פיתוח Published: November 1, 2014 doi: 10.3791/52222

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Sari Sabban¹, Hongtu Ye², Birgit Helm²

¹Biological Department, King Abdulaziz University, ²The Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology, The University of Sheffield

Introduction

אלרגיה ידועה כבר אלף שנים. טיפול באסתמה תואר בטקסט הרפואי המצרי העתיק המכונה פפירוס אברס (~ לפנה"ס 1550) ודן בתרופות צמחיות לטיפול בזה ^7.

אלרגיה היום מסווגת כתגובה רגישות יתר מהסוג I, שבו סוג T התא עוזר 2 (TH ₂₎ הזרוע של מערכת החיסון מנווטת את הייצור של נוגדני אימונוגלובולין E (IgE) בתגובה לאנטיגנים סביבתיים הנקראים אלרגנים. אלה הם חומרים מגוונים שאינטראקציה בדרך כלל עם תאים במערכת החיסונית ולהמריץ את הסינתזה והפרשה של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כולל interleukin-4 וinterleukin-13 ^{8, 9} כאל חלקיקים בחלקיקי עשן סיגריות או דיזל אשר משפרות סינתזת IgE ^10.

העלייה בגילויים אלרגיים במדינות מתועשות ב -50 השנים האחרונות, שיוחסה לשילוב של ההשפעהמזהמים סביבתיים ומגמה לסביבה יותר מחוטא, המשלבים להעביר את התגובה החיסונית כלפי פרופיל שלט על ידי TH ₂ ציטוקינים, כפי שהוצע על ידי "היגיינה השערה ^'11.

כפי שצוין לעיל, בני האדם אינם יונקים רק נגוע באלרגיה. יש לציין סוסים וכלבים גם יכולים לפתח תגובות אלרגיות קלאסיות ומחקר על ידי ¹² הראה כי, כמו אצל בני אדם, אלרגיה לסוסים מיוחסת לגורמים גנטיים וסביבתיים. כתוצאה מכך, בעלי החיים הללו מהווים מודל טוב ללימוד יחסי הגומלין בין גורמים הגנטיים וסביבתיים של אלרגיה, ההתקדמות שלה מרגישות למחלה, ואסטרטגיות התערבות אפשריות פעם אחת ביטויים קליניים שהגדרתם ב

בשנת 1887, Stömmer היה האדם הראשון שתאר את הדמיון בין האדם ואסטמה סוסי ^13, ההשפעה של היסטמין על מערכת לב וכלי דם הסוסים היאדומה מאוד לזו של בני אדם ^14. סוסים הם גם אבן הפינה של התעשייה מרוצי הסוסים, שהוא בשווי $ 72000000000 עם מחזור הימורים של 115 מליארד דולרים בשנה ^15.

רוב סוסי מרוץ העכשוויים הם צאצאים של המספר הקטן של סוסים ערביים הגזעיים על ידי ליידי אן בלאנט מהשינה 1878 ואילך. סוסי מרוץ מודרניים בדרך כלל ממולדים כדי לבחור ליכולות ביצועים. הם נוטים להפרעות גנטיות, שאחד מהם היא הרגישות שלהם להר תגובות אלרגיות. יש להם גם 1000 פעמים רמות גבוהות יותר IgE בסרום יותר אפילו בני האדם ¹⁶ ביותר אלרגי קשה. תגובות אלרגיות סוסים בדרך כלל באות לידי ביטוי כרגישות יתר עקיצת חרק (IBH) ^{17, 18.} תוצאות IBH בדלקת עור כתוצאה מעקיצות חרקים מהוות בסוג Culicoides. צורה נוספת של מחלה אלרגית סוסים היא חסימות בדרכי נשימה חוזרות ונשנות (Rao), זה באו לידי ביטוי בבריאות ובדרכי הנשימה. הוא מאופיין על ידי צפצופים ומעבדהנשימה כבדה. לשכה לביקורת מתרחשת בדרך כלל בתגובה לעצב נבגים, ורמות IgE לאלרגן ספציפי גבוהות נרשמו בסוסים שסבלו מלשכה לביקורת במחקר אחד ¹⁹ למרות שחקירה עוד לא אישרה ²⁰ זה.

מחקרים על אלרגיה לסוסים סובבים סביב הניסיון בניטור ונטרול IgE סוסים על ידי פיתוח נוגדנים נגד סוסים IgE חד שבטיים (מבז) ^{21, 22.} יתר על כן המחקר של ²³ דן בייצור של תחומים תאיים של α של גבוהה-זיקת קולט Fc הסוסים קולט שרשרת (FcεRIα) בניסיון לזהות ולכמת בסרום סוסי IgE. במחקר נלווה על ידי ²⁴ Ledin דן בגישה חדשה שמטרתה לנטרל IgE בסרום על ידי תחול במערכת החיסון בimmunogen עצמי שאינם עצמי /. כל המחקרים הללו, עם זאת, היו חסרים assay יעיל על מנת לבחון את הבטיחות ויעילות של הפרוטוקולים שלהם. במאמר זה, אנחנו עכשיו נציג נתונים כאלה sys assayTEM החלים על המחקר של אסטרטגיות אבחון וטיפול רלוונטיות למערכת הסוסים, שבו שחרור β-hexosaminidase, כמדד לdegranulation מתווך תא, הוערך על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים. פרוטוקול זה מבוסס על פרסומים קודמים ^{25, 4, 5, 2, 3} המתארים את ההנדסה של תאי RBL transfected עם הגן המקודד את תחום מחייב IgE של קולט גבוה הזיקה לIgE ממינים שונים. הפרוטוקול מסביר כיצד לבצע assay שחרור β-hexosaminidase, שתוצאותיה מוצגות כממוצע ± סטיית תקן של ניסויים בשלושה עותקים.

Assay השחרור היה ראשון שפותח על ידי Siraganian והוק ²⁵ ללמוד אלרגיה אנושית. קבוצת המעבדה בראשותו של ד"ר ראובן Siraganian גם פיתחה את קו תא RBL. תאי RBL אלו פותחו להביע FcεRIα האדם והפרוטוקול פורסם על ידי ^4. החלק האחרוןשל assay הגיע עם הפיתוח של פלסמיד PSV בנייר על ידי נויברגר ²⁶ אשר תאר את הייצור של נוגדני IgE על ידי שיבוט גן השרשרת הכבד שלו במורד הזרם של גן עכברי לאזור משתנה IgE שמכוון את hapten 4-הידרוקסי-3 -nitro-phenacetyl (NP), הנוגדן כימרי וכתוצאה מכך היה פונקציונלי מלא. היכולת לפתח כל IgE מיקוד אותו hapten, גם בעת שיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL הביאו סטנדרטיזציה של assay שהופך אותו פרוטוקול שימושי כדי למדוד את degranulation של תאי זופילים.

Assay עושה יש יתרונות וחסרונות. היתרונות של assay הוא ההסתגלות שלה לשימוש בכל מערכת יונקים, המעבדה שלנו ובכך השתמשה בו כדי לבדוק את degranulation במערכות אנושיות, כלבים וסוסים, וזה הוא בר השגה רק על ידי סינתזת IgE של האורגניזם ושיבוט לקולטן שלו על פני השטח של תאי RBL.

מצד השני,החסרונות של assay הוא שתאי RBL רגישים מאוד לשינויים תרמיים, מכאניים וPH, מה שהופך אותם לתת וריאציה של רמות degranulation בתוך אותו assay. הוא כך מומלץ בחום שהמבחנים תמיד חוזרים על עצמם בtriplicates ולאחר מכן ממוצע שנלקח מהם. יתר על כן, תאי RBL נוטים להעביר לפנוטיפ שאינו משחרר אם הם נשארים בתרבית רקמה לזמנים ממושכים (> 10 שבועות) ^27, מה שהופך את התחזוקה שלהם מסורבלת. הם גם נוטים לזיהומים על ידי חיידקי mycoplasma, שאינם גלויים לעין מיקרוסקופ אור ולא לשנות את המורפולוגיה של התא, אך בצורה קיצונית ישנו את רמות degranulation. כך בדיקות mycoplasma רגילות יש צורך.

Protocol

1) הכנה של קו נייד:

1. פיתוח קו תא RBL-2H3.1 להביע α FcεRI סוסים:
   1. באמצעות שימוש בטכניקות תרבית רקמה בסיסיות לשורות תאי monolayer, transfect תאי RBL-2H3.1 הורים באמצעות פלסמיד pEE6, נושא את גן סוס FcεRIα (GenBank: Y18204.1) ^28. הוסף 2 מיקרוגרם μl ^-1 של פלסמיד דנ"א 0.8 מיליליטר של תאים בצפיפות של 1.2 x10 ⁷ מיליליטר תאים ^-1. Electroporate התאים ב 250 V 960 μF באמצעות electrocuvette 0.4 סנטימטר ואז דגירה מייד על קרח למשך 10 דקות.
   2. בחר את התאים שהשתנו באמצעות מדיה המכילה 0.4 גרם של סולפט G418 geneticin, אז למיין תאי חיים שנותרו באמצעות FACS על ידי תיוגם עם נוגדני IgE ניאון. השתמש בRBL-2H3.1 וכתוצאה מכך להביע את שורת תאי FcεRIα סוסים לחקירה ^{2, 3.}
2. רגישות נוגדן פרה-assay:
   -1 מיליליטר 5x10 ⁵ תא.
   1. הוסף את IgE המעניינים את התאים מושעים לריכוז סופי של 1 מיליליטר ^-1 ng, אז צלחת של תאים 100 μl לצלחת גם 96 בטורים 1-6 ו לדגור על 37 ° C + 5% CO ₂ + 90% לחות היחסית במשך 16 שעות. לאחר זמן הדגירה, ולפני ביצוע assay השחרור, לבדוק את הבארות תחת מיקרוסקופ לconfluency היטב ודבקות תא.

2) השחרור Assay:

1. שטיפת התאים:
   1. חיץ שחרור חם (25 צינורות מ"מ, 120 נתרן כלורי מ"מ, 5 מ"מ כלוריד האשלגן, 0.04 מגנזיום כלוריד מ"מ, וסידן כלורי 1 מ"מ) בשעה 37 ° C כדי לאפשר לשטיפת תאים עדינה.
   2. שטוף תאים על ידי מצליף את הצלחת להסיר תקשורת סלולארי והוספת 100 μl חם, 37 מעלות צלזיוס, חיץ שחרור. חזור פעמיים.
2. אתגר אנטיגן:
   1. הכן דילול סדרתי של אנטיגן (ניפ-HSA או DNP-HSA) של 0 מיליליטר ng ^-1, 0.1 מיליליטר ng ml ^-1, 1 ננוגרם ^-1, 10 מיליליטר ng ^-1, 100 מיליליטר ng ^-1, 1,000 מיליליטר ng ^-1, 10,000 מיליליטר ng ^-1 במאגר שחרור וחם על 37 מעלות צלזיוס.
   2. לאחר לשטוף התא השני, לבטל את התקשורת והוחלף בפתרוני אנטיגן 100 μl. ודא שיש לי בארות באותה השורה (A1-6 לדוגמא) את אותו ריכוז אנטיגן הוסיף להם.
   3. הגדר את בקרה שלילית בשורה על ידי הוספת 0 אנטיגן ^-1 מיליליטר ng. להוסיף ריכוז אנטיגן הגדלת את השורות (BG) ואחריו חיץ Triton-X (5% Triton X-100) בתאי H שורה לlyse התאים לשמש כביקורת חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות, כדי לאפשר לתאים לשחרר מתווכים שלה.
3. הגדרת בקרות ופרט:
   1. לאחר הדגירה, להעביר 50 μl של supernatant תא למחצית השנייה של הצלחת (בארות A1-6 לבארות A7-12, וכו '). מחק את 50 μl הנותר של supernatant ולהחליף עם 50 μl של חיץ Triton-X כדי לאפשר המדידה של כמות מתווכים שפורסמו בכל טוב בטורים 7-12 כאחוז מהמתווכים הכולל בתוך התאים בעמודה 1-6 .
4. סובסטרט:
5. הוסף 50 μl של מצע β-hexosaminidase (50 4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide הערוך DMSO המדולל עד 2 מ"מ-ידי הוספתו למאגר ציטראט 0.2 M חומצת לימון ו -0.2 M נתרן אצטט, pH מ"מ 4.5) לכל הבארות לאפשרה ההמרה של המצע עד 4 nitrophenol-ידי אנזים β-hexosaminidase. דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

5. הפסקת התגובה:
   1. לעצור את התגובה על ידי חיץ הוספת 150 μl טריס (1 M טריס- HCl, pH 9) לכל אחד גם pH הגבוה של החיץ מפסיק את התגובה והופך את 4 nitrophenol-לצבע צהוב.
6. קריאה וניתוח התוצאות:
   1. קראו את הצלחת באמצעות ספקטרופוטומטר צלחת ב 405 ננומטר כדי למדוד את הספיגה של הצבע הצהוב. מחושב אחוז β-hexosaminidase שוחרר תוך שימוש בנוסחא הבאה:

2. ליישם את הנוסחה הזאת היטב כל אחד, לאחר שממוצע נלקח לכל שורה. A1 ו- A7 מייצגים את המיקום של הבארות בצלחת גם 96. לשרטט גרף של אחוז שחרור β-hexosaminidase (מתאים לסך שחרור מתווך) אגאיאנטיגן NST ריכוז ^{2, 3.}

Representative Results

תאי RBL-2H3.1 הורים ואלה transfected עם גן קולט FcεRIα הסוסים היו רגישים ראשון עם העכבר IgE אנטי DNP-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן DNP-HSA. עכבר IgE נקשר לקולטן החולדה אנדוגני בשני שורות התאים ובכך פועל כשליטה על מנת לבחון את כדאיות השחרור של שני שורות התאים לשחרר מתווכים (איור 1). זוהי בדיקה חשובה וצריכה להתבצע באופן שגרתי מאז על מעבר מורחב (> 10 שבועות) בתרבית תאים, תאי RBL-2H3.1 להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש ^27. התאים הוריים נתמכים שחרור מתווך שיא של 51.54% ± 4.79%, ואילו התאים המבטאים את הקולטן FcεRIα הסוסים היו שחרור מתווך שיא של 45.99% ± 5.76%. שלהם קווים אלה התא שבו אז רגיש עם IgE סוסים אנטי ניפ-HSA וקראו תיגר עם אנטיגן ניפ-HSA (איור 1 B). תאי הורים לא עברו שחרור מתווך, שכןסוסי IgE אינו מחייב לקולט עכברוש אנדוגני. מצד השני, כצפוי, תאי RBL-2H3.1 המבטאים את הקולטן FcεRIα סוסים עברו שחרור מתווך כאשר רגישים עם IgE סוסי ניפ-HSA אנטי וקראו תיגר עם אנטיגן ניפ-HSA, נותן שחרור שיא של 36.68% ± 4.88% .

תוצאות אלו מאשרות את היעילות של פרוטוקול assay מהדורה זו בחקירה של שחרור מתווך באמצעות קולטן IgE סוסים. זה מראה שאת שורות התאים הוא כלי אבחון שימושי במסע לתחת של אסטרטגיות התערבות טיפוליות חדשניות באלרגיה לסוסים במבחנה מפחית את הצורך בניסויים בבעלי חיים. אותו הפרוטוקול גם לגבי תאי RBL-2H3.1 transfected עם האדם וקולטנים FcεRIα כלבים.

פרוטוקול זה היה בשימוש גם על מנת לבחון את הבטיחות של אסטרטגית חיסון פוטנציאלית שמנסה לנטרל סרום כלבי IgE נוגדני ^30. מהתוצאותב( איור 2) ניתן לקבוע כי אסטרטגית החיסון אינה בטוחה. הסרום אנטי-הכלבי-IgE קשור בהצלחה לIgE הכלבים כפי שנועד במקור על מנת לנטרל IgE בסרום ולמנוע אותו מלהתחבר אל הקולטן שלו. אבל זה הכריכה היה נוקב, ובכך חוצה הסרום אנטי-IgE קשור קולטנים על פני השטח של התאים, וכתוצאה מכך שחרור מתווך, שעלול לגרום לשוק אנפילקטי אם אסטרטגיה של חיסון זה שימשה כחיסון נגד אלרגיה.

RBL-2H3.1 הבעת הסוסים FcεRIα	-	-	מיוצר במעבדה
אנטי הסוסים IgE ניפ-HSA	-	-	מיוצר במעבדה
96 צלחת גם	סיגמא	CLS3595	-
Multi Channel פיפטה	Anachem	- -
חממה	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic חומצה	ביוכימיה המחקר בקיימברידג '	N-1070-1	ניפ-OH היה מצומדת עם אדם הסרום אלבומין לעשות ניפ-HSA במעבדה
Dinitrophenyl Conjugated לאדם סרום אלבומין	סיגמא	A6661	המקוצר DNP-HSA
ספקטרופוטומטר צלחת	Anthos Labtec HT2	-	-
צינורות	סיגמא	P1851	-
כלוריד הנתרן	סיגמא	S7653	-
פוטסיום כלוריד	סיגמא	P9333	-
מגנזיום כלוריד	סיגמא	M2670	-
סידן כלוריד	סיגמא C1016	-
x100 טריטון	סיגמא	X100	-
4 nitrophenyl-N-אצטיל-β-D-glucosaminide	סיגמא	N9376	המצע נקרא β-hexosaminidase פתרון המניות היה 50mm הערוך DMSO
דימתיל sulfoxide	סיגמא	D2650	-
חומצה ציטרית	סיגמא	251,275	-
נתרן אצטט	סיגמא	S7670	-
טריס	סיגמא	T5941	-

טבלת 1: טבלה של חומרים וציוד:

איור 1: 2, 3. הגרף ב 'מראה את assay השחרור הופיע על תאי הורים RBL-2H3.1 שלא להביע FcεRIα סוסים וFcεRIα להביע סוסים אלה, באמצעות IgE ניפ-HSA אנטי סוסים לרגישות תא. IgE הסוסים נקשר לקולטן הסוסים, אבל לא קולט עכברוש אנדוגני, לגרום לשחרור מתווך, זה אישר מאז תאי ההורים לא שחררו מתווכי מתווך, ואילו התאים המבטאים את תמיכת קולט סוסי סוסים בתיווך IgE, אנטיגן מושרה , מתווך לשחרר ^{2, 3.}

איור 2: תוצאות assay שחרור חיסון: הגרף מראה את assay השחרור מתבצע על תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα כלבים, באמצעות IgE ניפ-HSA אנטי כלבים לרגישות תא, ועכברוש מחוסן סרום אנטי-כלבי-IgE כאנטיגן. השליטה בשימוש שמראש מחוסן סרום, והביקורת החיובית הייתה אנטיגן ניפ-HSA. IgE הכלבים נקשר לקולטן של הכלבים. יתר על כן, אנטי-IgE בסרום נקשר לקולטן של הכלבים קשורים IgE והקישורים צולבים זה, והקולט, על פני השטח של התאים וכתוצאה מכך שחרור מתווך. זו, למעשה, מוכיחה כי אסטרטגית חיסון הספציפית הזה יש לו הפוטנציאל לגרום לתגובת שוק אנפילקטי, והוא נחשב כך לא בטוח ^30.

Discussion

לסיכום תוצאות מחקר זה הראו שכאשר תאי RBL-2H3.1 להביע FcεRIα סוסים הם רגישים עם IgE סוסים ולערער על ידי אנטיגן, הם נותנים שחרור מתווך שיא של 36.68% ± 4.88% מהסכום הכולל של מתווך בתוך תאים, בהשוואה לRBL-2H3.1 תאי הורים לא מביעים FcεRIα סוסים.

כך assay זה מספק כלי שימושי לחקירה ולימוד תגובות אלרגיות סוסים במבחנה. שלו מאפשר קביעת כמות המתווך שפורסם על ידי תאים של תא פיטום / שושלת זופילים ובכך ניתן לצפות לקידום מחקר באלרגיה לסוסים, אם הערכת אלרגיה גורמת לסוכנים, או לחקור IgE / קולט חסימת סוכנים.

assay זה שונה כדי ללמוד אלרגיה סוסים מפרסומים קודמים שהשתמשו בו כדי ללמוד אלרגיות אדם וכלבי ⁴⁵²⁹ לאותן מטרות. קו התאים המהונדסs מביע אנושי וFcεRIα כלבים הועסקו ללמוד את היעילות ובטיחות של סוכני חסימת אלרגיה כגון חיסוני מיקוד העיכוב של האינטראקציה IgE / קולט ^30. החקירה חשפה תופעת לוואי anaphylactogenic של immunogens המרכיב את תחום Cε3 כולו, שגם הוצע על ידי אחרים כחיסון להחלשת תגובה אלרגית בתיווך IgE בכלבי ^24. בהתבסס על החקירה שלנו, את הבסיס המולקולרי לסיבוך רציני זה יכול להיות רציונליזציה על בסיס הכרה באפיטופים בנוגדן IgE על ידי סרום החיסון נגד IgE המכיל נוגדנים נגד IgE אשר יעד epitopes בCε3 ולא מוסתר על כאשר IgE הוא ומורכב לקולטן שלו. תצפית זו לא נעשתה בהיעדר מערכת assay זה והוא בניגוד בולט לחקירה על ידי ^24, שחקרה גם את אסטרטגית התערבות אנטי-אלרגיה המבוססת על in vivo immunization עם תחומים Cε3, אך לא דן בבטיחות של האסטרטגיה נובע מהעדר assay כזה.

השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הוא להבטיח כי הרוב המכריע של תאי RBL-2H3.1 הוא של פנוטיפ הסתרתו; יש תאים בתרבית יותר מ -10 שבועות גורם להם להתחיל להיסחף לכיוון פנוטיפ שאינו מפריש ²⁷ ללא קשר אם הם הביעו FcεRIα המשובט של עניין או לא. לכן זה תמיד חיוני כדי להפעיל פקדים חיוביים העכבר IgE לצד הניסוי (איור 1), ולהחזיק מלאי קפוא גדולים של מפריש תאים.

יתר על כן, את ה- pH של כל המאגרים חייב להיות מדויק או שהם מסתכנים במתן תוצאות שליליות כוזבות; הארכת חיי המדף של מאגרים משנה pH שלהם, ולכן כל חיץ מעל גיל 2 חודשים צריך להיות מושלך.

הטכניקה מראה את האינטראקציה של חומר כימי עם ce RBL-2H3.1LLS, וכיצד הוא מקדם, או מונע, שחרור המתווך שלהם במבחנה. זו אינדיקציה טובה למה שעלול לקרות בvivo, וכך בפרוטוקול זה הוא צעד חיוני, כאשר במחקר אסטרטגיות טיפוליות אנטי-אלרגיה פוטנציאליות. הטכניקה אינה, עם זאת, לציין באיזה חלק של הנוגדן / מורכב קולט המולקולה של עניין אינטראקציה עם.

עבודה אחר מחקר, כגון ²⁰ הצביעה על כך שהלשכה לביקורת סוסים אינה קשורה לגישור IgE, ולכן חלק מהפער ניתן לראות עם מו"לים אחרים כמו et al. ^{ביום 31 בעת} שימוש בסרום סוסים כולל לבדוק לCa ^{2 +} זרם מורן מ לשכה לביקורת סובלת סוסים באמצעות נוגדני reaginic נוקבים, שנוגדנים שונים יהיו אחראים לזרם הסלולרי Ca ^{2 +.}

assay זה הוא ספציפי לרגישויות יתר IgE בתיווך, אשר יכול להיות מיושמים גם לאורגניזמים אחרים, כגון בני אדם וכלבי ^29, ומשמש במיוחד כדי לבדוק את הבטיחות של אסטרטגיות התערבות אנטי-אלרגית, כגון סינטטיים נוגדנים / chimeric נגד אלרגיה ^30.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	-	-	Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA	-	-	Produced in the lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	-
Multi Channel Pipette	Anachem	-	-
Incubator	Galaxy R	-	-
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer	Anthos Labtec HT2	-	-
Pipes	Sigma	P1851	-
Sodium Chloride	Sigma	S7653	-
Potassium Chloride	Sigma	P9333	-
Magnesium Chloride	Sigma	M2670	-
Calcium Chloride	Sigma	C1016	-
Triton x100	Sigma	X100	-
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	-
Citric Acid	Sigma	251275	-
Sodium Acetate	Sigma	S7670	-
Tris	Sigma	T5941	-