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Immunology and Infection

Entwicklung eines doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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Allergie ist seit Jahrtausenden bekannt. Ein Asthma-Behandlung wurde in der antiken ägyptischen medizinischen Text als Papyrus Ebers (~ 1550 BCE) bekannt beschrieben und diskutiert pflanzliche Heilmittel, um es 7 zu behandeln.

Heute Allergie ist als Typ I-Überempfindlichkeitsreaktion, wobei die T-Helferzell-Typ 2 (TH 2) Arm des Immunsystems steuert die Produktion von Immunglobulin E (IgE) Antikörper als Antwort auf Umweltantigene, Allergene genannt klassifiziert. Dies sind diverse Stoffe, die üblicherweise mit Zellen interagieren im Immunsystem und stimulieren die Synthese und Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen, einschließlich IL-4 und Interleukin-13 8, 9 als weiß Partikel im Zigarettenrauch oder Dieselabgaspartikeln, die IgE-Synthese zu erhöhen 10.

Der Anstieg der allergischen Manifestationen in Industrieländern in den letzten 50 Jahren hat sich eine Kombination der Wirkung zugeschriebenUmweltschadstoffe und ein Trend zu einer keim Umgebung, die die Immunantwort gegenüber einem Profil von TH 2 Zytokine überwog verschieben kombinieren, wie durch die "Hygiene-Hypothese" 11 vorgeschlagen.

Wie oben erwähnt, sind Menschen nicht nur Säugern durch Allergie leidet. Insbesondere Pferden und Hunden entwickeln auch klassische allergische Reaktionen und eine Untersuchung von 12 zeigt, dass, wie beim Menschen, wird equine Allergie auf genetischen und Umweltfaktoren zurückzuführen. Als Folge präsentieren diese Tiere gute Modelle zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen genetischen und umweltbedingten Ursachen von Allergien, ihr Fortschreiten von Sensibilisierung gegen Krankheit und mögliche Interventionsstrategien einmal klinischen Manifestationen in gesetzt

1887 Stömmer war die erste Person, die Ähnlichkeit zwischen Mensch und Pferde-Asthma 13 zu beschreiben, ist die Wirkung von Histamin auf der Pferdeherzkreislaufsystemsehr ähnlich dem des Menschen 14. Pferde sind auch der Grundstein der Pferderennindustrie, die es wert USD 72 Milliarden mit einem Wettumsatz von US $ 115.000.000.000 jährlich 15.

Die meisten zeitgenössischen Rennpferde sind Nachkommen von der geringen Zahl der arabischen Pferde von Lady Anne Blunt seit 1878 gezüchtet. Moderne Rennpferde werden häufig Inzucht für Performance Fähigkeiten auszuwählen. Sie sind anfällig für genetische Erkrankungen, von denen eine ihre Anfälligkeit für allergische Reaktionen zu montieren. Sie haben auch 1000 mal höhere Serum-IgE-Spiegel als selbst die am schwersten allergischen Menschen 16. Pferde allergischen Reaktionen sind in der Regel als Insektenstich Überempfindlichkeit (IBH) 17, 18 manifestiert. IBH Ergebnisse in Dermatitis durch Bisse bilden Insekten aus der Gattung Culicoides. Eine andere Form der Pferde-allergische Erkrankung ist rezidivierenden Atemwegsobstruktionen (RAO), dies in den Lungen und Atemwegen manifestiert. Es wird von Keuchen und Labor gekennzeichnetODER-verknüpft Atmung. RAO tritt häufig als Reaktion auf Sporen zu formen, und hohe allergenspezifische IgE-Spiegel haben bei Pferden, die an RAO in einer Studie 19 registriert worden, obwohl ein anderer Untersuchung nicht bestätigt diesen 20.

Studien über equine Allergie drehte sich um die Versuch Überwachung und Neutralisieren equine IgE durch die Entwicklung anti equine IgE monoklonalen Antikörpern (mAb) 21, 22. Weiterhin die Studie von 23 diskutiert die Produktion der extrazellulären Domänen der α equinen Hochaffinitäts-Fc-Rezeptors Kette (FcεRIα) Rezeptors in einem Versuch zu detektieren und zu quantifizieren Pferdeserum IgE. Eine verwandte Studie von Ledin 24 bespricht einen neuen Ansatz bei der Neutralisierung Serum-IgE durch Priming des Immunsystems mit einem selbst / Nicht-Selbst Immunogen gerichtet. Alle diese Studien fehlte aber eine wirksame Assay, um die Sicherheit und Wirksamkeit der Testprotokolle. In diesem Artikel haben wir jetzt eine solche Assay sys präsentierentem für die Untersuchung der relevanten equinen System, in dem β-Hexosaminidase Release, als Indikator für die Zellmediator Degranulation wurde für RBL-Zellen, 2H3.1 equine FcεRIα beurteilt diagnostische und therapeutische Strategien. Dieses Protokoll basiert auf früheren Veröffentlichungen 25, 4, 5, 2, 3 das Engineering von RBL-Zellen mit den IgE-Bindungsdomäne des hochaffinen IgE-Rezeptors verschiedener Spezies kodiert, transfiziert Beschreibung basiert. Das Protokoll beschreibt, wie ein β-Hexosaminidase-Freisetzungstest durchzuführen, deren Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardabweichung von dreifachen Experimenten dargestellt.

Der Freisetzungstest wurde zuerst von Siraganian entwickelt und Haken 25 Menschenallergie zu untersuchen. Das Labor Gruppe von Dr. Reuben Siraganian führte entwickelte auch die RBL-Zelllinie. Diese RBL Zellen wurden entwickelt, um die menschliche FcεRIα auszudrücken und das Protokoll wurde von 4 veröffentlicht. Das letzte Stückder Test wurde mit der Entwicklung des Plasmids pSV in der Veröffentlichung von Neuberger 26, die die Produktion von IgE-Antikörpern durch Klonierung ihrer Schwerketten-Gen stromabwärts von einem Maus-Gen für eine variable Region, die IgE das Hapten 4-Hydroxy-3 zielt beschrieben nitro-Phenacetyl (NP), war die resultierende chimäre Antikörper, vollständig funktionsfähig. Die Fähigkeit, jede IgE entwickeln die die gleichen Hapten, wobei auch die Klonierung seinen Rezeptor auf der Oberfläche der RBL-Zellen führte zu der Standardisierung des Assays so dass es ein nützliches Protokoll, um die Degranulation von Basophilen Zellen zu messen.

Der Test funktioniert haben Vor- und Nachteile. Die Profis des Assays ist seine Anpassungsfähigkeit an irgendeinem Säugersystem verwendet werden, unser Labor ist somit benutzt, um die Degranulation der Mensch, Hund und Pferde Systeme zu testen, und dies ist erreichbar, einfach durch Synthetisieren des Organismus IgE und Klonieren seinen Rezeptor auf die Oberfläche der RBL-Zellen.

Andererseits,die Nachteile des Assays ist, dass die RBL-Zellen sind sehr empfindlich gegen thermische, mechanische und PH ändert, so dass sie eine Veränderung der Degranulation Ebenen innerhalb des gleichen Assay zu ergeben. Es wird daher dringend empfohlen, dass die Tests werden immer dreifach wiederholt und dann ein Mittelwert von ihnen genommen. Darüber hinaus sind die RBL-Zellen sind in der Regel zu einer nicht-freisetzenden Phänotyp verschieben, wenn sie in der Gewebekultur für längere Zeiten (> 10 Wochen) 27 übrig sind, was ihre Wartung umständlich. Sie sind auch anfällig für Infektionen durch Mycoplasma-Bakterien, die nicht von einem Lichtmikroskop sichtbar sind und nicht die Morphologie der Zelle ändern, würde aber ihre Degranulation Ebenen drastisch ändern. So regelmäßigen Mykoplasmen-Tests erforderlich.

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Protocol

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1) Herstellung der Zelllinie:

  1. Die Entwicklung der RBL-2H3.1 Zelllinie, Pferde FcsRI α:
    1. Mit grundlegenden Gewebekulturtechniken für Monolayer-Zelllinien, Transfektion Eltern RBL-2H3.1 Zellen unter Verwendung des pEE6 Plasmid, die Durchführung der Pferde FcεRIα Gens (GenBank: Y18204.1) 28. Hinzufügen 2 ug ul -1 der Plasmid-DNA auf 0,8 ml Zellen bei einer Dichte von 1.2 x10 & sup7; Zellen ml -1. Elektroporieren der Zellen bei 250 V 960 uF mit einem 0,4 cm electrocuvette dann sofort auf Eis inkubieren für 10 min.
    2. Auswahl der transformierten Zellen unter Verwendung von Medien, die 0,4 g Geneticin G418 Sulfat, sortiert dann die verbleibenden lebenden Zellen durch FACS durch Markieren sie mit einem Fluoreszenz IgE-Antikörper. Verwenden Sie die resultierende RBL-2H3.1 ausdrücken Pferde FcεRIα Zelllinie für die Untersuchung 2, 3.
  2. Pre-Test Antikörper Sensibilisierung:
      5 Zellen ml -1.
    1. Hinzufügen des IgE von Interesse für die suspendierten Zellen zu einer Endkonzentration von 1 ng ml -1, dann die Platte 100 & mgr; l der Zellen auf eine Platte mit 96 Vertiefungen in den Spalten 1-6 und bei 37 ° C + 5% CO 2 + 90% relative Luftfeuchte für 16 Stunden. Nach der Inkubationszeit und vor der Durchführung der Freisetzungstest, überprüfen Sie die Brunnen unter einem Mikroskop auf gut Konfluenz und Zellhaftung.

2) Veröffentlichung Assay:

  1. Waschen der Zellen:
    1. Warm Freisetzungspuffer (25 mM PIPES, 120 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 0,04 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Calciumchlorid) bei 37 ° C bis zur sanften Waschen der Zellen zu ermöglichen.
    2. Wash-Zellen durch Schwenken der Platte an Zellmedien zu entfernen und das Hinzufügen von 100 ul warm, 37 ° C, Freisetzungspuffer. Zweimal wiederholen.
  2. Antigen Herausforderung:
    1. Bereiten Sie eine serielle Verdünnung des Antigens (NIP-HSA oder DNP-HSA) von 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml -1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml -1 in Freisetzungspuffer und warm bei 37 ° C.
    2. Nach dem zweiten Zellwäsche, entsorgen Sie die Medien und mit 100 ul der Antigenlösungen ersetzt. Sicherzustellen, daß Vertiefungen in der gleichen Reihe (A1-6 zum Beispiel) die gleiche Antigenkonzentration zu ihnen hinzugefügt.
    3. Eine Negativkontrolle in der Zeile A durch Zugabe von 0 ng ml -1 Antigen eingestellt. Hinzufügen zunehmender Antigenkonzentration die Reihen (BG), gefolgt von Triton-x-Puffer (5% Triton X-100) in der Reihe H-Zellen, um die Zellen zu lysieren, um als positive Kontrolle verwendet werden. Inkubieren bei 37 ° C für 20 min, um damit die Zellen ihre Mediatoren freisetzen.
  3. Einrichten individuelle Wohlkontrollen:
    1. Nach der Inkubation mit einer Pipette 50 ul Zellüberstand auf die andere Hälfte der Platte (wells A1-6 bis A7-12 Vertiefungen, etc.). Verwerfen der restlichen 50 & mgr; l des Überstands und Ersetzen mit 50 ul Triton-X-Puffer, um die Messung der Menge des freigesetzten Mediatoren in jede Vertiefung in den Spalten 7-12 als Prozentsatz der Gesamtmediatoren in den Zellen in Spalte 1-6 ermöglichen .
  4. Enzym-Substrat:
  5. Dann werden 50 ul der β-Hexosaminidase-Substrat (50 mM 4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid in DMSO durch Zugabe zu Citratpuffer 0,2 M Zitronensäure und 0,2 M Natriumacetat auf 2 mM verdünnt, pH 4,5) zu allen Vertiefungen, um die Umwandlung des Substrats zu 4-Nitrophenol durch das β-Hexosaminidase Enzyms erleichtert. Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C für 2 Stunden.

Abbildung 2.4.1

  1. Beenden der Reaktion:
    1. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 150 & mgr; l Tris-Puffer (1 M Tris-HCl, pH 9) in jede Vertiefung wie die hohe pH-Wert des Puffers wird die Reaktion gestoppt und dann die 4-Nitrophenol in einer gelben Farbe.
  2. Das Lesen und die Analyse der Ergebnisse:
    1. Lesen der Platte unter Verwendung eines Platten Spektrophotometer bei 405 nm, die Absorption der gelben Farbe gemessen. Berechnet den Prozentsatz des freigesetzten β-Hexosaminidase Verwendung der folgenden Formel:

Abbildung 2.6.1

  1. Wenden Sie diese Formel in jede Vertiefung, wonach ein Mittelwert für jede Zeile übernommen. A1 und A7 repräsentieren die Lage der Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen. Eine Grafik mit Prozentsatz der β-Hexosaminidase Mitteilung (die Gesamtmediatorfreisetzung entspricht) against Antigenkonzentration 2, 3.

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Representative Results

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Die Eltern RBL-2H3.1 Zellen und solche mit equinen FcεRIα Rezeptorgen transfiziert wurden zuerst mit Maus-IgE-anti-DNP-HSA sensibilisiert und mit dem DNP-HSA-Antigen herausgefordert. Maus-IgE bindet an den endogenen Rezeptor aus Ratte in beiden Zelllinien und dient als Kontrolle, um die Freisetzung Lebensfähigkeit der beiden Zelllinien zu testen, um Mediatoren (Figur 1 A) lösen damit. Dies ist eine wichtige Kontrolle und sollten routine da beim verlängert (> 10 Wochen) Passage in Zellkultur durchgeführt werden, driften RBL-2H3.1 Zellen in Richtung der nicht-sezernierenden Phänotyp 27. Die Elternzellen unterstützt eine Spitzenmediatorfreisetzung von 51,54% ± 4,79%, während die Zellen der Pferde FcεRIα Rezeptor exprimieren hatte eine Spitzenmediatorfreisetzung von 45,99% ± 5,76%. Diese gleichen Zelllinien, wo dann mit Pferde-IgE Anti NIP-HSA sensibilisiert und mit dem NIP-HSA-Antigen (Abbildung 1 B) in Frage gestellt. Parental Zellen nicht Mediatorfreisetzung unterziehen, da diePferde-IgE nicht dem endogenen Ratten-Rezeptor binden. Auf der anderen Seite, wie erwartet, RBL-2H3.1 Zellen der Pferde FcεRIα Rezeptor exprimieren unterzog Mediatorfreisetzung, wenn sie mit Pferde IgE Anti NIP-HSA sensibilisiert und mit dem NIP-HSA-Antigen in Frage gestellt, was eine Spitzen Freisetzung von 36,68% ± 4,88% .

Diese Ergebnisse bestätigen die Wirksamkeit dieses Release Assay-Protokoll bei der Untersuchung von Mediatorfreisetzung über Pferde-IgE-Rezeptor. Es zeigt, dass diese Zelllinie ist ein nützliches Diagnosewerkzeug bei der Suche nach Eseln neue therapeutische Interventionsstrategien in der Pferdeallergie in vitro reduzieren die Notwendigkeit für Tierversuche. Das gleiche Protokoll kann auch auf RBL-2H3.1 Zellen mit der menschlichen und Hunde-FcεRIα Rezeptoren transfiziert.

Dieses Protokoll wurde auch verwendet, um die Sicherheit eines potentiellen Immunisierungsstrategie, die Hundeserum IgE-Antikörper zu neutralisieren 30 versucht zu testen. Aus den Ergebnissenin (2) kann bestimmt werden, dass die Immunisierungsstrategie ist nicht sicher. Die anti-Kaninchen-Serum-IgE erfolgreich auf die Hunde-IgE gebunden, wie ursprünglich zur IgE neutralisieren und verhindern, dass es die Bindung an seinen Rezeptor bestimmt. Aber diese Bindung war unspezifisch, und damit die Anti-IgE-Serum vernetzten den Rezeptor auf den Zellen "Oberfläche, was zu Mediatorfreisetzung, was möglicherweise zu einem anaphylaktischen Schock, wenn diese Immunisierungsstrategie wurde als Anti-Allergie-Impfstoff verwendet.

RBL-2H3.1 Ausdruck Equine FcεRIα - - Produziert im Labor
Equine IgE Anti NIP-HSA - - Produziert im Labor
Platte mit 96 Vertiefungen Sigma CLS3595 -
Multi-Kanal-Pipette Anachem - -
Inkubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iod-3-nitrophenylessigsäure Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH wurde mit Humanserumalbumin konjugiert NIP-HSA im Labor machen
Dinitrophenyl Konjugierte an humanes Serumalbumin Sigma A6661 Kurz DNP-HSA
Platte Spektralphotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Kochsalz Sigma S7653 -
Kaliumchlorid Sigma P9333 -
Magnesiumchlorid Sigma M2670 -
Kalziumchlorid Sigma C1016 -
Triton X100 Sigma X100 -
4-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid Sigma N9376 Lizenz Lösung namens β-Hexosaminidase Substrat wurde 50 mM in DMSO hergestellt
Dimethylsulfoxid Sigma D2650 -
Zitronensäure Sigma 251.275 -
Natriumacetat Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

Tabelle 1: Übersicht über die Zusammensetzung und Ausstattung:

Figur 1
Abbildung 1: A zeigt die Freisetzungstest auf RBL-2H3.1 Zellen nicht ausdrücken Pferde FcεRIα und der Rezeptor mit der Maus IgE anti-DNP-HSA exprimierenden vorgeformt. Die Maus IgE bindet an den endogenen Ratten-Rezeptor, was zu Mediatorfreisetzung, wenn herausgefordert mit dem DNP-HSA-Antigen, und bestätigt damit, dass beide Zelllinien sind lebensfähig und unterstützt IgE-vermittelte Antigen induzierte Mediatorfreisetzung 2, 3. Graph B zeigt die Freisetzungstest vorgeformt auf RBL-2H3.1 Elternzellen, die nicht ausdrücken Pferde FcεRIα und diejenigen ausdrücken Pferde FcεRIα, mit Pferde-IgE Anti NIP-HSA für Zellsensibilisierung. Die equine IgE bindet an den Rezeptor artig, aber nicht das endogene Rezeptor aus Ratte, in Mediatorfreisetzung zur Folge haben, da dies die Elternzellen bestätigt nicht Mediator Mediatoren freisetzen, während die Zellen, die den Rezeptor equine Stütz equine IgE-vermittelten Antigen-induzierte , Mediatorfreisetzung 2, 3.

Figur 2
Figur 2: Immunisierung Release Assay-Ergebnisse: Die Grafik zeigt die Freisetzungsassay für RBL-Zellen, 2H3.1 canine FcεRIα vorgeformte, mit Hunde-IgE anti NIP-HSA zur Zellsensibilisierung und immunisierten Ratten-Anti-Kaninchen-Serum-IgE als Antigen. Als Kontrolle wurde vorimmunisiert Serum, und die positive Kontrolle war NIP-HSA-Antigen. Die Hunde-IgE bindet an den Eckzahn-Rezeptor. Darüber hinaus bindet der Anti-IgE-Serum an den Rezeptor gebunden Hunde-IgE und Querverweisen, und den Rezeptor auf den Zellen "Oberfläche, was zu Mediatorfreisetzung. Diese in der Tat erweist sich, dass diese spezielle Immunisierungsstrategie hat das Potenzial, eine anaphylaktische Schockreaktionen verursachen und ist daher nicht sicher, 30 berücksichtigt.

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Discussion

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In Zusammenfassung der Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, dass bei RBL-Zellen, 2H3.1 equine FcεRIα mit equinen IgE durch ein Antigen sensibilisiert und herausgefordert, geben sie einen Spitzen Mediator-Freisetzung von 36,68% ± 4,88% der Gesamtmenge des innerhalb des Vermittlers Zellen, verglichen mit dem RBL-2H3.1 Elternzellen nicht exprimiert equine FcεRIα.

Somit Dieser Test liefert ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung und das Studium Pferde allergischen Reaktionen in vitro. Seine erlaubt die Bestimmung der Menge des Mediators durch Zellen Mastzellen / Basophilen Linie freigegeben und somit kann erwartet werden, in der Forschung equine Allergie vorzurücken, ob die Beurteilung allergieauslösende Mittel oder Nachforschungen IgE / Rezeptor-Blockierungsmittel.

Dieser Assay wurde modifiziert, um Pferde-Allergie aus früheren Publikationen, die es verwendet, um Mensch und Hund Allergien 4529 für die gleichen Zwecke zu studieren studieren. Die technisch-Zelllinies exprimierenden menschlichen und Hunde-FcεRIα wurden eingesetzt, um die Wirksamkeit und Sicherheit von Allergie Blockierungsmittel zu studieren, wie Impfstoffe gegen die Inhibition der IgE / Rezeptor-Wechselwirkung 30. Die Untersuchung ergab eine anaphylactogenic Nebeneffekt der Immunogene, die die gesamte Cε3 Domäne, die auch von anderen als Impfstoff zur Dämpfung IgE-vermittelte allergische Reaktionen bei Hunden 24 vorgeschlagen wurde. Basierend auf unseren Untersuchungen konnte die molekulare Grundlage für diese potenziell schweren Komplikationen aufgrund der Erkennung von Epitopen in der IgE-Antikörper von dem anti-IgE-Immunserum mit anti-IgE-Antikörper, die Epitope in Cε3 Ziel und rationalisiert nicht verdeckt werden, wenn IgE an seinen Rezeptor komplexiert ist. Diese Beobachtung konnte nicht in der Abwesenheit von diesem Assay-System gemacht wurden, und steht in auffallendem Gegensatz zur Untersuchung 24, die ebenfalls untersuchten die antiallergische Eingriffsstrategie basierend auf in vivo Immunitätensation mit Cε3 Domänen, aber nicht die Sicherheit der Strategie aufgrund der Abwesenheit eines solchen Assays diskutiert.

Die kritischen Schritte dieses Protokolls ist es, dass die Mehrheit der RBL-Zellen 2H3.1 der absondernden Phänotyp; mit den Zellen in der Kultur größer ist 10 Wochen bewirkt, dass sie beginnen, unabhängig davon, ob sie das klonierte FcεRIα von Interesse exprimiert wird oder nicht in Richtung der nicht-sezernierenden Phänotyp 27 driften. Deshalb ist es immer wichtig, Maus IgE positive Kontrollen neben dem Experiment (Abbildung 1) laufen, und einen großen gefrorenen Vorrat an sezernierenden Zellen zu erhalten.

Weiterhin muss der pH-Wert aller Puffer genau sein, oder sie riskieren, was zu falsch negativen Ergebnissen; Verlängerung der Haltbarkeitsdauer von Puffern ändert ihren pH und damit jeder Puffer älter als 2 Monate muss weggeworfen werden.

Die Technik zeigt die Interaktion einer chemischen mit der RBL-2H3.1 cells, und wie es fördert oder unterdrückt, ihre Mediatorfreisetzung in vitro. Dies ist ein guter Hinweis darauf, was in vivo passieren könnte, damit dieses Protokoll ist ein wesentlicher Schritt bei der Erforschung potenziellen Anti-Allergie-Therapiestrategien. Die Technik ist jedoch nicht angegeben, welcher Teil des Antikörper / Rezeptor-Komplex das Molekül von Interesse in Wechselwirkung tritt.

Andere Forschungsarbeiten, wie zum Beispiel 20 haben gezeigt, dass Pferde-RAO ist nicht auf IgE Mediation bezogen, weshalb gewisse Diskrepanz kann mit anderen Verlagen wie Moran et al. 31 bei der Verwendung von Gesamtpferdeserum auf Ca 2+ testen Zuzug aus gesehen werden RAO leiden Pferde mit unspezifischen reaginic Antikörper, für die verschiedene Antikörper wäre für die zelluläre Ca 2+ Einstrom verantwortlich.

Dieser Test ist spezifisch für IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen, die auch auf andere Organismen angewendet werden kann, wie beispielsweise Menschen undHunde 29 und gezielt eingesetzt, um die Sicherheit der Anti-Allergie-Interventionsstrategien, wie beispielsweise Kunst / chimären Anti-Allergie-Antikörper 30 testen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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