Introduction
Allergi har vært kjent i årtusener. En astma behandling ble beskrevet i den gamle egyptiske lege tekst kjent som Ebers Papyrus (~ 1550 f.Kr.) og diskutert urte rettsmidler for å behandle den 7.
I dag allergi er klassifisert som en type I hypersensitivitetsrespons, hvor T-hjelpercelle-type 2 (TH 2) arm av immunsystemet styrer produksjon av immunoglobulin E (IgE) antistoffer i respons til antigener fra miljøet som kalles allergener. Disse er forskjellige stoffer som vanligvis reagerer med celler i immunsystemet og stimulerer syntesen og utskillelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-4 og interleukin-13 8, 9 som har partikler i sigarettrøk eller dieseleksospartikler som øker IgE-syntese 10.
Økningen i allergiske manifestasjoner i industrialiserte land de siste 50 årene har blitt tilskrevet en kombinasjon av effekten avmiljøgifter og en trend til en mer pyntet miljø, som kombinerer å skifte immunresponsen mot en profil dominerte av TH 2 cytokiner, som foreslått av 'Hygiene Hypotese' 11.
Som nevnt ovenfor, mennesker er ikke de eneste pattedyr rammet av allergi. Spesielt hester og hunder kan også utvikle klassiske allergiske reaksjoner og en studie av 12 har vist at, som i mennesker, har hest allergi tilskrives genetiske og miljømessige faktorer. Som en konsekvens, presentere disse dyrene gode modeller for å studere samspillet mellom genetiske og miljømessige årsaker til allergi, dens progresjon fra allergi til sykdommen, og mulige intervensjonsstrategier gang kliniske manifestasjoner har satt i
I 1887, Stömmer var den første personen til å beskrive likheten mellom menneske og hest astma 13, er effekten av histamin på hest kardiovaskulære systemetmeget lik den hos mennesker 14. Hester er også hjørnesteinen i hesteveddeløp industrien, som er verdt US $ 72 milliarder kroner med betting omsetning på US $ 115 milliarder årlig 15.
De fleste moderne veddeløpshester er etterkommere av det lave antallet arabiske hester oppdrettet av Lady Anne Blunt fra 1878 og utover. Moderne veddeløpshester blir ofte innavlet å velge for yteevne. De er utsatt for genetiske forstyrrelser, hvorav den ene er deres følsomhet overfor montere allergiske responser. De har også 1000 ganger høyere serum IgE nivåer enn selv de mest alvorlig allergisk mennesker 16. Horse allergiske reaksjoner er vanligvis manifestert som insektbitt overfølsomhet (IBH) 17, 18. IBH resultater i dermatitt på grunn av biter danne insekter i slekten Culicoides. En annen form for heste allergisk sykdom er tilbakevendende luftveis hindringer (RAO), dette er manifestert i lungene og luftveiene. Det er preget av tungpustethet og labELLER-behandlet puste. RAO ofte oppstår i respons til muggsporer, og høye allergen-spesifikke IgE nivåer er registrert i hester som lider av RAO i en studie 19 selv om en annen etterforskning ikke har bekreftet denne 20.
Studier på equine allergi dreid forsøk på å overvåke og å nøytralisere equine IgE ved å utvikle anti-equine IgE-monoklonale antistoffer (mAbs) 21, 22. Videre studien med 23 diskuterer fremstillingen av de ekstracellulære domener av equine høy affinitet Fc-reseptor s α kjede (FcεRIα) reseptoren i et forsøk på å påvise og kvantifisere equine serum-IgE. En beslektet studie av Ledin 24 drøfter en ny tilnærming som tar sikte på å nøytralisere serum IgE ved priming immunsystemet ved hjelp av en selv / non-self immunogen. Alle disse studiene har imidlertid manglet en effektiv analyse for å teste sikkerheten og effekten av sine protokoller. I denne artikkelen har vi nå presentere en slik analyse system som gjelder for studiet av diagnostiske og terapeutiske strategier som er relevante for hestens system, der β-heksosaminidase utgivelsen, som en indikator på celle megler degranulation, ble vurdert på RBL-2H3.1 celler som uttrykker hest FcεRIα. Denne protokollen er basert på tidligere publikasjoner 25, 4, 5, 2, 3 beskriver konstruksjon av RBL-celler transfektert med genet som koder for det IgE-bindende domene av det høyaffinitets-reseptor for IgE fra forskjellige arter. Protokollen forklarer hvordan man skal utføre en β heksosaminidase-frigivelse assay, hvor resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikat-eksperimenter.
Utgivelsen analysen ble først utviklet av Siraganian og Hook 25 for å studere menneskelig allergi. Laboratoriet gruppe ledet av Dr. Reuben Siraganian også utviklet RBL cellelinje. Disse RBL celler ble utviklet for å uttrykke menneskelige FcεRIα og protokollen ble publisert av fire. Den siste brikkenav analysen kom med utviklingen av plasmidet pSV i papiret ved Neuberger 26 som beskrives fremstilling av et IgE-antistoffer ved kloning av dens tungkjede-genet nedstrøms for en mus gen for en IgE variabelt område som er rettet mot hapten-4-hydroksy-3- -nitro-phenacetyl (NP), det resulterende chimeriske antistoff var fullstendig funksjonell. Evnen til å utvikle en hvilken som helst IgE rettet mot samme hapten, samtidig kloning dens reseptor på overflaten av RBL-celler resulterte i standardiseringen av analysen gjør det et nyttig protokoll for å måle degranulering av basofile celler.
Analysen har fordeler og ulemper. Profesjonelle av analysen er dens tilpasningsevne til å bli brukt i en hvilken som helst pattedyr-system, vårt laboratorium har således benyttes den til å teste for degranulering i de humane, canine og equine systemer, og dette kan oppnås ganske enkelt ved å syntetisere organismens IgE og kloning dets reseptor på overflaten av RBL-celler.
På den annen side,cons av analysen er at RBL celler er svært følsomme for termiske, mekaniske og pH-endringer, noe som gjør dem gir en variasjon av degranulering nivåer innenfor det samme assay. Det er derfor sterkt anbefalt at analysene er alltid gjentas i tre paralleller, og deretter en gjennomsnittlig blir tatt fra dem. Videre RBL celler har en tendens til å skifte mot en ikke-frigjørende fenotype hvis de blir stående i vevskultur for en utvidet ganger (> 10 uker) 27, noe som gjør deres vedlikehold tungvint. De er også utsatt for infeksjoner av mycoplasma bakterier, som ikke er synlig fra et lysmikroskop, og ikke endrer cellenes morfologi, men ville drastisk endrer sine degranulering nivåer. Således jevn mycoplasma tester er nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) Fremstilling av Cell Line:
- Utvikling av RBL-2H3.1 cellelinje som uttrykker equine FceRI α:
- Bruke grunnleggende vevskulturteknikker for monolayer cellelinjer, transfektere foreldre RBL-2H3.1 celler ved hjelp av pEE6 plasmid, bærer hest FcεRIα genet (GenBank: Y18204.1) 28. Tilsett 2 ug -1 ul av plasmid DNA til 0,8 ml av celler ved en tetthet på 1,2 x 10 7 celler ml -1. Electroporate cellene ved 250 V 960 uF ved anvendelse av en 0,4 cm electrocuvette deretter umiddelbart inkuber på is i 10 min.
- Velg de transformerte celler ved hjelp av medier som inneholder 0,4 g geneticin G418 sulfat, deretter sortere de gjenværende levende celler gjennom FACS ved å merke dem med en fluorescerende IgE antistoff. Bruk den resulterende RBL-2H3.1 uttrykker hest FcεRIα cellelinje for etterforskningen 2, 3.
- Pre-analysen antistoff sensibilisering:
- Tilsett IgE av interesse for de suspenderte cellene til en sluttkonsentrasjon på 1 ng ml -1, deretter platen 100 ul av celler på en 96-brønners plate i kolonnene 1-6 og inkuber ved 37 ° C + 5% CO2 + 90% relativ fuktighet i 16 timer. Etter inkubasjonstiden, og før utførelse av utløser assay, kontrollerer brønnene under et mikroskop for brønn konfluens og cellene skulle vedhefte.
2) Utgivelses analyse:
- Vasking av cellene:
- Varm frigjøringsbuffer (25 mM PIPES, 120 mM natriumklorid, 5 mM kaliumklorid, 0,04 mM magnesium-klorid, og 1 mM kalsiumklorid) ved 37 ° C for å tillate skånsom vasking celle.
- Vask cellene ved å dra platen for å fjerne celle media og legge 100 mL varm, tre7 ° C, frigjøringsbuffer. Gjenta to ganger.
- Antigen utfordring:
- Forbered en seriell fortynning av antigen (NIP-HSA eller DNP-HSA) fra 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml -1, 100 ng ml -1, 1000 ng ml -1, 10 000 ng ml -1 i utgivelsen buffer og varm ved 37 ° C.
- Etter den andre cellevask, forkaste medier og erstattes med 100 ul av antigenet løsninger. Sikre at brønner i samme rad (A1-6) for eksempel ha den samme antigen-konsentrasjon tilsettes til dem.
- Sett opp en negativ kontroll i rad A ved å legge til 0 ng ml -1 antigen. Legg økende antigenkonsentrasjon nedover radene (BG), etterfulgt av triton-x-buffer (5% Triton X-100) i rad H-celler til å lysere cellene til å bli brukt som en positiv kontroll. Inkuber ved 37 ° C i 20 min for å tillate cellene og frigi dens mediatorer.
- Sette opp enkelte brønnkontroll:
- Etter inkuberingen overføre 50 ul av supernatanten til celle den andre halvparten av platebrønner (brønner til A1-6 A7-12, etc.). Kast den gjenværende 50 ul av supernatanten og erstatter med 50 ul av triton-x-buffer for å tillate måling av mengden av frigitte mediatorer i hver brønn i kolonnene 7-12 som en prosentandel av de totale mediatorer inne i cellene i kolonne 1-6 .
- Enzymsubstratet:
- Tilsett 50 pl av β-heksosaminidase substrat (50 mM 4-nitrofenyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid fremstilt i DMSO fortynnes ned til 2 mm ved å tilsette den til citratbuffer 0,2 M sitronsyre og 0,2 M natriumacetat, pH 4,5) til alle brønnene for å mulig omdannelsen av substratet til 4-nitrofenol ved β-heksosaminidase enzym. Inkuber platene ved 37 ° C i 2 timer.
- Avslutte reaksjonen:
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 150 ul Tris-buffer (1 M Tris-HCl, pH 9) til hver brønn som den høye pH av bufferen reaksjonen stopper og snur 4-nitrofenol til en gul farge.
- Lese og analysere resultatene:
- Avles platen ved hjelp av en plate spektrofotometer ved 405 nm for å måle absorbansen av den gule fargen. Beregnet prosentandelen av frigjort β-heksosaminidase ved hjelp av følgende formel:
- Bruk denne formelen til hver brønn, hvoretter en gjennomsnittlig tas for hver rad. A1 og A7 representerer plasseringen av brønnene i 96-brønners plate. Plotte en kurve over prosentandel av β-heksosaminidase-frigivelse (som tilsvarer total frigjøring mediator) igjeNST antigenkonsentrasjon 2, 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foreldre RBL-2H3.1 celler og de transfektert med hest FcεRIα reseptor genet ble først sensibilisert med musen IgE anti DNP-HSA og utfordret med DNP-HSA antigen. Mus IgE bindes til den endogene reseptoren i rotte begge cellelinjer og således virker som en kontroll for å teste levedyktigheten til frigjøring begge cellelinjer for å frigjøre mediatorer (figur 1 A). Dette er en viktig sjekk og bør utføres rutinemessig ved siden forlenget (> 10 uker) passasje i cellekultur, RBL-celler 2H3.1 drive mot den ikke-utskillende 27 fenotype. Foreldrecellene støttet en topp megler utgivelsen av 51.54% ± 4,79%, mens cellene som uttrykker hest FcεRIα reseptoren hadde en topp megler utgivelsen av 45.99% ± 5,76%. De samme cellelinjer der deretter sensibilisert med hest IgE anti NIP-HSA og utfordret med NIP-HSA antigen (figur 1 B). Foreldre celler ikke gjennom megler utgivelsen, sidenequine IgE binder seg ikke til den endogene reseptoren rotte. På den annen side, som forventet, RBL-celler som uttrykker 2H3.1 equine FcεRIα reseptoren gikk mediator frigjøring når sensibilisert med equine IgE anti-NIP HSA og utfordret med NIP-HSA-antigenet, noe som gir en topp frigjøring av 36,68% ± 4,88% .
Disse resultatene bekrefter effektiviteten av denne utgivelsen analyseprotokollen i etterforskningen av megler utgivelsen via equine IgE reseptoren. Det viser at denne cellelinjen er et nyttig diagnostisk verktøy i forsøk på å asses nye terapeutiske intervensjon strategier i hesteallergi in vitro reduserer behovet for dyreforsøk. Den samme protokoll er også anvendelig til RBL-2H3.1 celler transfektert med den humane og canine FcεRIα reseptorer.
Denne protokollen ble også anvendt for å teste sikkerheten for en potensiell immunisering strategi som forsøker å nøytralisere canine serum IgE-antistoffer 30. Fra resultatenei (figur 2) kan det bestemmes at immunisering strategi er ikke trygt. Den anti-canine-IgE serum vellykket bundet til canine IgE som var opprinnelig ment for å nøytralisere serum IgE og hindre den fra å binde på sin reseptor. Men dette ble uspesifikk binding, og dermed den anti-serum IgE kryssbundet til reseptoren på cellenes overflate, noe som resulterer i frigjøring mediator, som potensielt kan resultere i en anafylaktisk sjokk hvis denne immunisering strategi ble anvendt som et anti-allergivaksine.
| RBL-2H3.1 Uttrykke Equine FcεRIα | - | - | Produsert i laboratoriet |
| Equine IgE anti NIP-HSA | - | - | Produsert i laboratoriet |
| 96-brønners plate | Sigma | CLS3595 | - |
| Multi Channel Pipette | Anachem | - - | |
| Inkubator | Galaxy R | - | - |
| 4-hydroksy-5-jod-3-nitrophenylacetic syre | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH ble konjugert med humant serumalbumin for å gjøre NIP-HSA i laboratoriet |
| Dinitrofenyl konjugert til humant serumalbumin | Sigma | A6661 | Forkortet DNP-HSA |
| Plate spektrofotometer | Anthos Labtec HT2 | - | - |
| Rør | Sigma | P1851 | - |
| Natriumklorid | Sigma | S7653 | - |
| Kaliumklorid | Sigma | P9333 | - |
| Magnesiumklorid | Sigma | M2670 | - |
| Kalsiumklorid | Sigma C1016 | - | |
| Triton x100 | Sigma | X100 | - |
| 4-nitrofenyl-N-acetyl-β-D-glukosaminid | Sigma | N9376 | Lager løsning kalt β-heksosaminidase substrat ble 50 mM utarbeidet i DMSO |
| Dimethylsulfoxyd | Sigma | D2650 | - |
| Sitronsyre | Sigma | 251275 | - |
| Natriumacetat | Sigma | S7670 | - |
| Tris | Sigma | T5941 | - |
Tabell 1: Tabell over materiell og utstyr:
Figur 1: A viser utgivelsen analysen preformed på RBL-2H3.1 celler ikke uttrykker hest FcεRIα og uttrykker reseptoren ved hjelp av musen IgE anti DNP-HSA. Musen IgE binder seg til den endogene rotte reseptoren fører til megler utgivelsen når utfordret med DNP-HSA antigen, noe som bekrefter at begge cellelinjene er levedyktige og støtte IgE-mediert antigen indusert megler utgivelsen 2, 3. Graf B viser utgivelsen analysen preformed på RBL-2H3.1 foreldre celler som ikke uttrykker equine FcεRIα og de uttrykker equine FcεRIα, ved hjelp av hest IgE anti NIP-HSA for celle sensibilisering. Equine IgE binder seg til equine reseptoren, men ikke den endogene reseptoren rotte, mekleren å resultere i frigjøring, siden dette er bekreftet de parentale celler ga ikke ut mediator mediatorer, mens cellene som uttrykker reseptoren equine støtte equine IgE-mediert, antigen indusert , megler slipper 2, 3.
Figur 2: Immunization utslipp analyseresultatene: Grafen viser utgivelsen analysen preformed på RBL-2H3.1 celler som uttrykker canine FcεRIα, ved hjelp canine IgE anti NIP-HSA for celle allergi, og vaksineres rotte anti-canine-IgE serum som antigen. Styre brukt var pre-immunisert serum, og den positive kontroll var NIP-HSA-antigen. Canine IgE binder seg til canine reseptoren. Videre binder anti-IgE serum til reseptoren bundet hund IgE og kryss koblinger det, og reseptoren, på cellenes overflate som resulterer i mediator release. Dette, i kraft, viser at denne spesielle immunisering strategien har potensial til å forårsake en anafylaktisk sjokk reaksjon, og regnes derfor ikke trygt 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oppsummert resultatene av denne undersøkelsen viste at når RBL-2H3.1 celler som uttrykker equine FcεRIα er sensibilisert med hest IgE og utfordret av et antigen, gir de en topp megler utgivelsen av 36,68% ± 4,88% av den totale mengden av megler inne i celler, sammenlignet med RBL-2H3.1 foreldre celler ikke uttrykker hest FcεRIα.
Derfor er denne analysen gir et nyttig verktøy for å undersøke og studere hestens allergiske reaksjoner in vitro. Dens tillater bestemmelse av mengden av mediator utgitt av celler av mastcelle / basofil avstamning og kan således forventes å fremme forskning i equine allergi, enten vurderingen av allergifremkallende midler, eller undersøker IgE / reseptor-blokkerende midler.
Denne analysen ble endret for å studere hest allergi fra tidligere publikasjoner som brukte den til å studere menneskelige og hjørnetann allergi 4529 for samme formål. Den konstruerte cellelinjes uttrykke menneskelige og hjørnetann FcεRIα ble ansatt for å studere effekt og sikkerhet av allergi blokkerende midler som for eksempel vaksiner rettet mot hemming av IgE / reseptorinteraksjon 30. Undersøkelsen avdekket en anaphylactogenic bivirkning av immunogenene bestående hele Cε3 domene, som også ble foreslått av andre som en vaksine for å dempe IgE-medierte allergiske reaksjoner hos hunder 24. Basert på vår undersøkelse, kunne den molekylære basis for denne potensielt alvorlig komplikasjon rasjonaliseres på grunnlag av gjenkjenning av epitoper i IgE-antistoff av anti-IgE-immunserum inneholdende anti-IgE-antistoffer som er rettet mot epitoper i Cε3 og er ikke skjules når IgE er kompleksdannet til dets reseptor. Denne observasjonen kan ikke har blitt gjort i fravær av dette assay-system og er i slående kontrast til undersøkelsen ved 24, som også undersøkt med anti-allergiske inngrep strategi basert på in vivo immunization med Cε3 domener, men har ikke diskutert sikkerheten av strategien på grunn av fravær av et slikt assay.
De kritiske trinn av denne protokollen er å sikre at hoveddelen av RBL-celler er 2H3.1 av secreting fenotype; som har de celler i kultur som er større enn 10 uker får dem til å begynne å drive mot den ikke-sekreterende fenotype 27 uavhengig av om de uttrykte klonede FcεRIα av interesse eller ikke. Derfor er det alltid nødvendig å kjøre mus IgE positive kontroller ved siden av eksperimentet (figur 1), og for å opprettholde en stor frosset lager av utsondrende celler.
Videre må pH-verdien i alle buffere være nøyaktig eller de risikerer å gi falske negative resultater; forlenge holdbarheten av buffere endrer deres pH-verdi, og dermed en hvilken som helst buffer som er eldre enn 2 måneder må kasseres.
Teknikken viser interaksjonen av et kjemisk med RBL-ce 2H3.1LLS, og hvordan den fremmer, eller undertrykker, deres mellommann utgivelse in vitro. Dette er en god indikasjon på hva som kan skje in vivo, og dermed denne protokollen er et viktig skritt når forsker potensielle anti-allergi terapeutiske strategier. Teknikken har imidlertid ikke indikere hvilken del av antistoff / reseptor-komplekset molekylet av interesse samhandler med.
Annen forskning arbeid, for eksempel 20 har indikert at equine RAO ikke er relatert til IgE mekling, noe som er grunnen til at noen avvik kan sees med andre utgivere som Moran et al. 31 ved bruk av total hest serum for å teste til Ca 2+ tilstrømningen fra RAO lider hester ved hjelp av uspesifikke reaginisk antistoffer, som forskjellige antistoffer vil være ansvarlig for den cellulære Ca 2+ tilstrømningen.
Denne analysen er spesifikk for IgE-medierte hypersensitivities, som også kan anvendes på andre organismer, så som mennesker og29 hunder, og spesielt brukt for å teste sikkerheten av anti-allergiintervensjons strategier, for eksempel syntetiske / chimeriske anti-allergi-antistoffer 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | - | - | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | - | - | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | - |
| Multi Channel Pipette | Anachem | - | - |
| Incubator | Galaxy R | - | - |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | - | - |
| Pipes | Sigma | P1851 | - |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | - |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | - |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | - |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | - |
| Triton x100 | Sigma | X100 | - |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | - |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | - |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | - |
| Tris | Sigma | T5941 | - |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , The University of Sheffield. Sheffield. (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G.
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The 'hygiene hypothesis' for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of 'Broken Wind' in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J.
- Bruggink, M. Global betting stable, but some countries suffer recession. , International Federation of Horseracing Authorities. Available from: http://www.horseracingintfed.com/Default.asp?section=Resources&area=0&story=664 (2009).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , American Society for Microbiology. Washington, D. C. (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , The University of Sheffield. (2010).
- Sabban, S., et al.
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
