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Immunology and Infection

Sviluppo di un doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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Allergia è noto da millenni. Un trattamento di asma è stato descritto nel testo medico egiziano antico noto come il Papiro di Ebers (~ 1550 aC) e discusso i rimedi a base di erbe per il trattamento di essa 7.

Allergia Oggi è classificata come una risposta di ipersensibilità di tipo I, in cui il tipo cellulare T helper 2 (TH 2) braccio del sistema immunitario dirige la produzione di anticorpi immunoglobulina E (IgE) in risposta ad antigeni ambientali chiamati allergeni. Si tratta di sostanze diverse che comunemente interagiscono con le cellule del sistema immunitario e stimolano la sintesi e la secrezione di citochine pro-infiammatorie, comprese interleuchina-4 e interleuchina-13 8, 9 così come particelle in particelle di fumo di sigaretta o di scarico diesel che permettono di migliorare la sintesi di IgE 10.

L'aumento delle manifestazioni allergiche nei paesi industrializzati negli ultimi 50 anni è stata attribuita ad una combinazione dell'effetto diinquinanti ambientali e una tendenza a un ambiente più igienizzato, che si combinano per spostare la risposta immunitaria verso un profilo predominato da TH 2 citochine, come proposto dalla 'ipotesi dell'igiene' 11.

Come accennato in precedenza, gli esseri umani non sono gli unici mammiferi affetti da allergia. In particolare cavalli e cani possono anche sviluppare reazioni allergiche classiche e uno studio di 12 ha dimostrato che, come negli esseri umani, allergia equina è attribuito a fattori genetici e ambientali. Di conseguenza, questi animali presentano un buon modello per studiare l'interazione tra cause genetiche e ambientali di allergia, la sua progressione da sensibilizzazione alla malattia, e le possibili strategie di intervento una volta che le manifestazioni cliniche indicate nel

Nel 1887, Stömmer stato il primo a descrivere la somiglianza tra umano e asma equina 13, l'effetto dell'istamina sul sistema cardiovascolare equina èmolto simile a quello umano 14. I cavalli sono anche la pietra angolare del settore corse di cavalli, che vale la pena di US $ 72 miliardi, con un giro d'affari delle scommesse di US $ 115 miliardi di dollari all'anno 15.

La maggior parte dei cavalli da corsa in stile contemporaneo sono discendenti del piccolo numero di cavalli arabi allevati da Lady Anne Blunt dal 1878 in poi. Cavalli da corsa moderne sono comunemente inbred selezionare per le abilità di performance. Essi sono inclini a malattie genetiche, uno dei quali è la loro suscettibilità a montare reazioni allergiche. Essi hanno anche 1000 volte più elevati livelli di IgE nel siero rispetto anche gli esseri umani più gravemente allergica 16. Reazioni allergiche a cavallo sono di solito manifestano come puntura d'insetto ipersensibilità (IBH) 17, 18. IBH risultati nella dermatite a causa di punture di insetti formano nel genere Culicoides. Un'altra forma di malattia allergica equina è ostruzioni delle vie aeree ricorrenti (RAO), questo si manifesta nei polmoni e le vie respiratorie. E 'caratterizzata da respiro sibilante e laboratoriorespirazione OR. RAO comunemente si verifica in risposta alla muffa spore, e alti livelli di IgE allergene-specifici sono stati registrati nei cavalli affetti da RAO in uno studio di 19 anche se un'altra inchiesta non ha confermato che 20.

Gli studi su allergie equina ruotavano attorno al tentativo di controllo e di neutralizzare equina IgE attraverso lo sviluppo di anticorpi anti-equino IgE monoclonali (MAK, MAB) 21, 22. Inoltre lo studio entro il 23 illustra la produzione dei domini extracellulari di α equina ad alta affinità Fc recettore catena (FcεRIα) recettori nel tentativo di rilevare e quantificare siero equino IgE. Uno studio correlato da Ledin 24 illustra un nuovo approccio volto a neutralizzare il siero IgE dal priming del sistema immunitario con un self / non-self immunogeno. Tutti questi studi, tuttavia, non avevano un test efficace per testare la sicurezza e l'efficacia dei loro protocolli. In questo articolo, presentiamo ora tale prova sysTEM applicabile allo studio di strategie diagnostiche e terapeutiche relative al sistema equina, dove rilascio β-dell'esoaminossidasi, come indicatore di mediatore degranulazione delle cellule, è stata valutata su cellule RBL-2H3.1 esprimono equina FcεRIα. Questo protocollo si basa su precedenti pubblicazioni 25, 4, 5, 2, 3 descrivono l'ingegnerizzazione di cellule RBL trasfettate con il gene codificante il dominio di legame del recettore IgE ad alta affinità per le IgE da specie diverse. Il protocollo descritto come eseguire un saggio di rilascio β-dell'esoaminossidasi, i cui risultati sono presentati come media ± deviazione standard di esperimenti in triplo.

Il saggio di rilascio è stato sviluppato da Siraganian e gancio 25 per studiare l'allergia umana. Il gruppo del laboratorio guidato dal dottor Reuben Siraganian ha sviluppato anche la linea di cellule RBL. Queste cellule RBL sono stati sviluppati per esprimere la FcεRIα umana e il protocollo è stato pubblicato da 4. Il pezzo finaledel dosaggio venuto con lo sviluppo del plasmide pSV nel lavoro di Neuberger 26 che descrive la produzione di un anticorpi IgE clonando suo pesante gene della catena a valle di un gene del mouse per una regione variabile di IgE che gli obiettivi l'aptene 4-idrossi-3 nitro-phenacetyl (NP), l'anticorpo chimerico risultante era perfettamente funzionante. La possibilità di sviluppare qualsiasi IgE rivolti stesso aptene, ma anche di clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL portato alla normalizzazione del dosaggio rendendolo un protocollo utile per misurare la degranulazione dei basofili.

Il test ha i pro e contro. I pro del saggio è la sua adattabilità ad essere utilizzato in qualsiasi sistema di mammiferi, il nostro laboratorio ha quindi utilizzato per verificare la degranulazione dei sistemi umani, canini e equino, e questo è realizzabile semplicemente sintetizzando IgE dell'organismo e la clonazione suo recettore sulla superficie delle cellule RBL.

D'altronde,i contro del saggio è che le cellule RBL sono molto sensibili alle variazioni termiche, meccaniche e PH, rendendoli dare una variazione dei livelli di degranulazione all'interno dello stesso dosaggio. E 'quindi fortemente consigliato che i dosaggi vengano sempre ripetuti in triplicato e quindi una media è preso da loro. Inoltre, le cellule RBL tendono a spostarsi verso un fenotipo non-rilascio se lasciati in coltura per un tempo prolungati (> 10 settimane) 27, rendendo la loro manutenzione ingombrante. Sono anche soggetti a infezioni da batteri micoplasma, che non sono visibili al microscopio ottico e non modificano la morfologia della cellula, ma sarebbero drasticamente cambiare i loro livelli di degranulazione. Pertanto sono necessari test micoplasma regolari.

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Protocol

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1) Preparazione di Cell Line:

  1. Sviluppare la linea di cellule RBL-2H3.1 esprimere equino α FcεRI:
    1. Utilizzando tecniche di base di coltura di tessuti per linee cellulari monostrato, trasfezione le cellule RBL-2H3.1 genitori utilizzando il plasmide pEE6, che porta il gene equina FcεRIα (GenBank: Y18204.1) 28. Aggiungere 2 mg ml -1 del DNA plasmidico a 0,8 ml di cellule ad una densità di 1,2 x 10 7 cellule ml -1. Elettroporazione le cellule a 250 V, 960 mF utilizzando un 0,4 centimetri electrocuvette incubare immediatamente in ghiaccio per 10 min.
    2. Selezionare le cellule trasformate utilizzando supporti contenenti 0,4 g di solfato di geneticina G418, quindi ordinare le rimanenti cellule viventi mediante FACS da loro codifica con un anticorpo fluorescente IgE. Utilizzare il conseguente RBL-2H3.1 esprimere equina linea cellulare FcεRIα per lo studio 2, 3.
  2. Pre-dosaggio degli anticorpi di sensibilizzazione:
      5 cellule ml -1.
    1. Aggiungere l'IgE di interesse per le cellule in sospensione ad una concentrazione finale di 1 ng ml -1, poi piastra 100 microlitri di cellule su una piastra da 96 pozzetti a colonne 1-6 e incubare a 37 ° C + 5% di CO 2 + 90% umidità relativa per 16 ore. Dopo il periodo di incubazione, e prima di eseguire il test di rilascio, controllare i pozzi sotto un microscopio per la confluenza bene e l'adesione delle cellule.

2) saggio di rilascio:

  1. Lavare le cellule:
    1. Buffer di stampa a caldo (PIPES 25 mM, 120 mM di cloruro di sodio, 5 mM di cloruro di potassio, 0,04 mM di cloruro di magnesio, e 1 mM di cloruro di calcio) a 37 ° C per consentire il lavaggio delle cellule delicato.
    2. Lavare le cellule muovendo il piatto per rimuovere il supporto delle cellule e l'aggiunta di 100 ml caldo, 37 ° C, buffer di stampa. Ripetere due volte.
  2. Sfida Antigen:
    1. Preparare una diluizione in serie dell'antigene (NIP-HSA o DNP-HSA) di 0 ng ml -1, 0,1 ng ml -1, 1 ng ml -1, 10 ng ml -1, 100 ng ml -1, 1.000 ng ml -1, 10.000 ng ml -1 nel buffer di stampa e calda a 37 ° C.
    2. Dopo il secondo lavaggio delle cellule, scartare i media e sostituito con 100 microlitri delle soluzioni di antigene. Assicurarsi che i pozzetti di una stessa fila (A1-6 per esempio) hanno la stessa concentrazione dell'antigene aggiunto a loro.
    3. Impostare un controllo negativo nella riga A con l'aggiunta di antigene 0 ng -1 ml. Aggiungere crescente concentrazione dell'antigene le righe (BG) seguiti da triton x-tampone (5% Triton X-100) in cellule H riga per lisare le cellule per essere utilizzato come controllo positivo. Incubare a 37 ° C per 20 minuti per permettere alle cellule di rilasciare i suoi mediatori.
  3. Impostazione di controlli e individuali:
    1. Dopo l'incubazione, trasferire 50 ml di surnatante cellula all'altra metà delle piastre (pozzi a pozzi A1-6 A7-12, ecc). Scartare i restanti 50 ml di surnatante e sostituire con 50 ml di triton x-tampone per consentire la misurazione della quantità di mediatori rilasciati in ciascun pozzetto in colonne 7-12 come percentuale dei mediatori totale all'interno delle celle nella colonna 1-6 .
  4. Substrato enzimatico:
  5. Aggiungere 50 ml di substrato β-dell'esoaminossidasi (50 mM 4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminide preparata in DMSO diluita fino a 2 mM aggiungendolo al tampone citrato 0,2 M di acido citrico e sodio acetato 0.2 M, pH 4.5) a tutti i pozzetti facilitato la conversione del substrato 4-nitrofenolo dall'enzima β-dell'esoaminossidasi. Incubare le piastre a 37 ° C per 2 ore.

Figura 2.4.1

  1. Terminare la reazione:
    1. Arrestare la reazione aggiungendo 150 microlitri del tampone Tris (1 M Tris-HCl, pH 9) a ciascun pozzetto come l'alto pH del tampone arresta la reazione e trasforma il 4-nitrofenolo in un colore giallo.
  2. La lettura e l'analisi dei risultati:
    1. Leggere la piastra utilizzando uno spettrofotometro piastra a 405 nm per misurare l'assorbanza del colore giallo. Calcolata la percentuale di rilasciato β-dell'esoaminossidasi utilizzando la seguente formula:

Figura 2.6.1

  1. Applicare questa formula in ogni pozzetto, dopo di che in media è data per ogni riga. A1 e A7 rappresentano la posizione dei pozzetti della piastra da 96 pozzetti. Tracciare un grafico della percentuale di rilascio di β-esosaminidasi (che corrisponde al rilascio di mediatori totale) agaiNST antigene concentrazione di 2, 3.

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Representative Results

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I genitori cellule RBL-2H3.1 e quelle trasfettate con il gene del recettore equina FcεRIα sono stati sensibilizzati con il mouse IgE contro DNP-HSA e sfidati con l'antigene DNP-HSA. Mouse IgE si lega al recettore di ratto endogena in entrambe le linee cellulari e quindi agisce come un controllo per verificare la fattibilità rilascio di entrambe le linee cellulari di rilasciare mediatori (Figura 1 A). Questo è un controllo importante e dovrebbe essere effettuata regolarmente dal momento esteso (> 10 settimane) passaggio in coltura cellulare, le cellule RBL-2H3.1 deriva verso il fenotipo non secernente 27. Le cellule parentali sostenuto un rilascio picco mediatore del 51.54% ± 4,79%, mentre le cellule che esprimono il recettore equina FcεRIα hanno avuto un picco di rilascio mediatore del 45.99% ± 5,76%. Queste linee cellulari stessi dove poi sensibilizzati con equina IgE contro NIP-HSA e sfidato con l'antigene NIP-HSA (Figura 1 B). Cellule genitori non hanno subito il rilascio di mediatori, dal momento che laequina IgE non si lega al recettore di ratto endogena. D'altra parte, come previsto, cellule RBL-2H3.1 esprimenti il ​​recettore equina FcεRIα sottoposti rilascio di mediatori quando sensibilizzata con equina IgE contro NIP-HSA e sfidato con l'antigene NIP-HSA, dando un rilascio picco del 36.68% ± 4,88% .

Questi risultati confermano l'efficacia di questo protocollo saggio di rilascio nelle indagini di rilascio di mediatori attraverso il recettore IgE equina. Ciò dimostra che questa linea cellulare è uno strumento diagnostico utile nella ricerca per valutare nuove strategie di intervento terapeutico in allergia equina in vitro, riducendo la necessità di sperimentazione animale. Lo stesso protocollo è applicabile alle cellule RBL-2H3.1 trasfettate con il recettore FcεRIα canino umano e anche.

Questo protocollo è stato utilizzato anche per testare la sicurezza di una strategia di immunizzazione potenziale che tenta di neutralizzare il siero canino anticorpi IgE 30. Dai risultati(Figura 2) si può determinare che la strategia di immunizzazione non è sicuro. Il siero anti-canino-IgE legato correttamente al canino IgE come originariamente previsto per neutralizzare siero IgE e impedirgli di adsorbimento in suo recettore. Ma questo legame non specifico è stato, e quindi il siero trasversale anti-IgE collegato il recettore sulla superficie delle cellule, con conseguente rilascio di mediatori, potenzialmente causando uno shock anafilattico se questa strategia di immunizzazione è stato utilizzato come un vaccino anti-allergia.

RBL-2H3.1 Esprimendo Equine FcεRIα - - Prodotto in laboratorio
Equine IgE contro NIP-HSA - - Prodotto in laboratorio
96 pozzetti Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipetta Anachem - -
Incubatrice Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-acido nitrophenylacetic Cambridge biochimici di ricerca N-1070-1 NIP-OH è stato coniugato con albumina sierica umana per fare NIP-HSA in laboratorio
Dinitrofenile coniugato a Human Serum Albumina Sigma A6661 Abbreviato DNP-HSA
Piastra Spettrofotometro Anthos Labtec HT2 - -
Tubi Sigma P1851 -
Cloruro di sodio Sigma S7653 -
Cloruro di potassio Sigma P9333 -
Cloruro di magnesio Sigma M2670 -
Cloruro di calcio Sigma C1016 -
Triton X100 Sigma X100 -
4-nitrofenil N-acetil-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Soluzione madre di substrato chiamato β-esosaminidasi 50mM è stato preparato in DMSO
Dimetilsolfossido Sigma D2650 -
Acido citrico Sigma 251275 -
Acetato di sodio Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

Tabella 1: Tabella dei Materiali e attrezzature:

Figura 1
Figura 1: A mostra il saggio di rilascio preformato su cellule RBL-2H3.1 non esprimono equina FcεRIα e che esprimono il recettore utilizzando il mouse IgE contro DNP-HSA. Il mouse IgE si lega al recettore di ratto endogena con conseguente rilascio di mediatori quando provocati con l'antigene DNP-HSA, confermando in tal modo che entrambe le linee cellulari sono vitali e supportano IgE-mediata antigene indotta mediatore release 2, 3. Il grafico B mostra il saggio di rilascio preformato sulle cellule parentali RBL-2H3.1 che non esprimono equina FcεRIα e coloro che esprimono equine FcεRIα, utilizzando equina IgE contro NIP-HSA per la sensibilizzazione delle cellule. Il equina IgE si lega al recettore equina, ma non il recettore di ratto endogena, per provocare il rilascio di mediatori, questo è confermato poiché le cellule parentali non rilasciare mediatori mediatore, mentre le cellule che esprimono il recettore supporto equina equine IgE-mediata, antigene indotto , mediatore rilascio 2, 3.

Figura 2
Figura 2: i risultati del test di rilascio Immunizzazione: Il grafico mostra il saggio di rilascio preformato su cellule RBL-2H3.1 esprimono canino FcεRIα, utilizzando canino IgE contro NIP-HSA per la sensibilizzazione delle cellule, e nel ratto immunizzato anti-canino-IgE nel siero come antigene. Il controllo è stato utilizzato il siero pre-immunizzati, e il controllo positivo è stato l'antigene NIP-HSA. Il cane IgE si lega al recettore canino. Inoltre, il siero anti-IgE si lega al recettore legato canino IgE e collegamenti attraversano, e il recettore, sulla superficie delle cellule con conseguente rilascio di mediatori. Questo, in effetti, dimostra che questa particolare strategia di immunizzazione ha il potenziale di causare una reazione shock anafilattico, e quindi non è considerato sicuro 30.

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Discussion

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In sintesi i risultati di questa indagine hanno dimostrato che quando le cellule RBL-2H3.1 esprimono FcεRIα equini sono sensibilizzati con equina IgE e contestate da un antigene, danno un rilascio picco mediatore del 36.68% ± 4,88% del totale di mediatore all'interno della cellule, rispetto alla RBL-2H3.1 cellule parentali non esprimono equina FcεRIα.

Così questo test fornisce un utile strumento per indagare e studiare le risposte allergiche equini in vitro. La sua consente la determinazione della quantità di mediatore rilasciata dalle cellule di mastociti / basofili lignaggio e quindi ci si può aspettare per far progredire la ricerca in allergia equina, se la valutazione allergie causando agenti, o la ricerca di IgE / agenti bloccanti dei recettori.

Questo test è stato modificato per studiare l'allergia equina da pubblicazioni precedenti che hanno usato per studiare umani e canini allergie 4529 per le medesime finalità. La linea cellulare di ingegnerias esprimendo umana e FcεRIα canini sono stati impiegati per studiare l'efficacia e la sicurezza di agenti allergici blocco come i vaccini mirati l'inibizione dell'interazione IgE / recettore 30. L'inchiesta ha rivelato un effetto collaterale anaphylactogenic di immunogeni che comprende l'intero dominio Cε3, che è stato proposto anche da altri come un vaccino per attenuare reazioni allergiche IgE-mediate nei cani 24. Sulla base della nostra ricerca, la base molecolare per questa potenzialmente grave complicazione potrebbe essere razionalizzata sulla base del riconoscimento di epitopi di anticorpi IgE del siero immune anti-IgE contenente anticorpi anti-IgE che colpiscono epitopi in Cε3 e non sono oscurate quando IgE è complessato al suo recettore. Questa osservazione non avrebbe potuto essere realizzato in assenza di questo sistema di analisi ed è in stridente contrasto con l'indagine entro il 24, che ha anche studiato la strategia di intervento anti-allergia sulla base di in vivo immunizione con i domini Cε3, ma non hanno discusso la sicurezza della strategia per l'assenza di un tale test.

I passaggi critici di questo protocollo è quello di garantire che la maggior parte delle cellule RBL-2H3.1 sono del fenotipo secernente; avente le cellule in coltura superiore alle 10 settimane li fa iniziare a spostarsi verso il fenotipo non secernente 27 indipendentemente dal fatto che esprimono il FcεRIα clonato di interesse o meno. Pertanto è sempre essenziale per l'esecuzione del mouse IgE controlli positivi fianco l'esperimento (Figura 1), e di mantenere un grande magazzino congelata di cellule secernenti.

Inoltre, il pH di tutti i buffer deve essere accurata o rischiano di dare risultati falsi negativi; estendere la shelf-life di buffer altera il pH, e quindi ogni tampone più vecchio di 2 mesi deve essere scartato.

La tecnica mostra l'interazione di una sostanza chimica con il ce RBL-2H3.1LLS, e come si promuove o evita, il loro rilascio di mediatori in vitro. Questa è una buona indicazione di ciò che potrebbe accadere in vivo, quindi questo protocollo è un passo essenziale quando la ricerca di possibili strategie terapeutiche anti-allergia. La tecnica non è, tuttavia, indicano quale parte del complesso anticorpo / recettore della molecola di interesse interagisce.

Altro lavoro di ricerca, come ad esempio 20 hanno indicato che equina RAO non è legato alle IgE mediazione, che è il motivo per cui una certa discrepanza può essere visto con altri editori come Moran et al. 31 quando si utilizza siero equino totale di testare a Ca 2+ afflusso da RAO sofferenza cavalli utilizzando anticorpi reaginic non specifici, per i quali gli anticorpi differenti sarebbe responsabile per il cellulare 2+ afflusso Ca.

Questo test è specifico per ipersensibilità IgE mediate, che possono anche essere applicati ad altri organismi, come gli esseri umani e29 cani, e in particolare utilizzato per testare la sicurezza delle strategie di intervento anti-allergia, come ad esempio sintetici / chimerici anti-allergia 30.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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Sviluppo di un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema modello per studiare l&#39;interazione tra<em&gt; Equus</em&gt;<em&gt; Caballus</em&gt; IgE con il suo recettore ad alta affinità FcεRI
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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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