Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

doi: 10.3791/52220 Published: December 26, 2014

Abstract

Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är den stora, kolinerga relä synaps genom vilket däggdjurs motoriska nervceller styr frivilliga muskelsammandragning. Strukturella förändringar på NMJ kan resultera i neurotransmission misslyckande, vilket resulterar i svaghet, atrofi och även död av muskelfibrer. Många studier har undersökt hur genetiska modifieringar eller sjukdom kan förändra strukturen av musen NMJ. Tyvärr kan det vara svårt att direkt jämföra resultat från dessa studier, eftersom de ofta används olika parametrar och analytiska metoder. Tre protokoll beskrivs här. Den första använder maximal intensitet projektion konfokala bilder för att mäta området av acetylkolinreceptorn (AChR) -rika postsynaptiska membrandomäner vid ändskivan och området av synaptisk vesikel färgning i den överliggande presynaptiska nervänden. Det andra protokollet jämför de relativa intensiteterna av immunfärgning för synaptiska proteiner i det postsynaptiska membranet. Den tredje protocol använder fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) för att detektera förändringar i packningen av postsynaptiska AChRs vid ändplattan. Protokollen har utvecklats och förfinats under en rad studier. Faktorer som påverkar kvaliteten och samstämmigheten i resultaten diskuteras och normativa data tillhandahålls för NMJs i friska unga vuxna möss.

Introduction

Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är den kritiska relä synapsen som förmedlar kommunikationen mellan nervsystemet och skelettmuskulaturen. Det krävs för alla frivilliga rörelser. Fluorescensmikroskopi har länge använts för att studera effekterna av transgener på musen NMJ 1-3 eller att jämföra effekterna av ålder, kost, motion och sjukdom vid gnagare NMJs 4-11. Sådana studier har lärt oss mycket om fysiologi och patofysiologi NMJ, men de olika parametrarna rapporterades (t.ex. AChR område, ändskivans area, omkrets längd, fragmenteringsindex) ofta gör det svårt att jämföra resultaten från dessa studier. Det finns ett ökande förväntan för prekliniska forskare kunna påvisa reproducerbarhet, särskilt i studier med gnagare modeller av sjukdomen 12. De protokoll som beskrivs här har förfinats genom en rad studier som undersökt utvecklings, fysiologiska och patofysiologiska lmAnges till NMJ. Sådana studier kräver mätning av området med synaptiska inriktningar på musen motorändplattan och den relativa densiteten av packning av synaptiska proteiner inom postsynaptiska inriktningar 13-15.

Användbarheten av dessa metoder illustreras av nyligen genomförda studier i en musmodell av anti-MuSK myasthenia gravis. Dagliga injektioner av IgG från anti-mysk positiva myasthenia gravis patienter till vuxna möss fick dem att bli svag inom 2 veckor 16. Konfokala maximal projektionsbilder av muskelsektioner som dubbel märkta för synaptofysin (i nervterminaler) och postsynaptiska AChRs avslöjade successivt minskade inom AChR färgning som den primära förändringen. Viktigt nedgången var tillräcklig för att förklara jämförbara minskningar i amplituden av synaptiska potentialer, fel på synaptisk transmission och muskelsvaghet 17,18. Kvalitativt liknande fynd rapporterades av andra forskargrupper10,19. Samma NMJ mätmetoder har sedan använts för att bedöma effekten av tre läkemedel för behandling av anti MuSK myasthenia gravis i denna musmodell 20,21.

Stillasittande åldrande kan leda till förlust av neuromuskulära anslutningar. De protokoll som beskrivs här har avslöjat en åldersassocierade nedgång inom nervändsluten synaptofysin vid motor ändplattor som möss utvecklas i hög ålder. Samma metoder avslöjade att frivillig träning i stort sett skulle kunna hindra minskningen av presynaptiska nervterminalområde 22, i linje med tidigare arbeten av andra grupper 4. Förlust av neuromuskulära kopplingar förekommer också i SOD1G93A musmodell av amyotrofisk lateralskleros 9,23.

Studierna som nämns ovan visar att en mängd olika hygienkrav kan leda till minskningar i området antingen före eller efter synaptiska inriktningar på NMJ. Detta kan resultera i försämrad synaptiska kulInsatser eller kan förebåda total förlust av den neuromuskulära anslutningen. Tre protokoll beskrivs som tillåter kvantifiering av området och densiteten av synaptiska inriktningar. Syftet med det första protokollet är att ge en praktisk och reproducerbart mått områdena före och postsynaptiska inriktningar och deras anpassning till däggdjurs NMJs, med hjälp av fluorescens mikroskopi. Tvådimensionella maximala projektions konfokala bilder och bildanalys med NIH ImageJ används för att upptäcka förändringar i området synaptofysin färgning (synaptiska vesikler), postsynaptiska AChRs och synaptic överlappning området. Konfokala avbildningsparametrar (gain och offset nivå) är optimerade för varje NMJ för att maximera den visuella information som används för att urskilja området synaptiska specialisering. Neuromuskulär misslyckande kan också bero på förändringar i tätheten av postsynaptiska AChR och / eller andra synaptiska proteiner. Den andra protokollet kan tillämpas för att upptäcka förändringar i den relativa tätheten av postsynaptiska proteiner sådanasom mysk, RapSyn, dystroglycan, fosforyleras Src kinas och fosforyleras AChR 18,21.

I myasthenia gravis, är en reducerad densitet av AChR inom det postsynaptiska membranet den omedelbara orsaken till synaptiska misslyckande och muskelsvaghet. Den tredje protokoll beskriver en Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) metod för att bedöma förändringar i närheten av intilliggande AChRs inom postsynaptiska membran 14,15. Denna metod upptäcker energiöverföring mellan grann AChRs märkta med fluorescerande-α-bungarotoxin (BGT). FRET sker endast när de fluorescerande donator- och acceptor-prober är mindre än 10 nm från varandra. Detta kan avslöja (submikroskopiska) förändringar i täthet AChR packning som direkt kan avse amplituden av synaptiska potentialer.

Dessa tre protokoll, raffinerade under det senaste decenniet, ger kompletterande åtgärder av NMJ integritet i en konsekvent och reproducerbart sätt. Användning av standardiserade protokoll and parametrar bör underlätta jämförelser av effekterna av gener och miljö ingripanden vid däggdjur NMJ.

Protocol

OBS: Design, genomförande och rapportering av djurförsök bör ta hänsyn till gällande riktlinjer 24. Sådant arbete måste godkännas i förväg av den lokala djurskyddsmyndigheten (i vårt fall Animal etikkommitté vid universitetet i Sydney).

1. Eutanasi av djur och Muscle Dissection

  1. Överför musen från anläggningen rum till ett separat rum där den avlivas med en intraperitoneal injektion av pentobarbiton lösning (30 mg / kg) med hjälp av hanterings musen metoden beskrivs av Shimizu 25. Placera musen tillbaka i sin bur.
  2. När andningen av musen har slutat för mer än 1 minut, testa mul- tillbakadragande reflex genom att försiktigt klämma foten, och hornhinnans reflexen genom att lätt borsta hornhinnan. Först när reflexsvar är frånvarande kan musen förberedas för dissekering.
  3. Rådfråga en atlas över gnagare anatomi som Chiasson 26 och / eller söka hjälp av en experienced anatom innan dissekering av muskeln av intresse. I varje fall ta bort hår från överliggande huden med hjälp av en liten elektrisk rakapparat innan du öppnar huden att exponera muskeln.
    OBS: Den dissektion kommer att skilja sig för varje anatomiskt distinkt muskel.
  4. Använda trubbig pincett befria muskler från överliggande membran och omgivande vävnader. Tag och skär den distala senan att separera muskler från dess insättning.
  5. Försiktigt retas och klipp muskeln fri från omgivande vävnad rätt till sitt ursprung. Placera korthet den nyligen dissekerade muskeln i 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning eller Ringer-lösning före ytterligare behandling.

2. Förbereda Muscle för cryosectioning

OBS: Optimal strukturell konservering kan uppnås genom hela djuret perfusion som det beskrivits tidigare 27, eller nedsänkning fixering (för små muskler) såsom beskrivs i det valfria steget 2.1. Emellertid4% paraformaldehyd fixering kan försämra efterföljande färgning med många sonder antikropps och med fluorescerande-BGT. Glutaraldehyd särskilt bör undvikas. Om musklerna inte skall fastställas måste de omedelbart snap frysas (fortsätt till 2,3).

  1. Valfri nedsänkning fixering: Pin muskeln att vaxet i en petriskål vid vila längd. Täck muskeln med 2% vikt / volym paraformaldehyd (nyligen upplöst i PBS) under 2 h vid RT. Tvätta den med tre byten av PBS över 30 min (3 X 10 min) därefter ersätta PBS med 30% vikt / volym sackaros i PBS och inkubera O / N vid 4 ° C.
  2. Gör formar ("båtar") i förväg genom vikning 2 cm x 1,5 cm bitar av aluminiumfolie såsom visas i figur 1. Placera en bit nitrocellulosamembran i botten av båten. Häll försiktigt kryostat bädda matrix (Material tabell) i båten till ett djup av 2 mm, var noga med att undvika luftbubblor. Placera muskeln i båten, rikta in den med kulspetspenna linjer pånitrocellulosan. Lägg mer inbäddning matrisen så att helt täcka muskeln (Figur 1).
  3. Pre-label polypropenrör med ett outplånligt markör. Placera en droppe vatten i varje rör och kyla röret i flytande kväve.
    OBS: Den frusna vattendroppe håller ångtrycket och förhindrar uttorkning under långvarig -80 ° C lagring
  4. Med användning av en ansiktsmask, tjocka skyddshandskar och en stor par trubbig pincett, delvis sänka en liten metallbägare (3 cm diameter, 8 cm djup) innehållande 2 cm djup av isopentan i en behållare med flytande kväve under 30 sek. Ta bort bägaren och placera den på bänken toppen. Med hjälp av en mindre par trubbig pincett placera formen innehåller muskeln och bädda matris i kylt isopentan. Var noga med att undvika flytande kväve blandning med isopentan.
  5. Låt 2 min för blocket att frysa helt innan du använder trubbig pincett för att lyfta det frusna blocket ut och försegla den i rätt pre-märkta och förkylt rör (steg 2.3).
  6. Förvara rören tillfälligt i flytande kväve före överföring till -80 ° C. Logga alla prover i ett kalkylblad med frysinnehåll.

3. cryosectioning och Fluorescens färgning för En Face Bilder av NMJs

  1. Skala bort den aluminiumform. Inom -20 ° C kryostat kammare fästa det frysta blocket till kryostaten chucken så att den skär 20 ^ m kryosnitt parallella med den långa axeln på muskelfibrerna (Figur 1). Plocka upp avsnitten om poly-L-lysin eller gelatinbelagda objektglas.
  2. OBS: hoppa över detta steg om vävnaden fixeras före frysning. Efter att 30 min för snitten torka på bilderna, fixa dem genom att placera en droppe 2% paraformaldehyd i PBS över varje avsnitt i 15 min vid RT.
  3. Tvätta objektglasen 3 x 10 min i PBS i ett Coplin-kärl, och sedan doppa objektglasen i PBS innehållande 0,1 M glycin för 30 min för att blockera kvarvarande aldehydgrupper.
  4. Tvätta diabilder i 10 min i PBS, sedan doppa i metanol (kyld till -20 ºC) under 7 min. Denna permeabilization steg är en rutinmässig del av dubbel märkning med fluorescerande-BGT och anti-synaptofysin men det kan påverka immunfärgning för vissa andra proteiner.
  5. Tvätta diabilder 2 x 10 min i PBS sedan placera varje bild i en stabil och planade fuktig kammare. Omedelbart täcka varje sektion med 20 | il blockeringslösning (0,2% Triton X-100, 2% bovint serumalbumin (BSA) i PBS) under 1 h vid RT. Sektioner får inte torka ut i något skede av immunfärgning processen.
  6. Utför den primära inkubation: Ta en bild i taget försiktigt bort överflödigt blockerande lösningen från över varje sektion och ersätta det med 20 pl kanin anti-synaptofysin (utspädd 1: 200 i blockerande lösningen).
  7. Inkludera en negativ-kontrollreglage som ska inkuberas med endast blockerande lösningen. Denna "no-primär antikroppskontroll"Är viktigt i varje immunfärgning körning.
  8. Ta hand om att den primära antikroppen förblir på plats över varje avsnitt, stäng fuktig kammare och inkubera i 1-2 dagar vid 4 ºC.
  9. Inspektera varje avsnitt för att bekräfta att den primära antikroppen förblir på plats. Använd en pasteurpipett att försiktigt skölja varje bild med PBS och placera den i en Coplin burk. Tvätta alla sliderna 3 x 10 min i PBS.
  10. Utför sekundära inkubation. Att ta en bild i taget, försiktigt bort överflödigt PBS, lägg det i fuktig kammare och täcker varje avsnitt med 20 ul av en blandning innehållande FITC-konjugerad åsna anti-kanin-IgG och BGT konjugerat till tetrametylrodamin eller annan röd fluorofor (TRITC- / redBGT; 5 g / ml) utspätt i blockeringslösning. Inkubera vid rumstemperatur under 2 h.
  11. Tvätta diabilder 3 x 10 min i PBS i Coplin burkar.
  12. Att ta en bild i taget, försiktigt bort överflödigt PBS och montera med en täck använder en minimal volym, glycerol-baserade, fade-motstånd monteringsmedel. Täta kanterna på täckglas med klar nagellack. Låt det torka hårt.
  13. Förvara bilderna i mörker vid 4 ° C i upp till en vecka, eller vid -20 ºC för längre lagringstider (upp till flera månader).

4. Objektiv Provtagning och En Face avbildning av Motor ändplattor

  1. Blind bilderna genom att märka varje bild med ett slumpmässigt kodnummer som bara förblir känt till en andra forskare (inte inblandad i analysen). Som ett resultat operatören förblir blind för behandlingsgrupper tills kvantifiering av NMJ parametrar är klar för alla prover.
  2. Placera bilden på mikroskop scenen och visa den under brett fält belysning med TRITC filteruppsättningen (63X olja 1,3 NA mål). Flytta progressivt (fält för fält) från vänster till höger och tillbaka tills en ändplatta visas i fältet (Figur 2A).
    OBS: Provtagning kriterium: Varje AChR-färgade struktur som är relativtplatt och vetter mot målet (dvs. sträcker <15 m i z-dimensionen) anses vara en ändplatta och avbildas för analys (halvmånar av AChR färgning representerar tvärsnitt genom ändplattor och är därför undantagna).
  3. Med den konfokala hål uppsättningen till 1,0 Airy enhet och låg lasereffekt optimera förstärkning och offset nivåer för TRITC / röd-BGT (532 nm laser) vid ändskivan som skall avbildas. Nästa optimera FITC / synaptofysin fluorescens med hjälp av 488 nm laser. Samla ett z-bunt med gaveln med en 0,7 ìm intervall mellan varje optisk skiva. Spara bilderna med ett filnamn som innehåller datum för avbildning session, kodnamnet på bilden och antalet ändplattan.
    OBS: De skannar med hjälp av 488 nm och 532 nm lasrar (FITC och TRITC) bör samlas sekventiellt (ej samtidigt) för att undvika förorening av FITC kanalen genom fluorescens från röda fluoroforen och vice versa (genomblödning).
  4. Upprepa provtagning and avbildning av stegen 4,2-4,3 tills 20 ändplattor samlas från bilden / prov.
  5. Byt till nästa kodade bilden och upprepa 4,2-4,4. Upprepa detta för varje kodade diabilder.
  6. Samla några bilder av ändplattor från kontroll slide (ingen primär antikroppskontroll) med konfokala inställningar som hittades optimala för de experimentella diabilder (FITC fluorescens kanalen ska visas mörk).
  7. I slutet av den konfokala session överföringen bildfilerna till en annan dator och säkerhetskopiera originalfilerna på en extern hårddisk eller server.

5. Att mäta området med Synaptic specialiseringar i En Face Images

  1. Använd NIH ImageJ freeware (http://imagej.nih.gov/ij/) att förbereda maximal projektion (MIP) bilder från varje z-stack. Spara dem som TIFF-filer (Figur 2A & B). Filnamn bör innehålla datum bildsession, exempelkod, ändplattan nummer och fluorescerande kanal (t.ex. 060414_5723_7_FITC.tiff).
  2. Öppna z-projektion bild i ImageJ. Välj acetylkolinreceptorn bildkanalen (Figur 3A) och välj: Bild> Skriv> 8-bit för att omvandla 24-bitars RGB färgade bilden i tre 8-bitars gråskalebilder på skärmen.
  3. Använda ImageJ polygonverktyget dra en grov kontur runt ändplattan intresse för redBGT färgas (ACHR) kanal så att det omfattar alla uppenbara färgade regioner i viss individ ändplattan, samtidigt utesluta någon färgning som inte härrör från ändplattan av intresse ( Figur 3C).
  4. Applicera en minsta ljusstyrka tröskel till bilden genom att välja: Bild> Justera> Tröskel (Figur 3E och tillhörande ImageJ skärmdumpar).
  5. Justera tröskelnivån för att isolera de AChR-färgade delarna samtidigt exklusive omgivande bakgrundssignal som under gränsvärdena (figur 3E). Öppna en andra vindow med originalet (kontinuerliga toner) bilden omedelbart bredvid fönstret för jämförelse, för att underlätta beslutet om tröskelvärdet. Spela tröskelvärdet för senare användning i colocalization analyser.
  6. Att behålla polygonen kontur runt ändplattan väljer: Analysera> Analysera Partiklar. I snabbmenyn ange olika storlekar som: 50 till oändlighet pixlar (detta eliminerar små artefakter som uppstår elektriska störningar i fotomultiplikatorn).
  7. Analysera Partiklar kommandot genererar ett fönster med en lista av diskreta supra-tröskelområden och deras fluorescensintensitetsvärdena numrerade som de visas i den binära bilden (Figur 3G och tillhörande ImageJ skärmdump). Kopiera dessa data till en märkt kalkylblad.
  8. Mät Total ändplattan området (område inom polygon) genom att välja: Analysera> Mät. Detta ger den totala ändskivan området. Kopiera och klistra in data för AChR områden och intensiteter inett kalkylblad och se till att märka kolumner lämpligt, kommer raderna att användas för enskilda ändplattor för specifika diabilder.
  9. Växla till den anti synaptofysin fluorescens kanal och upprepa steg 5,1-5,5, men för FITC kanalen (Figur 3B, D och F). Syftet är att justera tröskeln, så att det skapar en binär bild som, så nära som möjligt, matchar gränserna för färgning såsom de uppfattas av ögat. Anteckna tröskelvärde.
  10. Mät området för överlappning genom tillämpning av följande steg: Öppna originalfilen som innehåller de två kanalbilder och dela den i två separata bilder genom att välja: Bild> Staplar> Stapla till bilder.
  11. Använda colocalization plugin (hämtas och installeras från ImageJ webbsidan) Välj: pluggin> colocalization och ingångströskelvärdena tidigare inspelad för AChR och nervkanalerna i respektive kanal fråge boxe. Detta kommer att ge en överlappning bild i vita pixlar (Figur 3H och tillhörande ImageJ skärmdumpar).
  12. Konvertera den nyskapade överlappningsbild till ett gråskala format och tillämpar ett tröskelvärde till maxvärdet. Den maximala tröskeln bara väljer ut de vita pixlar, vilket motsvarar överlappningsområdet av de två tidigare kanalerna. Rekord i kalkylbladet den resulteområdet värdet av "colocalization", som representerar det område av överlappning i pixlar.
  13. Förbered ett kalkylblad dataurvalsmedelvärden, beräkna och rita standardavvikelser och standardfel som histogram eller scatterplots 20,22. Observera att värdet på n representerar vanligen antalet möss per prov grupp för statistiska ändamål.
  14. Plot gavel AChR områden som scatterplots eller frekvens histogram för att avgöra om uppgifterna är normalfördelad innan statistisk testning (Figur 6).

6. Relativ FärgningIntensiteter jämfördes med användning av transversella optiska Sektioner

OBS: För denna protokollprocess alla muskelprover tillsammans och bild i en enda konfokala session. Vid planeringen ett experiment tillåter upp till 30 min imaging tid per muskelprov.

  1. Skär 15 um kryosnitt tvärs den långa axeln av muskelfibrer och samla på objektglas, såsom beskrivits vid steg 3.1.
  2. Utför fluorescens färgning som beskrivs i steg från 3,2 till 3,13.
  3. Kod de färgade diabilder så att avbildning och analyser genomförs med operatören blind för behandlingsgruppen, som beskrivs i steg 4.1.
  4. Med hjälp av en 40X fluorescens mål (NA 0,75) kort blicka ett avsnitt från varje bild för att bestämma en enda förstärkning och offset inställning för AChR nivå som kommer att vara lämpliga för alla muskeländplattorna över alla provglas. Den ljusaste ändskiva bör då vara strax under 256 grå på skalan. Denna optimering bör göras separat för den andra fluorescence-kanal (samlas successivt). Anteckna fast förstärkning och offset nivåinställningarna och inte ändrar dem under hela avbildning session.
  5. Samla bilder av en fluorescens standardbana (t.ex. icke-blek fluorescerande pärlor), med samma parametrar, i början och slutet av konfokala session för att upptäcka eventuella fluktuationer i laserintensitet.
  6. Använd AChR kanal för att skanna bilden gradvis att lokalisera ändplattor.
  7. Fokus för att hitta den enda optisk sektionen plan i varje mikroskopfält som innehåller flest AChR-färgade ändplattor.
  8. Skanna den här enda optisk avsnitt två gånger och spara i genomsnitt bilden (Figur 4G).
  9. Att hålla samma fokalplanet byta till den andra fluorescenskanalen (protein av intresse) och samla bilden som i steg 6.8. Spara bildfilen, bland annat i filnamnet: datum för bildsession, exempelkod, bildnummer och en symbol för att ange den fluorescerande kanalen. F visar exempel på ändskivans fördelningen AChR jämfört med RapSyn, mysk eller -dystroglycan (-DG).
  10. Flytta scenen till nästa fält som innehåller ett eller flera ändplattor och upprepa steg 6,8-6,9. Upprepa detta tills totalt 60 gavlar är avbildade.
  11. I slutet av bildsession överföringen alla filer till en annan dator och säkerhetskopiera dem.
  12. Öppna varje originalbildfilen och medan du tittar på AChR kanalen väljer: Bild> Staplar> Stapla till bilder, att dela kanaler.
  13. Välj: Bild> typ> 8bit att konvertera till 8-bitars gråskala format på skärmen. Gör detta för båda fluorescens kanaler.
  14. Välj: Bild> Stacks> Bilder att stapla. Öppna en ny bunt från två tidigare åtskilda 8-bitarsbilder. Man kan sedan växla bekvämt mellan de två fluorescenskanaler inom enda fönster.
  15. Använd verktyget Polygon att dra en line tätt runt gränsen av AChR färgning (Figur 4I).
  16. Välj: Analysera> Mät för att mäta den genomsnittliga pixelintensiteten för AChR inom inhägnat område (observera vikten av att dra linjen hårt). Kopiera detta värde till en märkt kalkylblad.
  17. Att behålla samma polygon kontur (att definiera det område som ska mätas), växla till den andra fluorescerande kanalen (t.ex. figur 4B, D, F) och väljer: Analysera> mått. Detta kommer att ge den genomsnittliga färgningsintensitet för proteinet av intresse i den synaptiska område som definieras av AChR färgning.
  18. Välj ett område från synliga ändskivans färgning välj sedan: Analysera> Mät för att mäta den genomsnittliga bakgrundsfluorescensintensiteten. Upprepa detta för den andra fluorescenskanalen / s och kopiera bakgrundsvärdena i kalkylblad med fluorescensvärden.
  19. Subskriftar de genomsnittliga bakgrundsvärden från gavelvärden för att få de korrigerade intensiteter för AChR och proteinet av intresse vid varje ändplatta.
  20. Dividera de korrigerade ändskivan intensitetsvärdena för proteinet av intresse genom den korrigerade BGT fluorescensintensiteten för att ge de fluorescensintensitetsförhållanden 14,21

7. Jämföra postsynaptiska membranet AChR Densitet Använda FRET

NOTERA: Detta protokoll bedömer i vilken utsträckning AChRs är tätt packade (<10 nm mellanrum) i det postsynaptiska membranet. Den exakta donator och acceptor fluoroforen kombinationen är kritiskt för denna FRET-analysen. Namn och uppgifter om fluoroforema ges i tabellen Materials. Deras spektrala egenskaper, i förhållande till FRET, diskuteras i våra tidigare papper 14,15.

  1. Förbered fasta tvärgående kryosnitt som beskrivs i avsnitt 6.1. Alla provgrupper måste bearbetas tillsammans och bildd i samma konfokala session.
  2. Blanda 2,5 g / ml röd-BGT (FRET donator) med 10 g / ml bortre röda-BGT (FRET acceptor) med blockeringslösning i ett litet plaströr genom pipettering upp och ner 12 gånger. Detta 1: 4 molär blandning maximerar effektiviteten hos FRET 14.
  3. Placera varje bild i en fuktig kammare, noggrant täcka varje sektion med en droppe (12 pl) av den ovan angivna blandningen och inkubera i 1,5 h vid RT.
  4. Kontroll avsnitt: täcka litet antal sektioner med 2,5 g / ml röd-BGT (donator endast; märkta C1 kontroller), och även några avsnitt med 10 g / ml långt röd-BGT (endast acceptor; märkta C2 kontroller). Inkubera dessa kontroller som i steg 7.3.
  5. Tvätta diabilder 3 x 10 min i PBS och montera i glycerol-baserade, fade-motstånd monteringsmedium (se steg 3,12).
  6. Utför provtagning av ändplattor som i steg 6.7. Fluorescens från donatorn och acceptorn skall ligga exakt samlokaliserade vid ändplattor på grund av den slumpmässiga bindningen av fluorescerande-BGT molekyler.
  7. Kontrollbilder: Använda 40X objektiv och låg lasereffekt optimera redBGT förstärkning och offset nivåinställningar för ändplattor från en kontroll slide C1. Optimera långt redBGT gain och offset nivåer för ändplattor från kontroll slide C2. Bekräfta avsaknad av fluorescens genomblödning.
  8. Utan att ändra lasereffekt, vinna eller inställningar offset-nivå flyttar till de experimentella diabilder och samla bilder (pre-photobleach) för både fluorescens kanaler.
  9. Selektivt photobleach långt-röd-BGT över en del av en enda ändplatta genom att zooma in scanningsområdet sedan skanna 10 gånger med 633 nm laser vid 100% effekt. Den fluorescens i det skannade området bör bli svag.
  10. Återställ lasereffekten och zooma och samla efter blekmedel bilder på båda fluorescerande kanalerna med konfokala inställningar inrättats på 7,7.
  11. Beräkna FRET effektiviteten (E) från den procentuella ökningen av donator (röd-BGT) fluorescens efter photobleach av mottagare (långt röd-BGT) enligt följande formel *:
    Ekvation 1
    * För alla situationer där fluorescensen hos donator ökar efter fotoblekning acceptorn.

Representative Results

Mätning av Synaptic Area på NMJ

Någon uppskattning av området bygger på en teckning av en gräns för att definiera omfattningen av synaptiska inriktningar. Hos friska unga vuxna muskler NMJ bilder ska visa väldefinierade gränser för både AChR och synaptofysin färgning (Figur 2A och B). Fluorescensintensitet för både AChR och synaptofysin stiger kraftigt vid gränsen mellan den peri-synaptiska och synaptisk partiet av motorändplattan (figur 5A 'och B'). För sådana bilder en minimigräns (precis ovanför extrasynaptic bakgrundsfluorescens) kommer lätt isolera AChR-rika eller synaptofysin rika området i ändplattan (horisontella streckade linjer i (Figur 5A 'och B')). I äldre möss och i vissa sjukdomstillstånd ändskivans färgning för AChR kan vara mindre intensiv, kan AChR klusterkanterna verka suddig ochre kan vara högre extrasynaptic autofluorescens (Figur 5D; 17,22). Fluorescens färgning med otydliga gränser kan införa fel i beräkningarna av synaptiska området. I alla situationer är syftet att välja en tröskel som ger en binär bild liknande form och storlek till AChR- eller synaptofysin rika områden som de uppträder för ögat i original, kontinuerlig tonsbild. Utförande av analysen blind för behandlingsgruppen bör minska risken för subjektiva fördomar vid tröskelsteget (steg 4.1). Ibland svaga eller suddiga ändplattan bilder kan bli följden av suboptimal behandling. Figur 2C och D visar ett exempel på en låg kvalitet ändplatta bild från en frisk 2 månader gammal mus. Suddiga kanter och svag synaptofysin färgning kan ha uppstått i detta fall av partiell upptining och omfrysning av muskeln före cryosectioning. Vissa delar av unga friska (positiv kontroll) muskler bör sektion ennd behandlas parallellt med experimentella prover för att säkerställa att eventuella nedskrivningar tydligt i de NMJ bilderna inte är på grund av problem med immunfärgning. Partier av bilder komprometterade av suboptimal behandling bör uteslutas från analyser.

För en ansikts z-stack bilder, 15-20 ändplattor är en rimlig urvalsstorlek för att uppskatta synaptiska områden. En stor mångfald i former och storlekar av NMJs finns inom en viss muskel. Scatterplots avslöjar en betydande utbud i AChR rika område bland ändplattor av tibialis anterior muskeln i varje enskild mus (figur 6A). Ändå den genomsnittliga AChR området (baserat på 15-20 en face gavel bilder) var likartad bland sju prov möss (~ 200 m 2, Figur 6A). Området för ändplattan synaptofysin färgning varierade också betydligt mellan ändplattor från en given muskel. Än en gång, med hjälp av en provstorlek på 15-20 ändplattor medelområdet ändskivans synaptofysin var similar bland de 7 möss studerade (~ 170m 2, Figur 6B). Frekvens histogram av poolade data visade ungefär normalfördelningar för området ändplattan AChR och synaptofysin (Figur 6A 'och B'). Kan dock inte antas en normalfördelning av synaptiska områden sjukdomstillstånd, såsom myasthenia gravis 16,20. Detta kan påverka valet av statistisk metod.

Tabell I visar områden med pre- och postsynaptiska inriktningar för NMJs för friska 2 månader gammal (ung vuxen) hona C57Bl / 6J möss från tidigare studier. Områdena både pre- och postsynaptiska inriktningar minskade med stillasittande åldrande 22. AChR område var också markant minskat hos möss som injicerats med IgG från anti-MuSK myasthenia gravis patienter 17,21. Myastena möss som behandlats med kolinesterashämmare drogen, pyridostigmin, visade en ytterligare betydande minskning av ändplattan AChR area 20 </ Sup>.

Relativ intensitet Gavel Fluorescens Märkning

Den relativa intensitet immunofluorescens märkning kan avslöja förändringar i täthet av en synaptiska protein av intresse med åldern, genotyp och / eller sjukdomstillstånd. AChR fluorescens (röd-BGT eller långt röd-BGT) först används för att definiera platsen för NMJ. Ljusstyrkan för fluorescens inom 8-bitars AChR-rikt område används sedan för att bedöma förändringar i koncentrationen av proteinet av intresse, i förhållande till kontrolldjur. I tvärsektioner ändplattan AChRs visas normalt som en croissant, men denna form är ofta oregelbunden (figur 4A, C, E, H). Lågintensiv bakgrundsfluorescens avslöjar oftast om en lapp av AChR färgning representerar en enda ändplatta, eller två separata ändplattor belägna på angränsande muskelfibrer. Många synaptiska proteiner (t.ex. RapSyn, mysk och SRC) ärsamlokaliserades med AChR vid gaveln (figur 4A - D). Immunofluorescensfärgning med Fosfor-specifika antikroppar kan också användas för att jämföra effekten av experimentella interventioner på fosforylering status särskilda postsynaptiska membranproteiner 21.

Tillförlitligheten och reproducerbarheten hos fluorescensintensitetsmätning beror tungt på integriteten av den frysta muskeln och kvaliteten på immunfärgning. Muskler ska dissekeras och omedelbart snäpp frysta eller paraformaldehyd-fast (inom några minuter av djurets död) för att undvika degenerativa förändringar av NMJ. Immunofärgning beror mycket på kvaliteten på de reagenser och optimera färgningsprotokollet för specifika antikroppar. För varje ny sats av primär antikropp pilotimmunfärgning experiment behövs. Nyskurna kryosnitt av friska unga muskler inkuberas med seriella 2-faldiga spädningar av den primära antikroppen. ENkänd tillförlitlig sekundär antikropp används och resultaten jämförs. Om proteinet av intresse är känt för att vara begränsat till NMJ då den bästa antikroppskoncentration är den som ger den högsta kvoten av NMJ fluorescensintensitet i förhållande till den som finns i extrasynaptic delar av muskeln (bakgrundsfluorescens). Extrasynaptic (förmodligen ospecifik) fluorescensintensiteten bör normalt inte överstiga 15% av ändskivans fluorescensintensiteten. Likaså "nej primär antikropp-kontroll" sektioner (inkuberade endast med sekundär antikropp) ska visas mörk, bekräftar att den sekundära antikroppen inte binder ospecifikt. Kvaliteten på olika partier av (polyklonala) sekundära antikroppar kan variera kraftigt så alternativa sekundära partier antikropps bör jämföras innan upprättande av ett standardprotokoll. Den idealiska test för specificitet immunofluorescens innebär en direkt jämförelse av sektioner från vildtyp möss och negativa kontrollsektioner från möss thatt saknar proteinet av intresse (gen knockout). Följande referenser beskriver kvantifiering av ändskivans fluorescens färgning för mysk, RapSyn, dystroglycan, src och AChR 13,14,18,21.

Små provstorlekar introducerar fel i beräkningar av relativ fluorescensintensitet. Individuella muskeländplattorna varierade avsevärt i fluorescensintensitet. Förmodligen variabilitet mellan ändplattor inom en given muskel återspeglar mångfalden av NMJ struktur och chans skillnader i optiska delen samplade. Men öka antalet ändplattor samplade resultat i en mer stabil uppskattning av genomsnittlig fluorescensintensitet (Figur 7). För att uppskatta den genomsnittliga ändplattan fluorescensintensiteten 40-60 ändplattor från varje muskelprov bör medelvärde.

AChR-AChR FRET

Varje AChR är en pentamer med två bindningsställen för BGT (ligger en på varje alfa-subenhet). Bindning avröd-BGT och långt röd-BGT till dessa två platser skulle ge en donator-acceptor separation av ca 9nm 28-30. Således låg verkningsgrad FRET kan upptäckas redan innan AChRs montera in kluster 14. Emellertid kan effektiviteten hos FRET på murina ändplattor fördubblades i stort sett postnatalt, i överensstämmelse med den mer effektiv inkorporering av AChRs till en tätt packad postsynaptiska membranet gitter 14. Använda röd-BGT och långt-röd-BGT som FRET donator och acceptor (respektive), ändskivorna av 1-2 månader gamla möss producerade genomsnittliga FRET effektivitets sträcker 20-37% (tabell 2). FRET effektivitet på 20% eller mer är tänkt att representera snäva förpackning av AChRs 14. Gavel FRET effektivitet minskade något efter denerveringen 14, och markant minskat efter möss injicerades med IgG från anti-mysk positiva myasthenia gravis patienter 18. Dessa förhållanden där enskilda AChRs är mindre tätt packade i postsynaptic membranbyggnadsställning av den postsynaptiska MuSK / RapSyn systemet 31.

Figur 1
Figur 1. Bädda och frys muskler för cryosectioning (1-5) Förbereda formar ("båtar") före frysning ett parti av muskler:. (1) Aluminiumfolie skärs i rektanglar (2,0 x 3,0 cm) och (2). Vikta som indicted för att skapa en form / båt (3). (4) rektanglar av nitrocellulosa immunoblotting papper skärs för att passa in i formen och en kulspetspenna används för att styra linjer för orientering muskeln. (5) Nitrocellulosa rektangeln är placerad i formen. (6-8) inbäddning och frysa musklerna: (6) Kryostat inbäddning matrisvattnet försiktigt hälls i formen (ovanpå nitrocellulosa) till ett djup av 2 mm. (7) fin pincett används för att sänka den muskel, genom dess senor i inbäddning matrisen, i inriktning med nitrocelluförlorar avgöranden, (8) Ytterligare inbäddning matrisen försiktigt hälls i formen för att täcka muskeln, var noga med att undvika att skapa bubblor. Den inbäddade muskeln därefter snabbfrystes, förseglades i tuber och lagrades vid -80 ° C såsom beskrivs i texten. (9-12) Förberedelse för cryosectioning: (9) Fine pincett används för att skala bort den aluminiumform och det frysta blocket placeras sedan i -20 ° C kryostat kammare, (10) Markeringarna i nitrocellulosa används för att rikta muskeln parallellt med ytan av chucken (11) för längsgående sektione (12). En droppe vätska Cryo-inbäddningsmedium används för att fästa blocket till den kylda chucken. Blunt pincett används för att manipulera den frusna muskelblocket. För att erhålla tvärgående sektioner är blocket istället monterad så att muskeln är vinkelrät mot ytan av chucken (ej visad).

Figur 2
Figure 2. En ansiktsbilder av NMJs från tibialis anterior muskeln i 2 månader gamla kvinnliga C57Bl6J möss. Den färska muskeln var snap frysta och sektionerna fixeras på bilden som beskrivs i steg 3.2. Maximal intensitet projektion bilder av z-stackar erhölls enligt beskrivningen i det första protokollet. (A) röd-BGT färgning avslöjar en enda motorändplattan består av två uppsättningar av AChR-rika primära postjunctional rännor (sv ansikte view). (B) synaptofysin färgning med FITC-konjugerad sekundär antikropp avslöjar presynaptiska nervterminalen, ockuperar de primära synaptiska rännor. En del av den pre-terminal Axon är också synlig i den övre delen av panelen. (C & D) Ett exempel på en dålig kvalitet NMJ bild från en ung frisk mus. Färgning är svag och gränserna för de pre- och postsynaptiska inriktningar är suddiga. Detta tillskrevs brister i tHan bearbetning av vävnaden och / eller otillräcklig tid som medges för den primära antikroppen inkubation. Skala bar i panel D representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Stegen i behandlingen av en ansikts NMJ bilder (som beskrivs i protokoll 1). (A & B) Original kontinuerliga tonen MIP bilder visar röda BGT fluorescens avslöjar AChR och grön immunofluorescens för synaptofysin respektive. (C) AChR färgning efter omvandling till en 8-bitars gråskalebild och användning av polygonverktyget att avgränsa ändplattan (tunn gul linje). (D) Gavelgränslinje som förts över till den gröna synaptofysin bilden. (E) Applblue av en minimistyrka tröskel kommando för att skapa en binär bild som isolerar suprathreshold röda BGT (AChR) fluorescens. Sekvensen av ImageJ användargränssnitt skärmdumpar visas till vänster om bilderna. (F) Binary synaptofysin bild efter applicering av en separat tröskel. (G) Identifiering av diskreta suprathreshold AChR-rika domäner inom ändplattan genom tillämpning av Analyze partiklar kommandot till den binära röda BGT bilden. Motsvarande ImageJ (till vänster om panelen (G) visar indata krävs. Den minsta suprathreshold pixel områden som krävs bör skrivas in. (H) Identifiering av områden av överlappning av den binära synaptofysin och AChR bilder. Överlappning representeras av vita pixlar . ImageJ användargränssnittsskärmdumpar (nedan panelen H) visar stegen för att komma fram till den binära överlappning bilden. De valda minimiintensitet tröskelvärden för varje fluorescens channel måste anges inom "colocalization" fönstret. Skala stapel representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Exempel på tvärgående optiska sektioner som används för att jämföra relativa fluorescensintensiteter (protokoll 2). Muskeln var snap frysas och sektionerna fixerade på bilden som beskrivs i steg 3.2. (A & B) En enda ändskivans dubbelmärkta med långt -Red-BGT (AChR; visas här i blått pseudofärger) och FITC-anti-RapSyn illustrerar samlokaliseringen av dessa två interagerande proteiner i det postsynaptiska membranet (C & D) Två ändplattor på intilliggande muskelfibrer visnings samlokaliserade AC. hR och mysk. (E & F) En ändplatta dubbelmärkta för AChR och -dystroglycan (-DG). Den -DG sträcker rätt runt muskelfiber omkrets men berikas vid gaveln (skal bar i F, för paneler AF: 25 pm) (G - I) Isolera en ändplatta för intensitetsmätning (G) En typisk mikroskopfält,.. innehållande tre långt röd-BGT-färgade ändplattor (skala bar i panel G: 40 ^ m (H) En förstorad bild av den inramade ändskivan (I) Samma ändplattan omvandlas till en 8-bitars gråskalig bild och som avgränsas med hjälp av polygonen.. . verktyg för ImageJ (tunn gul linje) Genomsnittlig fluorescensintensitet mäts inom denna gränslinje. (skala bar för H & I: 10 pm) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

INNEHÅLL "fo: keep-together.within-page =" always "> Figur 5
Figur 5. Inverkan av bildkvalitet vid bedömningen synaptiska området. (A & B) Hög kvalitet sv ansiktsbilder av en frisk NMJ från en 2 månader gammal mus visas på röda BGT och anti-synaptofysin fluorescens kanaler. (A '& B ') Fluorescens intensitetsprofiler som motsvarar den linje dragen tvärs ändplattan för A och B respektive. Den horisontella röda streckade linjen visar minimigräns som används för att skapa den binära bilden. (C & D) Gavel från en äldre mus. Gavel synaptofysin färgningen är i allmänhet mindre intensiv. (C '& D') intensitetsprofiler visar en hög grad av extrasynaptic (baslinje) fluorescens fluktuationer i synaptofysin (FITC) kanal (backjord) som påverkar bestämningen av ett lämpligt tröskelvärde. Mycket av detta är bredspektrumvävnads autofluorescens. Skala barer representerar 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Variabilitet av synaptiska områden bland NMJs inom en muskel och mellan möss. (A) Scatterplots visar total AChR-rikt område av ändplattor från tibialis anterior muskeln av sju naiva 2 månader gamla C57BL / 6J möss som erhållits genom författaren NT. Varje symbol representerar en ändplatta. Varje stapel representerar medelvärdet ± SD för ändskivorna samplade från en mus. (B) Scatterplots visande synaptofysin-rikt område för samma ändplattorna. (A ') (B ') Frekvensfördelning för synaptofysin rika området ändplattor (poolade data). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 7
Figur 7. Effekt av provstorlek på den uppskattade ändskivan fluorescensintensitet. Transversella optiska sektioner användes för att mäta fluorescensintensiteten (i godtyckliga enheter) vid 40 60 ändskivor från tibialis anterior muskeln av en frisk 2 månader gammal mus. Kumulativa medelvärden plottas mot antalet ändskivorna som ingår i medelvärdet. (A) Gavel röd-BGT fluorescensintensiteten som erhållits efter författare AV. (B) Anti-synaptophysin immunofluorescens intensiteten för samma ändplattorna som i panel A. (C) Gavellångt röd-BGT fluorescensintensiteten som erhållits från en andra muskelprov efter författare NG. (D) Anti RapSyn immunofluorescens intensitet från samma ändplattorna som i panel C.

Studie Muskel antal möss AChR område Synaptofysin område Överlappningsområdet
medelvärde ± SD (μm2) medelvärde ± SD (μm2) medelvärde ± SD (μm2)
Morsch et al. (2012) 1 gastrocnemius 3 181 ± 7 163 ± 24
membran 3 130 ± 41 102 ± 21 76 ± 26
Morsch et al. (2013) 1 tibialis anterior 3 166 ± 26 117 ± 21 nd
Cheng et al. (2013) 2 tibialis anterior 4 226 ± 18 150 ± 44 110 ± 34
Tse (opublicerad) 2 tibialis anterior 7 213 ± 27 157 ± 23 111 ± 11
1 avbildas på en Zeiss LSM 510 Meta mikroskop men med fast förstärkning och offset nivåer. Tröskel och synaptiska områden mätningar används metamorfa software av MM.
2 avbildas på en Leica DM IRE2 mikroskop och analyseras efter nuvarande protokollet från den angivna första författare, blind för behandlingsgruppen.
nd ej bestämd.

Tabell 1. Synaptic områden för NMJs av 2 månader gammal kvinnliga C57BL / 6J möss (friska kontroller)

Studie Muskel FRET effektivitet (%) * Range (%)
(Medelvärde ± SEM)
Brockhausen et al. (2008) tibialis anterior 24 ± 1 na
Cole et al., 2010 tibialis anterior 26 ± 1 22-30
Morsch (opublicerad) membran 37 ± 1 24-47
Ghazanfari (opublicerad) tibialis anterior 30 ± 1 20-45
* FRET mellan röd-BGT och långt-röd-BGT (Förster radie för FRET par = 51A (Life Technologies).
na uppgifter som inte är tillgängliga

Tabell 2. Effektivitetsvinster för AChR FRET från unga vuxna möss C57Bl6J möss

Discussion

De protokoll som beskrivs här har gjort det möjligt för oss att på ett tillförlitligt sätt mäta och kvantifiera förändringar i egenskaperna för NMJ inom en rad villkor, inklusive normala åldrande och sjukdomstillstånd. De metoder som beskrivs för sv ansikte NMJ bilder kommer att tillåta forskare att jämföra området före och postsynaptiska inriktningar och området för synaptiska överlappning / anpassning. Att jämföra den relativa intensiteten av pre- och postsynaptiska proteiner andra protokollet, som använder tvärgående optiska sektioner, är att föredra. Den tredje protokollet testar specifikt för förändringar i närheten av packning av AChRs i postsynaptiska membranet.

Specificitet kontroller är avgörande immunofluorescensmikroskopi. Vid användning av någon primär antikropp för indirekt immunofluorescens är det nödvändigt att först se till att den specifikt binder till sitt målprotein i muskel sektioner. Olika typer av vävnadsbehandling och fixering kan differentiellt förändra specificitetantikroppar. Det är viktigt att bekräfta att immunofluorescensfärgning (för säg RapSyn) verkligen är koncentrerad med AChR på motorändplattan. Negativa kontrollsektioner måste också kontrolleras för att säkerställa att antikroppsbindning är specifik. Till exempel skulle det bästa negativa kontrollen för RapSyn immunofluorescens vara sektioner från RapSyn - / - möss. Dessa bör inte visa några ändskivans färgning med anti-RapSyn. Icke-specifik fluorescens kan också uppstå endogena fluorescerande kemikalier i vävnaden (autofluorescens) eller från icke-specifik bindning av den fluorescerande sekundär antikropp konjugat. Sådan fluorescens ofta förvärras av aldehyd fixering. Dessutom kan TRITC-BGT färgning av ändskivorna ibland detekteras i FITC-fluorescens kanal och detta fluorescerande genomblödning kan förväxlas med specifik FITC immunofluorescens. För att skydda sig mot de tre sistnämnda former av icke-specifik fluorescens, bör varje sats av bilder som är färgade inkludera några 'no-primär kontroll antikropp "sektioner (steg 3,7 och 4,6). Bilder av ändplattor från dessa kontrollsektioner skall jämföras med de från de experimentella diabilder för att säkerställa att den indirekta immunofluorescens färgning av NMJs speglar verkligen den bindning av den primära antikroppen.

Tvärgående konfokala sektioner är särskilt användbara för att bedöma skillnader i den relativa intensiteten för immunofärgning vid synapsen. I tvärgående konfokala sektioner är det lättare att bedöma exakt samlokalisering av synaptiska proteiner. Den halvmåneformade ändskivans profilen representerar bara ett urval cut-genom NMJ i fråga. Emellertid är bakgrunden (extrasynaptic) fluorescens i allmänhet lägre jämfört med en face z-projektionsbilder. Således kan det vara lättare att diskriminera "riktiga" (specifika) immunfärgning och upprätta fasta konfokal förstärkning och offset värden med hjälp av tvärgående optiska sektioner 13-15,18. Till exempel, i en musmodell av myasthenia gravis (where ändplattan AChR färgning minskas markant) ändplattor var tydligt avgränsad i tvärgående optiska sektioner 18,21. Skillnader i den genomsnittliga fluorescensintensiteten på NMJ troligen återspeglar förändrad täthet av målproteinet inom den synaptiska specialisering. En protest är att i vissa situationer kan en strukturell förändring i målproteinet eller ocklusion av antikroppsbindning genom grann proteiner förklara förändrad färgningsintensitet.

Utformningen av experiment kräver viss hänsyn. I många fall experimentet skulle syfta till att testa effekten av en transgen, gen knockdown eller sjukdomstillstånd på storleken på NMJ. Den experimentella urvalsgrupp kan sedan jämföras med friska unga (vildtyp) möss av samma kön och genetisk bakgrund. Baslinjevärden för området ändskivans synaptofysin, AChR och synaptic överlappning i flera muskler anges i tabell 1. Urvalsstorlek beror på graden av djuret-till-djur variation inom behandlingsgrupper och effektstorleken (skillnad i medel för den experimentella kontra kontrollgrupper per standardavvikelse). När analysen är begränsad till bilder av god kvalitet en rimlig grad av enhetlighet hittades i provet innebär för gavelområden bland friska 2 månader gamla kvinnliga C57Bl6J möss (Figur 6A och B). Således var det möjligt att påvisa betydande minskningar av synaptiska området 30-40% hos möss som injicerats med IgG från anti-mysk positiva myasthenia gravis patienter, jämfört med kontroller med stickprovsstorlek på tre möss 17,20,32. Äldre möss visade större djur till djur variation i gavel parametrar än unga möss 22. Följaktligen försök med åldern möss kan kräva större provstorlekar.

Om det primära målet är att mäta storleken på en face ändplattan då vinsten och offsetnivåinställningarna bör optimeras för varje individ NMJ. Individual NMJs kan variera avsevärt i ljusstyrka AChR och synaptofysin färgning, speciellt när sjukdomstillstånd undersöks. Dessutom intensiteten av utom synaptiska (ospecifik) fluorescens är ofta högre och mer variabel i musklerna i åldrande djur, jämfört med de friska unga djur (Figur 5C och D). Den 1-256 gråskala bör utnyttjas till fullo för att maximera den tonala information som kommer att behållas i slutbilder. Detta kommer att innebära att justera förstärkning och offset nivåer för varje NMJ för vilka en z-stack är att samlas. Figur 5D visar ett exempel på en NMJ bild där tonal information kan vara avgörande för avgränsningen av området före och efter synaptiska inriktningar.

Mätningar av synaptiska områdena kan anbringas på olika muskelpreparat och experiment. De flesta av våra mätningar av synaptiska områden har anställt longitudinella kryosnitt från snap frysta muskler. Frysning muskeln före fixering bibehåller antigeniciteten av ett brett spektrum av proteiner. När kompatibel med antigenet, paraformaldehyd fixering och sackaros infiltration innan cryosectioning (steg 2,1) kan ge bättre bevarande av NMJ struktur. Optimal strukturell konservering kan erhållas genom hjärt perfusion med paraformaldehyd. Artefakter av frysning och sektione kan fullständigt undvikas genom märknings ändskivorna på ytan av de intakta muskel- och avbildnings NMJs på fascicles retad från den fasta muskeln 21. Oberoende av preparatet, förfarandena för provtagning, bildbehandling och området kvantifiering är oförändrade (protokoll steg 4-5). Konsekvent tillämpning av blinda provtagning, imaging och analysprotokoll (med olika operatörer, olika prover av möss och olika tider), kan resultera i ganska reproducerbara medelvärden (jämför Cheng et al., Och Tse resultaten i tabell 1).

"> Ändplattorna har beskrivits som att bli splittrade i en mängd olika sjukdomstillstånd. Till exempel i åldrande mus muskler, sporadisk degenerering av en muskelfiber (följt av dess regenerering) resulterade i remodellering av pretzel liknande ändskiva AChR plack till bildar flera mindre AChR kluster 6. Hos möss som injicerats med IgG från anti-MuSK myasthenia gravis patienter, fragmentering av ändplattan var ganska annorlunda. Gavel AChR kringla stor del spridda, lämnar efter sig en konstellation av små (<4 m 2) AChR "mikroaggregat "20,21. Dessa två exempel belyser behovet att jämföra storleksfördel för AChR kluster vid ändplattor kontroll kontra försöksdjur 21.

Andra metoder har rapporterats för att bedöma synaptiska område eller färgning intensitet på NMJ. Motor ändplattor kan ibland vikas så att de tvådimensionella z-projektion bilder som används här kan underskatta synAptic områden. Tredimensionella konfokala rekonstruktioner kan ge mer exakta åtgärder om absolut synaptiska område måste definieras 33. En viktig fördel med z-projektion protokoll som beskrivs här, dock är dess relativa enkelhet, vilket har möjliggjort ett stort antal ändplattor som skall mätas från flera behandlingsgrupper och tillförlitlig identifiering av potentiella förändringar. Protokollet för att jämföra gavelfärgningsintensitet kan anpassas för att studera förändringar i nivåerna av många olika synaptiska proteiner. Metoden är begränsad, dock med kravet att alla prover behandlas för immunofluorescens sedan avbildas under samma konfokala session. En färsk studie från et al. Yampolsky 5 beskrev en metod för mätning av ändplattan AChR täthet som kan bidra till att avhjälpa denna begränsning. I denna studie användes samma områdena ändskivorna avbildas vid flera olika lasereffektinställningar. Lutningen av förhållandet mellan lasereffekten och rhodamine-BGT fluorescensintensiteten användes för att bedöma relativa förändringar i AChR densitet vid ändplattor i olika möss 5. Denna metod kan vara användbart för att jämföra AChR intensiteten i prover avbildas vid olika tidpunkter under loppet av en långvarig studie.

AChR-AChR FRET ger specifikt och kompletterande information om organisationen av gavel AChRs. Elektron mikroskopisk autoradiografi med användning av 125. I-α-BGT har visat AChRs att packas tätt med ett plant densitet av 10 4 m -2 omedelbart under varje presynaptisk platsen för avtappning sändare, medan angränsande membran infoldings innehåller mycket lägre täthet av AChR 34. AChR-AChR FRET gör det relativt lätt att upptäcka (sub-mikroskopiska) förändringar i AChR packning. En minskning av FRET effektiviteten reflekterar en sub-mikroskopisk omfördelning av AChRs i det postsynaptiska membranet, som inte skulle kunna detekteras av en förändring i genomsnitt BGT fluorescensintensitet. Multipel faktörer kan orsaka en förändring i effektiviteten hos FRET. Dessa inkluderar det donor-acceptor-avstånd och relativa oriente, liksom den molekylära omgivningen 35,36. En minskning av ändplattan FRET effektivitet kan möjligen uppstå en förändring i geometri AChR gitter. Men mest troligt att det skulle vara på grund av en minskad procentandel av AChRs som packas in i nanoskala postsynaptiska molekylär gitter 14.

Förlust av sambandet mellan motoriska nervceller och muskelfibrer verkar vara den omedelbara orsaken till muskelsvaghet i motorneuronsjukdom och i stillasittande åldrande 9,22,23. Delade metoder och parametrar för att mäta NMJs bör göra det lättare för olika forskargrupper för att jämföra och kontrast publicerade rön. Delningen av detaljerade protokoll (och framtida förbättringar på dem) kan bidra till att påskynda utvecklingen att förstå de mekanismer för NMJ underhåll och hur den kan påverkas vid sjukdomstillstånd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scanning confocal microscope Leica DM 2000 with  TCS SP2 system Most scanning confocal microscopes should be suitable. 
Zeiss LSM 510 Meta 
Leica SPE-II
Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) Life technologies B35451 Used for labelling AChRs
Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) Life technologies B35450 Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece 
rabbit anti-synaptophysin Life technologies 18-0130 Different batches of primary antibody differ in effective working dilution
FITC-anti-rapsyn mab1234 Milipore FCMAB134F Monoclonal antibody conjugated to FITC
FITC-donkey anti-rabbit IgG Jackson 711-095-152 Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch
Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) ProSciTech IA018 Cryostat embedding matrix for freezing  muscles
DABCO Sigma 10981 Mounting medium that slows photobleaching of fluorophores

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
  2. Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability. J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).
  3. Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions. PLOS ONE. 7, e46663 (2012).
  4. Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).
  5. Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation). Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).
  6. Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse. J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).
  7. Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals. J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).
  8. Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles. PLoS ONE. 7, e34640 (2012).
  9. Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice. Cell reports. 2, 1-6 (2012).
  10. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135, 1081-1101 (2012).
  11. Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles. J Physiol. 591, 559-570 (2013).
  12. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  13. Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse. J Physiol. 562, 673-685 (2005).
  14. Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability. Dev Biol. 305, 262-275 (2007).
  15. Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse. Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).
  16. Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction. Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).
  17. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors. Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).
  18. Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice. J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).
  19. Viegas, S., et al. Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects. Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).
  20. Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody. J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).
  21. Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction. J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).
  22. Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise. PLoS One. 8, e67970 (2013).
  23. Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).
  24. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLos Biol. 8, e1000412 (2010).
  25. Shimizu, S. Routes of Administration. The Laboratory Mouse. Hedrich, H. J., Bullock, G. Elsevier. (2004).
  26. Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. Brown. Dubuque, Iowa. (1988).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
  28. Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A. J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).
  29. Paas, Y., et al. Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices. Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).
  30. Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR). Neuron. 35, 319-332 (2002).
  31. Ghazanfari, N., et al. Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains. Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).
  32. Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis. PLoS ONE. 9, e87840 (2014).
  33. Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).
  34. Salpeter, M. M., Harris, R. Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction. J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).
  35. Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy. Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).
  36. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).
Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).More

Tse, N., Morsch, M., Ghazanfari, N., Cole, L., Visvanathan, A., Leamey, C., Phillips, W. D. The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (94), e52220, doi:10.3791/52220 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter