Introduction
アレルギーは、数千年前から知られている。喘息治療はエーベルス·パピルス（〜1550 BCE）として知られている古代エジプトの医学のテキストで説明して7を治療するための薬草療法を検討した。
今日アレルギーはTヘルパー細胞2型（TH 2）免疫系のアームはアレルゲンと呼ばれる、環境抗原に応答して、免疫グロブリンE（IgE）抗体の産生を操縦するI型過敏性反応、に分類される。 IgEの合成を高めるタバコの煙やディーゼル排気微粒子中の粒子がそうであるように、これらは9、インターロイキン-4およびインターロイキン13 8を含む一般的に免疫系の細胞と相互作用し、炎症誘発性サイトカインの合成および分泌を刺激する多様な物質である10。
過去50年間で先進国におけるアレルギー症状の上昇はの効果の組み合わせに起因している「衛生仮説」11によって提案されたように、TH 2サイトカインによって支配プロファイルに対する免疫応答をシフトするために組み合わせる環境汚染物質、より衛生的な環境へのトレンド、。
上述したように、人間がアレルギーに悩まさ唯一の哺乳類ではありません。注目すべき馬と犬はまた、古典的なアレルギー反応を開発することができますし、12の調査によると、人間のように、馬アレルギーは遺伝的要因と環境的要因に起因する、ことを示している。結果として、これらの動物は、一度臨床症状がで設定したアレルギーの遺伝的および環境的な原因、病気への感作からの進行、および可能な介入戦略との間の相互作用を研究するための優れたモデルを提示
1887年に、Stömmerは、馬の心血管系に対するヒスタミンの効果がある、人間と馬の喘息13の間の類似性を記述した最初の人だった人間14のものと非常に類似している。馬はまた、年間15米1150億ドルの賭け売上高は720億ドル、米国の価値がある競馬産業の礎である。
ほとんどの現代的な競走馬以降1878からレディアン·ブラントによって繁殖アラビア馬の数が少ないの子孫である。現代の競走馬は、一般的にパフォーマンス能力を選択するために近交系されている。彼らは、アレルギー反応をマウントするそれらの感受性であるそのうちの一つ、遺伝性疾患になりやすいです。彼らはまたも、最も深刻なアレルギー人間16よりも1000倍高い血清IgEレベルを持っている。馬アレルギー反応は、通常、虫刺され過敏症（IBH）17、18として明示されている。IBH結果は皮膚炎に起因刺されに属ヌカカで昆虫を形成する。ウマのアレルギー性疾患の別の形態は、これは肺と気道で明らかにされて、再発性気道閉塞（RAO）である。それは、喘鳴やラボによって特徴づけられるOR演算呼吸。 RAOは、一般的に胞子を成形することに応答して発生し、別の調査がこの20を確認していないが、高アレルゲン特異的IgEレベルは、一つの研究19にRAOに罹患している馬に記録された。
ウマアレルギーに関する研究の試みモニタリングにおける、および抗ウマのIgEモノクローナル抗体（mAb）21,22を開発することによって、馬のIgEを中和することを中心に展開し、さらに23による研究では、馬の高親和性Fc受容体のαの細胞外ドメインの生産を議論ウマ血清IgEを検出し、定量する試みで、チェーン（FcεRIα）受容体。 Ledin 24による関連研究では、自己/非自己免疫原を使用して免疫系をプライミングすることにより、血清IgEを中和することを目的とした新しいアプローチについて説明します。すべてのこれらの研究は、しかし、それらのプロトコルの安全性と有効性を試験するための効果的なアッセイを欠いていた。この記事では、我々は今そのようなアッセイsysを提示βヘキソサミニダーゼ放出馬システム、関連する診断および治療戦略の研究に適用可能なTEMは、細胞メディエーターの脱顆粒の指標として、ウマFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞で評価した。このプロトコルは、異なる種由来のIgEに対する高親和性受容体のIgE結合ドメインをコードする遺伝子でトランスフェクトしたRBL細胞の工学を記述する先の刊行物25、4、5、2、3に基づいている。プロトコルは、結果は、三連の実験の平均値±標準偏差として提示されているβヘキソサミニダーゼ放出アッセイを実行する方法について説明します。
放出アッセイは、最初Siraganianによって開発され、人間のアレルギーを研究するために25をフックした。博士ルーベンSiraganian率いる研究室グループは、RBL細胞株を開発した。これらのRBL細胞は、ヒトFcεRIαを表現するために開発され、プロトコルが4によって出版された。最後のピースアッセイのハプテン4-ヒドロキシ-3-を標的IgEの可変領域をマウス遺伝子の下流に、その重鎖遺伝子をクローニングすることにより、IgE抗体の産生を記載しノイバーガー26の論文でのpSVプラスミドの開発に付属 - ニトロフェナセチル（NP）、得られたキメラ抗体は、完全に機能した。また、RBL細胞の表面上のその受容体をクローニングしながら、同じハプテンを対象とした全てのIgEを開発する能力は、好塩基球細胞の脱顆粒を測定するための有用なプロトコル作るアッセイの標準化をもたらした。
アッセイは、長所と短所を持っています。このアッセイの利点は、任意の哺乳動物系で使用される適応性である、我々の研究室は、ヒト、イヌおよびウマのシステムにおいて脱顆粒をテストするためにそれをこのように使用されており、これは、生物のIgEの合成およびその受容体をクローニングすることによって、単純に達成可能であるRBL細胞の表面上に。
一方、アッセイの短所は、RBL細胞は、それらを同じアッセイ内の脱顆粒のレベルの変化を与えること、熱的、機械とPH変化に非常に敏感であるということです。それは、このように強くアッセイは常に三重に繰り返された後、平均がそれらから取られることをお勧めします。また、RBL細胞は、彼らのメンテナンスが煩雑になっ、延長時間（> 10週間）27組織培養で残っている場合、非放出表現型へシフトする傾向がある。彼らはまた、光学顕微鏡からは見えませんし、細胞の形態を変化させないマイコプラズマ細菌による感染症になりやすいですが、劇的に彼らの脱顆粒レベルを変更します。このように定期的なマイコプラズマ試験が必要とされている。
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Protocol
細胞株の1）準備：
- 馬のFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞株の開発：
- 単層細胞株についての基本的な組織培養技術を用いて、pEE6プラスミドを使用して、親RBL-2H3.1細胞をトランスフェクト、ウマFcεRIα遺伝子（GenBank：Y18204.1）を有する28。 1.2×10 7細胞ml -1の濃度で細胞の0.8ミリリットルにプラスミドDNA2μgのμlの-1を追加します。その後すぐに氷上で10分間インキュベート0.4cmのelectrocuvetteを使用して、250V、960μFで細胞をエレクトロポ。
- その後、蛍光IgE抗体とそれらをタグ付けすることによって、FACSを通して残りの生きた細胞をソートし、ジェネティシンG418硫酸0.4グラムを含む培地を使用して形質転換細胞を選択します。捜査2、3のための馬FcεRIα細胞株を発現している結果としてRBL-2H3.1を使用してください。
- プレ検定抗体感作性：
- 1 ngのml -1の最終的な濃度に懸濁した細胞への関心のIgEを追加した列1-6で96ウェルプレートに100μlの細胞をプレートし、37℃+ 5％CO 2 + 90％でインキュベート16時間、相対湿度。インキュベーション時間の後、および放出アッセイを行う前に、ウェルの集密度及び細胞接着のために顕微鏡下で、ウェルをチェックしてください。
2）放出アッセイ：
- 細胞を洗浄する。
- 穏やかな細胞洗浄を可能にするために、37℃の温放出緩衝液（25mMのPIPES、120mMの塩化ナトリウム、5mMの塩化カリウム、0.04 mMの塩化マグネシウム、および1mM塩化カルシウム）。
- 、細胞培地を除去するためにプレートをフリックと暖かい100μlを加えることにより、細胞を洗浄37℃で、放出緩衝液。二回繰り返します。
- 抗原チャレンジ：
- 0.1、0 ngのmlと-1の抗原の段階希釈（NIP-HSAまたはDNP-HSA）を調製NGミリリットル-1、1 ngのmlで-1、10 ngのmlを-1、100 ngのmlで-1、千ngのミリリットル-1 10,000 ngのリリース·バッファ内ミリリットル-1および37℃で温めて。
- 第二の細胞の洗浄後、メディアを破棄し、抗原溶液100μlで置き換え。同じ行のウェル（例えばA1-6）が同じ抗原濃度がそれらに追加されていることを確認してください。
- 0 ngのml -1の抗原を添加することにより、行Aにおける負の制御を設定します。陽性対照として使用する細胞を溶解するために、行H細胞におけるトリトン緩衝液（5％トリトンX-100）に続く行（BG）ダウン増大抗原濃度を追加する。細胞がそのメディエーターを放出できるように20分間37℃でインキュベートする。
- 個々のウェルコントロールの設定：
- インキュベーション後、プレートのもう半分（井戸A1-6井戸A7-12へ、等）への細胞上清50μlを移す。上清の残りを50μlを破棄して、列1-6のセル内の全メディエーターの割合として列7-12に各ウェルにリリースメディエーターの量の測定を可能にするためにトリトン-X緩衝液50μlと交換。
- 酵素基質：
- 50（クエン酸緩衝液に添加することにより2mMのにまで希釈されたDMSO中で調製した50 mMの4-ニトロフェニルN-アセチルβ-Dグルコサミニド0.2 Mクエン酸、0.2 M酢酸ナトリウム、pH 4.5）βヘキソサミニダーゼ基質のμlを添加するすべてのウェルにβヘキソサミニダーゼ酵素による4-ニトロフェノールへの基質の変換を容易にします。 2時間、37℃でプレートをインキュベートする。
- 反応を停止する。
- 各追加150μlのトリス緩衝液（1 Mトリス-HCl、pHを9）により反応を停止ならびに緩衝液の高いpHは、反応を停止させ、黄色に4-ニトロフェノールをオン。
- 結果を読み込むと分析する：
- 黄色の吸光度を測定するために405nmでプレート分光光度計を用いてプレートをお読みください。以下の式を用いて放出βヘキソサミニダーゼの割合を算出した。
- 平均値を行ごとに取得された後、各ウェルにこの数式を適用します。 A1およびA7が96ウェルプレートのウェルの位置を表す。 agai（総メディエーター放出に相当）βヘキソサミニダーゼ放出の割合のグラフをプロットします抗原濃度2,3 NST。
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Representative Results
親RBL-2H3.1細胞およびウマFcεRIα受容体遺伝子でトランスフェクトされたものが最初にマウスIgE抗DNP-HSAで感作し、DNP-HSA抗原でチャレンジした。マウスIgEは、両方の細胞株における内因性ラット受容体に結合し、したがってメディエーター（ 図1 A）を放出するために、両方の細胞株の放出生存度を試験するための対照として働く。これは重要な検査であり、細胞培養における延長（> 10週間）経過時に、RBL-2H3.1細胞を非分泌表現型27に向かってドリフトするので、日常的に行われるべきである。馬FcεRIα受容体を発現する細胞は、5.76パーセント±45.99パーセントのピークメディエーターの放出を有していた親細胞が、4.79パーセント±51.54パーセントのピークメディエーターの放出を支持した。その後馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、NIP-HSA抗原（ 図1B）でチャレンジし、これらの同じ細胞株。親細胞があるので、メディエーター遊離を受けなかった馬IgEは、内因性ラット受容体に結合しない。馬のIgE抗NIP-HSAで感作し、NIP-HSA抗原でチャレンジしたときに一方、予想されるように、ウマFcεRIα受容体を発現するRBL-2H3.1細胞は、4.88パーセント±36.68パーセントのピークの放出を与え、メディエーター放出を受けた。
これらの結果は、馬のIgE受容体を介したメディエーター遊離の調査で、この放出アッセイプロトコルの効率を確認する。これは、この細胞株は、動物実験の必要性を減らす、インビトロで馬アレルギーでロバ新規な治療的介入戦略を探求するのに有用な診断ツールであることを示している。同じプロトコルはまた、ヒトおよびイヌFcεRIα受容体でトランスフェクトしたRBL-2H3.1細胞に適用可能である。
このプロトコルはまた、IgEが30抗体イヌ血清を中和しようとする潜在的な免疫戦略の安全性を試験するために使用された。結果から（ 図2）、それは、免疫化戦略は安全ではないと判断することができる。元々血清IgEを中和し、その受容体に結合するのを防ぐために意図されていた抗イヌIgEの血清が正常イヌのIgEに結合した。しかし、この結合は非特異的であり、したがって、抗IgE血清クロスこの免疫戦略は、抗アレルギーワクチンとして使用された場合、潜在的にアナフィラキシーショックをもたらすメディエーターの放出をもたらす、細胞の表面上の受容体に結合された。
| 馬FcεRIαを表現RBL-2H3.1 | - | - | ラボで生産 |
| 馬IgE抗NIP-HSA | - | - | ラボで生産 |
| 96ウェルプレート | シグマ | CLS3595 | - |
| マルチチャンネルピペット | Anachem | - - | |
| インキュベーター | ギャラクシーR | - | - |
| 4Hydroxy -5-ヨード-3-ニトロフェニル酢酸 | ケンブリッジリサーチ·バイオケミカルズ | N-1070から1 | NIP-OHは、研究室でNIP-HSAを作るためにヒト血清アルブミンと結合させた |
| ヒト血清アルブミンにジニトロフェニル共役 | シグマ | A6661 | 短縮DNP-HSA |
| プレート分光光度計 | Anthos LABTEC HT2 | - | - |
| パイプ | シグマ | P1851 | - |
| 塩化ナトリウム | シグマ | S7653 | - |
| 塩化カリウム | シグマ | P9333 | - |
| 塩化マグネシウム | シグマ | M2670 | - |
| 塩化カルシウム | シグマ C1016 | - | |
| トリトンX100 | シグマ | X100 | - |
| 4-ニトロフェニルN-アセチルβ-Dグルコサミニド | シグマ | N9376 | 原液と呼ばれるβヘキソサミニ基板を50mMのDMSOに調製した。 |
| ジメチルスルホキシド | シグマ | D2650 | - |
| クエン酸 | シグマ | 251275 | - |
| 酢酸ナトリウム | シグマ | S7670 | - |
| トリス | シグマ | T5941 | - |
表1：材料および機器の表：
図1： Aはありません馬FcεRIαを発現させ、マウスIgE抗DNP-HSAを使用して受容体を発現するRBL-2H3.1細胞上に予め形成された放出アッセイを示している。したがって、両方の細胞株は生存可能であり、サポートされていることを確認し、DNP-HSA抗原でチャレンジ抗原誘発性メディエーター放出2,3 IgE媒介。グラフBは予め形成された放出アッセイを示しているときにマウスIgEはメディエーター放出をもたらす内因性ラット受容体に結合する馬FcεRIαを発現させ、細胞感作のために馬のIgE抗NIP-HSAを使用して馬FcεRIαを発現するものではなく、RBL-2H3.1親細胞上。馬IgEは、これは、細胞が誘導された馬の受容体のサポートウマIgE媒介、抗原を発現しながら、親細胞が、メディエーターメディエーターを放出しなかったので確認され、メディエーター放出をもたらすように、内因性ラット受容馬の受容体に結合するではなく、 、メディエーター放出2、3。
図2：免疫放出アッセイの結果：グラフは細胞感作のためにイヌのIgE抗NIP-HSAを使用して、イヌFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞上に予め形成された放出アッセイを示し、抗原として免疫したラット抗イヌIgEの血清。使用されるコントロールは、血清を事前に免疫し、そしてポジティブコントロールは、NIP-HSA抗原であった。犬のIgEは、イヌ受容体に結合する。さらに、抗IgE血清メディエーター放出をもたらす細胞の表面上の受容体に結合したイヌのIgEおよびクロスリンク、それ、および受容体に結合する。これは、実際には、この特定の免疫戦略はアナフィラキシーショック反応を起こす可能性があるため、30安全とみなされていないことを証明している。
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Discussion
要約すると、この調査の結果は、馬FcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞は馬のIgEで感作し、抗原によって挑戦されたとき、彼らは内部のメディエーターの合計量の4.88パーセント±36.68パーセントのピークメディエーター放出を与えることを示した馬FcεRIαを発現していないRBL-2H3.1親細胞に比べて細胞、。
したがって、このアッセイは、in vitroでの馬のアレルギー反応を調査し、研究するための有用なツールを提供します。そのことができ、従って、肥満細胞/好塩基球系統の細胞によって放出さメディエーターの量の測定は、アレルギーを引き起こす物質を評価すること、またはIgE /受容体遮断薬を研究するかどうか、馬アレルギーの研究を進めることが期待できる。
このアッセイは、同じ目的のためにヒトおよびイヌのアレルギー4529を研究するためにそれを使用して、以前の出版物からの馬のアレルギーを研究するために変更されました。操作された細胞株人間と犬のFcεRIαを表現sがこのようなIgE /受容体相互作用30の阻害を標的とするワクチンとしてブロッキング剤アレルギーの有効性と安全性を研究するために採用された。調査はまた、犬24のIgE媒介アレルギー応答を減衰させるためのワクチンとして他者により提案された全体のCε3ドメインを含む免疫原のアナフィラキシー副作用を明らかにした。私たちの調査に基づいて、この潜在的に重篤な合併症のための分子的基礎は、IgEとき隠されていないCε3内エピトープを標的と抗IgE抗体を含有する抗IgE免疫血清によるIgE抗体におけるエピトープの認識に基づいて合理化することができたその受容体と複合体を形成している。この観察は、このアッセイ系の非存在下で行われ、また、インビボ immuniに基づく抗アレルギー介入戦略を調べた24の調査に著しい対照的であることができなかったCε3ドメインとzationが、は、そのようなアッセイが存在しないために戦略の安全性を説明していない。
このプロトコルの重要なステップは、RBL-2H3.1細胞の大部分が分泌表現型であることを保証することである。培養物中の細胞よりも大きく、10週間を有するそれらに関係なく、関心のあるクローニングされたFcεRIαを発現しているか否かの非分泌表現型27に向かってドリフトすることを開始させる。従って、実験（ 図1）と一緒にマウスIgE陽性対照を実行するために、そして分泌細胞の大凍結ストックを維持するために常に必要不可欠である。
さらに、すべての緩衝液のpHは正確でなければならないか、彼らは偽陰性結果を与えるリスク。バッファの貯蔵寿命を延長することは彼らのpHを変化させ、したがって、2カ月以上経過した任意の緩衝液を廃棄する必要がある。
技術はRBL-2H3.1のCEとの化学的相互作用を示していLLS、そしてそれはどのように促進し、または抑制し、in vitroでそれらのメディエーターの放出。これは、生体内で何が起こるかを示す目安になり、潜在的な抗アレルギー治療戦略を研究するとき、したがって、このプロトコルは不可欠なステップである。技術は、しかしながら、対象の分子と相互作用、抗体/受容体複合体の一部を示すものではない。
など20のようなその他の研究活動は、ウマRAOは、いくつかの矛盾がそのようなモランらなど、他の出版社と見ることができる理由であるIgEの調停に関連していないことが示されている。31からのCa 2+流入にテストするために、合計ウマ血清を使用した場合異なる抗体が、細胞のCa 2+流入のための責任を負うことになるいる非特異レアギン抗体を使用して、馬に苦しんRAO。
このアッセイは、ヒトなどの、他の生物に適用することが可能なIgE媒介性過敏症、に特異的であるとイヌ29、具体的には、合成/キメラ抗アレルギー抗体30などの抗アレルギー介入戦略の安全性を試験するために使用される。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | - | - | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | - | - | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | - |
| Multi Channel Pipette | Anachem | - | - |
| Incubator | Galaxy R | - | - |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | - | - |
| Pipes | Sigma | P1851 | - |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | - |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | - |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | - |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | - |
| Triton x100 | Sigma | X100 | - |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | - |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | - |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | - |
| Tris | Sigma | T5941 | - |
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