Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
Nevromuskulære krysset (NMJ) er den store, kolinerge relé synapse gjennom hvilke pattedyr motor nevroner styre frivillig muskel sammentrekning. Strukturelle endringer på NMJ kan resultere i nevrotransmisjon svikt, noe som resulterer i svakhet, atrofi og død av muskel fiber. Mange studier har undersøkt hvordan genetiske modifikasjoner eller sykdom kan endre strukturen av musen NMJ. Dessverre kan det være vanskelig å direkte sammenligne resultatene fra disse studiene fordi de ofte ansatt ulike parametere og analytiske metoder. Tre protokollene er beskrevet her. Den første bruker maksimal intensitet projeksjons konfokale bilder for å måle området av acetylkolin reseptor (AChR) -rike postsynaptiske membran domener på gavlen og arealet av synaptisk vesikkel farging i den overliggende presynaptiske nerveterminalen. Den andre protokollen sammenligner de relative intensiteter av farging for synaptiske proteiner i den postsynaptiske membranen. Den tredje protocol bruker fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) for å oppdage endringer i pakking av postsynaptiske AChRs på gavl. Protokollene har blitt utviklet og forbedret i løpet av en rekke studier. Faktorer som påvirker kvaliteten og konsistensen av resultatene blir diskutert og normative data er gitt for NMJs hos friske unge voksne mus.
Introduction
Nevromuskulære krysset (NMJ) er den kritiske relé synapse som formidler kommunikasjon mellom nervesystemet og muskulatur. Det er nødvendig for all frivillig bevegelse. Fluorescens mikroskopi har lenge vært brukt til å studere effekter av transgener på musen NMJ 1-3 eller å sammenligne effektene av alder, kosthold, mosjon og sykdom på gnager NMJs 4-11. Slike studier har lært oss mye om fysiologi og patofysiologi av NMJ, men de ulike parametrene rapportert (f.eks AChR område, gavl areal, omkrets lengde, fragmentering indekser) ofte gjør det vanskelig å sammenligne resultatene av disse studiene. Det er et økende forventning for pre-kliniske forskere å være i stand til å demonstrere reproduserbarhet, særlig i studier med gnagermodeller av sykdommen 12. Protokollen beskrevet her ble videreutviklet gjennom en rekke studier som undersøkte utviklings, fysiologiske og patofysiologiske changes til NMJ. Slike studier krever måling av arealet av synaptiske fordypninger på mus motor gavl og den relative densitet for pakking av synaptiske proteiner i postsynaptiske fordypninger 13-15.
Anvendeligheten av disse fremgangsmåter er illustrert ved nylige studier i en musemodell av anti-moskus myasthenia gravis. Daglige injeksjoner av IgG fra anti-Musk-positive myasthenia gravis pasienter i voksen mus fikk dem til å bli svak innen 2 uker 16. Konfokale maksimum-projeksjonsbilder av muskel seksjoner som ble dobbeltmerket for synaptophysin (i nerveterminaler og postsynaptisk) AChRs viste en progressiv nedgang i det område i AChR farging som den primære endring. Viktigere nedgangen var tilstrekkelig til å forklare sammenlign fall i amplitude av synaptiske potensialer, svikt i synaptisk transmisjon og muskelsvakhet 17,18. Kvalitativt lignende funn ble rapportert av andre forskningsgrupper10,19. De samme NMJ målemetoder har siden blitt brukt til å vurdere effekten av tre medikamenter for behandling av anti-Musk myasthenia gravis i denne musemodell 20,21.
Stillesittende aldring kan føre til tap av nevromuskulære forbindelser. Protokollen beskrevet her har avdekket en aldersrelatert nedgang i området av nerve terminal synaptophysin på motoriske endeplater som mus avanserer inn i alderdommen. De samme metoder viste at frivillig trening kan i stor grad forhindre reduksjonen i presynaptiske nerveterminalen område 22, i samsvar med tidligere arbeider av andre grupper 4. Tap av nevromuskulære forbindelser oppstår også i SOD1G93A musemodell for amyotrofisk lateral sklerose 9,23.
Studiene som er nevnt ovenfor viser at en rekke helsetilstander kan føre til reduksjoner i området av enten pre- eller post-synaptiske spesialiseringer på NMJ. Dette kan føre til svekket synaptic moroDette skjer eller kan innvarsle fullstendig tap av den nevromuskulære forbindelsen. Tre protokollene er beskrevet som tillater kvantifisering av området og tetthet av synaptiske spesialiseringer. Formålet med den første protokoll er å tilveiebringe en praktisk og reproduserbart mål på de områdene av pre- og post-synaptiske fordypninger og deres innretting i pattedyr NMJs, ved hjelp av fluorescens mikroskopi. Todimensjonale maksimal projeksjon konfokale bilder og bildeanalyse med NIH ImageJ brukes til å oppdage endringer i området av synaptophysin flekker (synaptiske vesikler), postsynaptiske AChRs og synaptisk overlapping området. Konfokale bildeparametre (gain og offset nivå) er optimalisert for hver NMJ slik som å maksimere den visuelle informasjonen som brukes til å skjelne det området av synaptiske spesialisering. Neuromuskulær svikt kan også være et resultat av endringer i tettheten av postsynaptiske AChR og / eller andre synaptiske proteiner. Den andre protokollen kan bli anvendt for å detektere endringer i den relative tettheten av postsynaptiske proteiner slikesom Musk, RapSyn, dystroglycan, fosforylert Src kinase og fosforylert AChR 18,21.
I myasthenia gravis, er en redusert tetthet av AChR innenfor den postsynaptiske membranen den umiddelbare årsaken til synaptiske svikt og muskelsvakhet. Den tredje protokollen beskriver en fluorescens Resonance Energy Transfer (FRET) metode for å vurdere endringer i nærhet av tilstøtende AChRs innenfor postsynaptiske membraner 14,15. Denne metoden registrerer energioverføring mellom nabo AChRs merket med fluorescerende-α-bungarotoxin (BGT). FRET skjer bare når de fluorescerende donor og akseptor probene er mindre enn 10 nm fra hverandre. Dette kan avsløre (submikroskopiske) endringer i tetthet av AChR pakking som kan ha direkte relatert til amplitude av synaptiske potensialer.
Disse tre protokoller, raffinerte det siste tiåret, gi utfyllende tiltak av NMJ integritet i en konsekvent og reproduserbar måte. Bruk av standardiserte protokoller ennd parametere bør legge til rette for sammenligning av effektene av gener og miljø intervensjoner ved pattedyr NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her har gjort oss i stand til å pålitelig måle og kvantifisere endringer i egenskapene til NMJ tvers av en rekke forhold, blant annet normal aldring og sykdomstilstander. Metodene som er beskrevet for en ansikt NMJ bilder vil tillate forskere å sammenligne området av pre- og postsynaptiske spesialiseringer og arealet av synaptiske overlapping / justering. For å sammenligne den relative intensiteten av pre- og postsynaptiske proteiner i andre protokoll, som bruker optiske tverrgående seksjone…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
References
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
- Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
- Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
- Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
- Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
- Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
- Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
- Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
- Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
- Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
- Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
- Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
- Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
- Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
- Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
- Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
- Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
- Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
- Shimizu, S., Hedrich, H. J., Bullock, G. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. , (2004).
- Chiasson, R. B. . Laboratory anatomy of the white rat. , (1988).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
- Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
- Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
- Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
- Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
- Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
- Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
- Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
