av muskel seksjoner som ble dobbeltmerket for synaptophysin (i nerveterminaler og postsynaptisk) AChRs viste en progressiv nedgang i det område i AChR farging som den primære endring. Viktigere nedgangen var tilstrekkelig til å forklare sammenlign fall i amplitude av synaptiske potensialer, svikt i synaptisk transmisjon og muskelsvakhet 17,18. Kvalitativt lignende funn ble rapportert av andre forskningsgrupper10,19. De samme NMJ målemetoder har siden blitt brukt til å vurdere effekten av tre medikamenter for behandling av anti-Musk myasthenia gravis i denne musemodell 20,21.
Stillesittende aldring kan føre til tap av nevromuskulære forbindelser. Protokollen beskrevet her har avdekket en aldersrelatert nedgang i området av nerve terminal synaptophysin på motoriske endeplater som mus avanserer inn i alderdommen. De samme metoder viste at frivillig trening kan i stor grad forhindre reduksjonen i presynaptiske nerveterminalen område 22, i samsvar med tidligere arbeider av andre grupper 4. Tap av nevromuskulære forbindelser oppstår også i SOD1G93A musemodell for amyotrofisk lateral sklerose 9,23.
Studiene som er nevnt ovenfor viser at en rekke helsetilstander kan føre til reduksjoner i området av enten pre- eller post-synaptiske spesialiseringer på NMJ. Dette kan føre til svekket synaptic moroDette skjer eller kan innvarsle fullstendig tap av den nevromuskulære forbindelsen. Tre protokollene er beskrevet som tillater kvantifisering av området og tetthet av synaptiske spesialiseringer. Formålet med den første protokoll er å tilveiebringe en praktisk og reproduserbart mål på de områdene av pre- og post-synaptiske fordypninger og deres innretting i pattedyr NMJs, ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Todimensjonale maksimal projeksjon konfokale bilder og bildeanalyse med NIH ImageJ brukes til å oppdage endringer i området av synaptophysin flekker (synaptiske vesikler), postsynaptiske AChRs og synaptisk overlapping området. Konfokale bildeparametre (gain og offset nivå) er optimalisert for hver NMJ slik som å maksimere den visuelle informasjonen som brukes til å skjelne det området av synaptiske spesialisering. Neuromuskulær svikt kan også være et resultat av endringer i tettheten av postsynaptiske AChR og / eller andre synaptiske proteiner. Den andre protokollen kan bli anvendt for å detektere endringer i den relative tettheten av postsynaptiske proteiner slikesom Musk, RapSyn, dystroglycan, fosforylert Src kinase og fosforylert AChR 18,21.
I myasthenia gravis, er en redusert tetthet av AChR innenfor den postsynaptiske membranen den umiddelbare årsaken til synaptiske svikt og muskelsvakhet. Den tredje protokollen beskriver en fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) metode for å vurdere endringer i nærhet av tilstøtende AChRs innenfor postsynaptiske membraner 14,15. Denne metoden registrerer energioverføring mellom nabo AChRs merket med fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET skjer bare når de fluorescerende donor og akseptor probene er mindre enn 10 nm fra hverandre. Dette kan avsløre (submikroskopiske) endringer i tetthet av AChR pakking som kan ha direkte relatert til amplitude av synaptiske potensialer.
Disse tre protokoller, raffinerte det siste tiåret, gi utfyllende tiltak av NMJ integritet i en konsekvent og reproduserbar måte. Bruk av standardiserte protokoller ennd parametere bør legge til rette for sammenligning av effektene av gener og miljø intervensjoner ved pattedyr NMJ.
Protokollen beskrevet her har gjort oss i stand til å pålitelig måle og kvantifisere endringer i egenskapene til NMJ tvers av en rekke forhold, blant annet normal aldring og sykdomstilstander. Metodene som er beskrevet for en ansikt NMJ bilder vil tillate forskere å sammenligne området av pre- og postsynaptiske spesialiseringer og arealet av synaptiske overlapping / justering. For å sammenligne den relative intensiteten av pre- og postsynaptiske proteiner i andre protokoll, som bruker optiske tverrgående seksjone…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
Zeiss | LSM 510 Meta | ||
Leica | SPE-II | ||
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |