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Immunology and Infection

Développement d'un doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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Allergie est connue depuis des millénaires. Un traitement de l'asthme a été décrit dans le texte médical égyptien antique connu sous le papyrus Ebers (~ 1550 avant notre ère) et discuté remèdes pour traiter 7.

allergie est aujourd'hui considéré comme une réponse d'hypersensibilité de type I, où le type T cellulaire auxiliaire 2 (TH 2) du bras du système immunitaire dirige la production d'immunoglobulines E (IgE), des anticorps en réponse à des antigènes environnementaux appelés allergènes. Ce sont diverses substances qui interagissent couramment avec les cellules du système immunitaire et stimuler la synthèse et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, y compris l'interleukine-4 et l'interleukine-13, 8, 9 comme ne particules dans les particules de fumée de cigarette ou diesel échappement qui augmente la synthèse des IgE 10.

La hausse des manifestations allergiques dans les pays industrialisés au cours des 50 dernières années a été attribué à une combinaison de l'effet depolluants de l'environnement et une tendance à un environnement plus aseptisé, qui se combinent pour décaler la réponse immunitaire vers un profil prédominé par Th 2 cytokines, telle que proposée par la 'hypothèse hygiénique »11.

Comme mentionné ci-dessus, l'homme ne sont pas les seuls mammifères affligés par une allergie. Notamment les chevaux et les chiens peuvent aussi développer des réactions allergiques classiques et une étude de 12 a montré que, comme chez les humains, l'allergie équin est attribuée à des facteurs génétiques et environnementaux. En conséquence, ces animaux présentent de bons modèles pour étudier l'interaction entre les facteurs génétiques et environnementaux de l'allergie, la progression de la sensibilisation à la maladie et les stratégies d'intervention possibles une fois les manifestations cliniques sont fixés dans

En 1887, Stömmer était la première personne pour décrire la similitude entre l'homme et l'asthme équine 13, l'effet de l'histamine sur le système cardio-vasculaire équine esttrès similaire à celui des humains 14. Les chevaux sont aussi la pierre angulaire de l'industrie des courses de chevaux, qui vaut 72 milliards de dollars, un chiffre d'affaires de paris de 115 milliards de dollars par an 15.

La plupart des chevaux de course contemporains sont des descendants du petit nombre de chevaux arabes élevés par Lady Anne Blunt à partir de 1878. Chevaux de course modernes sont souvent consanguins à sélectionner pour les capacités de performance. Ils sont sujets à des troubles génétiques, dont l'un est leur susceptibilité à monter des réponses allergiques. Ils ont aussi 1000 fois plus élevés que les niveaux d'IgE sériques même les êtres humains plus sévèrement allergique 16. réactions allergiques à cheval sont se manifeste habituellement par une hypersensibilité insecte morsure (IBH) 17, 18. IBH résultats dans des dermatoses dues aux piqûres d'insectes forment dans le genre Culicoides. Une autre forme de la maladie allergique équine est obstructions des voies respiratoires récurrentes (RAO), cela se manifeste dans les poumons et les voies respiratoires. Elle est caractérisée par une respiration sifflante et laboratoirerespiration ORed. RAO se produit généralement en réponse à spores de moisissures, et des niveaux élevés d'IgE spécifiques des allergènes ont été enregistrés chez les chevaux atteints de RAO dans une étude 19 mais une autre enquête n'a pas confirmé cette 20.

Des études sur l'allergie équine ont tourné autour de l'essai de contrôle et de neutraliser équine IgE par le développement d'anticorps anti-équin IgE monoclonal (mAb) 21, 22. En outre, l'étude de 23 traite de la production de domaines extracellulaires de l'α de l'équin haute affinité Fc récepteur chaîne (FcεRIα) récepteur dans le but de détecter et de quantifier le sérum équin IgE. Une étude connexe par Ledin 24 traite d'une nouvelle approche visant à neutraliser les IgE sériques en amorçant le système immunitaire en utilisant un auto / non-soi immunogène. Toutes ces études, cependant, manquait un dosage efficace pour tester l'innocuité et l'efficacité de leurs protocoles. Dans cet article, nous présentons un tel sys d'essaisystème applicable à l'étude des stratégies diagnostiques et thérapeutiques pertinentes pour le système équin, où β-hexosaminidase libération, comme un indicateur de médiateur de la dégranulation cellulaire, a été évaluée sur des cellules RBL-2H3.1 exprimant FcεRIα équine. Ce protocole est basé sur des publications antérieures 25, 4, 5, 2, 3, décrivant l'ingénierie de cellules RBL transfectées avec le gène codant le domaine de liaison du récepteur IgE de haute affinité pour les IgE provenant d'espèces différentes. Le protocole explique comment effectuer un test de libération de β-hexosaminidase, dont les résultats sont présentés en moyenne ± écart-type d'expériences en triple.

Le dosage de la libération a été développé par Siraganian et le crochet 25 pour étudier allergie humaine. Le groupe de laboratoire dirigé par le Dr Reuben Siraganian également développé la lignée cellulaire RBL. Ces cellules RBL ont été développés pour exprimer la FcεRIα humain et le protocole a été publié par 4. La dernière piècedu dosage fournie avec le développement du plasmide pSV dans le papier par Neuberger 26 qui décrit la production d'un anticorps IgE par clonage de son gène de chaîne lourde en aval d'un gène de la souris pour une région variable d'IgE qui cible l'haptène 4-hydroxy-3 nitro-phénacétyle (NP), l'anticorps chimérique résultant était pleinement fonctionnel. La possibilité de développer tout IgE ciblant le même haptène, tout en clonant son récepteur sur la surface des cellules RBL abouti à la normalisation du dosage qui en fait un protocole utile pour mesurer la dégranulation des basophiles.

Le test a des avantages et des inconvénients. Les avantages du dosage est son adaptabilité à être utilisé dans un système de mammifère, notre laboratoire a ainsi utilisé pour tester la dégranulation dans les systèmes humains, canins, équins, ce qui est réalisable simplement par synthèse d'IgE de l'organisme et le clonage de son récepteur sur la surface des cellules RBL.

D'autre part,les inconvénients de l'essai est que les cellules RBL sont très sensibles aux variations thermiques, mécaniques et PH, ce qui leur donne une variation des niveaux de dégranulation au sein de la même dosage. Il est donc fortement conseillé que les essais sont toujours répétées en triple, puis en prenant la moyenne de leur part. En outre, les cellules RBL ont tendance à se déplacer vers un phénotype non-libération si elles sont laissées en culture de tissu pendant des périodes prolongées (> 10 semaines) 27, ce qui rend leur entretien lourd. Elles sont également sujettes à des infections par des bactéries de mycoplasmes, qui ne sont pas visibles à partir d'un microscope optique et ne modifient pas la morphologie de la cellule, mais cela changerait radicalement leurs niveaux de dégranulation. Ainsi des tests réguliers de mycoplasmes sont nécessaires.

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Protocol

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1) Préparation de la lignée cellulaire:

  1. Le développement de la lignée de cellules RBL-de 2H3.1 exprimer équins α FceRI:
    1. En utilisant des techniques de base de culture de tissus de lignées de cellules en monocouche, transfecter des cellules RBL-2H3.1 parentales en utilisant le plasmide pEE6, portant le gène équine FcεRIα (GenBank: Y18204.1) 28. Ajouter 2 ul -1 pg de l'ADN plasmidique de 0,8 ml de cellules à une densité de 1,2 x 10 7 cellules ml -1. L'électroporation des cellules à 250 V 960 pF en utilisant un 0,4 cm electrocuvette puis incuber immédiatement sur la glace pendant 10 min.
    2. Sélectionnez les cellules transformées en utilisant les médias contenant 0,4 g de sulfate de généticine G418, puis trier les cellules vivantes restantes par FACS en les étiquetant avec un anticorps fluorescent IgE. Utilisez le RBL-2H3.1 résultant lignée cellulaire exprimant FcεRIα équine de l'enquête 2, 3.
  2. Pré-test anticorps sensibilisation:
      5 cellules ml-1.
    1. Ajouter l'IgE de l'intérêt pour les cellules en suspension à une concentration finale de 1 ng ml-1, puis la plaque 100 pl de cellules sur une plaque à 96 puits à colonnes 1-6 et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 + 90% humidité relative pendant 16 heures. Après le temps d'incubation, et avant d'effectuer le test de libération, vérifier les puits sous un microscope pour bien confluence et l'adhérence des cellules.

2) Dosage de libération:

  1. Lavage des cellules:
    1. Un tampon de sortie chaud (25 mM de PIPES, du chlorure de sodium 120 mM, 5 mM de chlorure de potassium, 0,04 mM de chlorure de magnésium et 1 mM de chlorure de calcium) à 37 ° C pour permettre le lavage des cellules en douceur.
    2. Laver les cellules en tapotant la plaque pour enlever médias cellulaires et ajouter 100 ul chaud, 37 ° C, tampon de sortie. Répéter deux fois.
  2. Défi antigène:
    1. Préparer une série de dilutions de l'antigène (NIP-HSA ou DNP-HSA) de 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml -1, 100 ng ml -1, 1 000 ng ml -1, 10 000 ng ml -1 dans le tampon de sortie et chaud à 37 ° C.
    2. Après le second lavage de cellules, éliminer les médias et remplacé par 100 ul de la solution d'antigène. Veiller à ce que les puits dans la même rangée (A1-6, par exemple) ont la même concentration ajoutée à leur antigène.
    3. Mettre en place un contrôle négatif à la ligne A en ajoutant 0 antigène -1 ml ng. Ajouter augmentation de la concentration de l'antigène dans les rangées (BG), suivie par triton x-tampon (5% de Triton X-100) dans les cellules de rangées H à lyser les cellules pour être utilisé en tant que contrôle positif. Incuber à 37 ° C pendant 20 min pour permettre aux cellules de libérer ses médiateurs.
  3. Configuration du contrôle de puits individuels:
    1. Après l'incubation, transférer 50 pi de surnageant de cellules à l'autre moitié de la plaque (A1-6 puits à puits A7-12, etc.). Jeter les 50 ul de surnageant restant et le remplacer par 50 ul de Triton X-tampon pour permettre la mesure de la quantité de médiateurs libérés à chaque puits dans les colonnes 7 à 12 en pourcentage du total des médiateurs à l'intérieur des cellules dans la colonne 1-6 .
  4. Substrat enzymatique:
  5. Ajouter 50 ul de substrat de β-hexosaminidase (mM 4-nitrophényl N-acétyl-β-D-de glucosaminide préparé dans du DMSO dilué jusqu'à 2 mM en l'ajoutant à un tampon de citrate 0,2 M d'acide citrique et 0,2 M d'acétate de sodium, pH 4,5 à 50) dans tous les puits de la facilité de conversion du substrat de 4-nitrophénol par l'enzyme β-hexosaminidase. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 heures.

Figure 2.4.1

  1. Mettre fin à la réaction:
    1. Arrêter la réaction par l'ajout de 150 ul de tampon Tris (1 M de Tris-HCl, pH 9) à chaque puits comme le pH élevé de la mémoire tampon arrête la réaction et le transforme en 4-nitrophénol de couleur jaune.
  2. La lecture et l'analyse des résultats:
    1. Lire la plaque à l'aide d'un spectrophotomètre de plaque à 405 nm pour mesurer l'absorbance de la couleur jaune. Calculé le pourcentage de β-hexosaminidase libéré en utilisant la formule suivante:

Figure 2.6.1

  1. Appliquer cette formule à chaque puits, après quoi une moyenne est calculée pour chaque ligne. A1 et A7 représentent la position des puits dans la plaque à 96 puits. Tracer la courbe de pourcentage de β-hexosaminidase de presse (qui correspond à la libération totale du médiateur) contantigène NST de concentration 2, 3.

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Representative Results

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Les cellules RBL-2H3.1 parentales et celles transfectées avec le gène du récepteur de FcεRIα équine ont d'abord été sensibilisées avec des IgE de souris anti- DNP-HSA et la provocation avec l'antigène DNP-HSA. IgE de souris se lie au récepteur de rat endogène dans les deux lignées cellulaires et agit comme un contrôle pour tester la viabilité de la libération de deux lignées cellulaires pour libérer des médiateurs (figure 1 A) ainsi. Ceci est un test important et doit être effectuée régulièrement depuis lors étendue (> 10 semaines) passage en culture cellulaire, les cellules RBL-2H3.1 dérive vers le phénotype non-sécrétant 27. Les cellules parentales soutenu un pic de libération de médiateur de 51,54% ± 4,79%, tandis que les cellules exprimant le récepteur FcεRIα équine ont eu un pic de libération de médiateur de 45,99% ± 5,76%. Ces mêmes lignées cellulaires où puis sensibilisés avec équine IgE contre NIP-HSA et contestées avec l'antigène NIP-HSA (Figure 1 B). Cellules parentales ne sont pas soumis à la libération de médiateurs, depuis leIgE équine ne se lie pas au récepteur de rat endogène. D'autre part, comme prévu, les cellules RBL-2H3.1 exprimant le récepteur FcεRIα équine ont subi la libération de médiateurs lorsque sensibilisés avec équine IgE contre NIP-HSA et contestée avec l'antigène NIP-HSA, donnant une version de pointe de 36,68% ± 4,88% .

Ces résultats confirment l'efficacité de ce protocole d'essai de libération à l'enquête de la libération de médiateurs par récepteur IgE équine. Il montre que cette lignée cellulaire est un outil de diagnostic utile dans la recherche de nouvelles stratégies ânes d'intervention thérapeutique dans l'allergie équine in vitro en réduisant la nécessité de l'expérimentation animale. Le même protocole est également applicable à des cellules RBL-2H3.1 transfectées avec les récepteurs de la FcεRIα humaine et canine.

Ce protocole a également été utilisé pour tester la sécurité d'une stratégie de vaccination potentiel qui tente de neutraliser le sérum des anticorps IgE canine 30. A partir des résultats(Figure 2), il peut être déterminé que la stratégie d'immunisation ne sont pas sans danger. Le sérum anti-IgE canine-lié avec succès à l'IgE canine comme cela a été prévu à l'origine, afin de neutraliser les IgE sériques et l'empêcher de se lier sur son récepteur. Mais cette liaison est non spécifique, et donc le sérum croix anti-IgE liée au récepteur à la surface des cellules, ce qui entraîne la libération de médiateurs, qui pourrait entraîner un choc anaphylactique si cette stratégie de vaccination a été utilisé comme un vaccin anti-allergie.

RBL-2H3.1 Exprimant FcεRIα équine - - Produit dans le laboratoire
Anti-IgE équine NIP-HSA - - Produit dans le laboratoire
96 Eh bien Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubateur Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophénylacétique acide Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 PIN-OH a été conjugué avec l'albumine sérique humaine à faire NIP-HSA dans le laboratoire
Dinitrophenyl conjugué à l'albumine sérique humaine Sigma A6661 Abrégée DNP-HSA
Plate spectrophotomètre Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Chlorure de sodium Sigma S7653 -
Chlorure de potassium Sigma P9333 -
Chlorure de magnésium Sigma M2670 -
Chlorure de calcium Sigma C1016 -
Triton X100 Sigma X100 -
4-nitrophényl N-acétyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Solution mère substrat appelé β-hexosaminidase a été préparé à 50 mM dans le DMSO
Diméthylsulfoxyde Sigma D2650 -
Acide citrique Sigma 251275 -
l'acétate de sodium Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

Tableau 1: Tableau de matériel et d'équipement:

Figure 1
Figure 1: A montre le test de libération préformé sur les cellules RBL-2H3.1 pas équine exprimant FcεRIα et exprimant le récepteur en utilisant la souris IgE contre DNP-HSA. La souris IgE se lie au récepteur de rat endogène résultant en la libération de médiateur en cas de contestation avec l'antigène DNP-HSA, confirmant ainsi que les deux lignées de cellules sont viables et appuyer médiée par les IgE induite par l'antigène libération de médiateurs 2, 3. Le graphique B montre le test de libération préformé sur les cellules parentales RBL-2H3.1 qui expriment pas équine FcεRIα et ceux qui expriment FcεRIα équine, en utilisant équine IgE contre NIP-HSA pour la sensibilisation de la cellule. Le équine IgE se lie au récepteur équine, mais pas le récepteur de rat endogène, pour aboutir à la libération de médiateur, ce qui est confirmé depuis les cellules parentales ne pas libérer des médiateurs de médiateur, tandis que les cellules exprimant le support récepteur équin équin médiée par les IgE, l'antigène induit , la libération de médiateurs 2, 3.

Figure 2
Figure 2: résultats de l'essai de libération de la vaccination: Le graphique montre le test de libération préformé sur les cellules RBL-2H3.1 exprimant canine FcεRIα, en utilisant IgE canine contre NIP-HSA pour la sensibilisation de la cellule, et le rat immunisé anti-canin-IgE sériques comme l'antigène. Le contrôle a été utilisé sérum pré-immunisé, et le contrôle positif était antigène NIP-HSA. L'IgE canine se lie au récepteur canine. En outre, le sérum anti-IgE se lie au récepteur lié IgE canine et des liens croisés, et le récepteur, sur la surface des cellules entraîne la libération de médiateurs. Ceci, en effet, prouve que cette stratégie de vaccination particulier a le potentiel de provoquer une réaction de choc anaphylactique, et est donc considéré comme non sûr 30.

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Discussion

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En résumé, les résultats de cette enquête ont montré que lorsque les cellules RBL-2H3.1 exprimant FcεRIα équins sont sensibilisées avec équine IgE et remis en cause par un antigène, ils donnent un pic de libération de médiateur de 36,68% ± 4,88% du montant total de médiateur à l'intérieur du cellules, par rapport à la RBL-2H3.1 cellules parentales non exprimant équine FcεRIα.

Ainsi, ce test fournit un outil utile pour étudier et étudier les réponses allergiques équins in vitro. Sa permet la détermination de la quantité de médiateur libéré par les cellules de mastocytes / basophiles lignée et peut donc être devraient faire progresser la recherche en allergie équine, si l'évaluation de l'allergie agents pathogènes, ou de la recherche d'IgE / récepteur agents de blocage.

Cet essai a été modifié pour étudier allergie équine de publications antérieures qui l'ont utilisé pour étudier humaine et canine allergies 4529 pour les mêmes fins. La lignée cellulaire d'ingénieries exprimer humaine et FcεRIα canines ont été utilisées pour étudier l'efficacité et la sécurité des agents de blocage des allergies tels que les vaccins ciblant l'inhibition des IgE / récepteur interaction 30. L'enquête a révélé un effet secondaire anaphylactogènes d'immunogènes comprenant l'ensemble du domaine Ce3, qui a également été proposé par d'autres comme un vaccin pour atténuer les réactions allergiques médiées par les IgE chez les chiens 24. Sur la base de notre enquête, la base moléculaire de cette complication potentiellement grave pourrait être rationalisée sur la base de la reconnaissance des épitopes de l'anticorps IgE par le sérum immun anti-IgE contenant des anticorps anti-IgE qui ciblent des épitopes dans Cs3 et ne sont pas obscurci quand IgE est complexé à son récepteur. Cette observation n'a pas pu être fait en l'absence de ce système de dosage et est en contraste frappant avec l'enquête menée par 24, qui a également enquêté sur la stratégie d'intervention anti-allergie basé sur in vivo immunition avec les domaines Ce3, mais n'a pas discuté de la sécurité de la stratégie en raison de l'absence d'un tel essai.

Les étapes essentielles de ce protocole est d'assurer que la majorité des cellules RBL-2H3.1 sont du phénotype de sécrétion; ayant des cellules en culture plus de 10 semaines entraîne leur commencer à dériver vers le phénotype non-sécrétant 27 indépendamment du fait qu'ils ont exprimé le FcεRIα clone intéressant ou pas. Par conséquent, il est toujours essentiel de faire fonctionner les contrôles positifs souris IgE aux côtés de l'expérience (Figure 1), et de maintenir un stock congelé de cellules sécrétrices.

En outre, le pH de tous les tampons doivent être exacts ou ils risquent de donner des résultats faussement négatifs; prolonger la durée de vie des tampons modifie leur pH, et donc tout tampon âgés de 2 mois doit être mis au rebut.

La technique montre l'interaction d'une substance chimique avec le CE RBL-2H3.1LLS, et comment elle favorise ou supprime, leur libération de médiateurs in vitro. Ceci est une bonne indication de ce qui pourrait arriver in vivo, ainsi ce protocole est une étape essentielle lors de la recherche des stratégies thérapeutiques anti-allergiques potentiels. La technique n'a pas, cependant, indiquer quelle partie du complexe anticorps / récepteur de la molécule d'intérêt interagit avec.

D'autres travaux de recherche, tels que les 20 ont indiqué que équine RAO est pas lié à la médiation IgE, ce qui explique pourquoi un certain décalage peut être vu avec d'autres éditeurs tels que Moran et al. 31 lors de l'utilisation totale de sérum équin à tester influx de Ca2 + à partir de RAO souffrance chevaux utilisant des anticorps non spécifiques réaginiques, pour qui des anticorps différents seraient responsables de l'afflux Ca 2+ cellulaire.

Cet essai est spécifique de l'hypersensibilité à médiation par IgE, qui peuvent également être appliquées à d'autres organismes, tels que les humains et29 chiens, et plus particulièrement utilisé pour tester la sécurité des stratégies d'intervention anti-allergie, comme synthétiques / anticorps anti-allergie chimériques 30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Développement d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Système modèle pour l&#39;étude de l&#39;interaction de<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE avec son récepteur de haute affinité FcsRI
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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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