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Immunology and Infection

개발 doi: 10.3791/52222 Published: November 1, 2014

Introduction

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알레르기는 천년 알려져있다. 천식 치료는 Ebers 파피루스 (~ 1550 BCE)로 알려진 고대 이집트 의료 텍스트에 설명하고 7을 치료하는 한약을 논의했다.

현재 알레르기는 T 헬퍼 세포 유형 2 (TH (2)) 면역계의 아암 알레르겐이라고 환경 항원에 반응하여 면역 글로불린 E (IgE의) 항체의 생산을 조향 타입 I의 과민 반응으로 분류된다. 이들은 일반적으로 면역계 세포와 상호 작용 된 IgE 합성을 담배 연기 또는 디젤 배기 미립자 입자 향상 않은로서 인터루킨 -4 및 인터루킨 13 (8, 9)을 포함하여 합성 및 염증성 사이토 카인의 분비를 자극하는 다양한 물질이다 10.

지난 50 년 동안 선진국에서 알레르기 증상의 상승의 효과의 조합에 기인 된'위생 가설'(11)에 의해 제안 된 TH 사이토 카인이 지배적 프로파일 향해 면역 반응을 전환하기 위해 결합 환경 오염 물질 및보다 위생적 환경 동향.

전술 한 바와 같이, 인간 알레르기 시달리다 만 포유류 아니다. 특히 말과 개는 클래식 알레르기 반응을 개발할 수 있고, 말 알레르기가 유전 적, 환경 적 요인에 기인 인간에로 (12)의 연구는 것을 보여 주었다. 결과적으로,이 동물은 한 번 임상 증상이에서 설정 한 알레르기의 유전 적, 환경 적 원인, 질병에 감작에서의 진행, 가능한 한 개입 전략 사이의 상호 작용 연구를위한 좋은 모델을 제시

1887 년, Stömmer는 말 심혈관 시스템 히스타민의 효과는 인간과 말, 천식 (13) 사이의 유사성을 설명하는 첫 번째 사람이었다인간 (14)의 그것과 매우 유사합니다. 말은 15 매년 115,000,000,000달러 미국의 도박 매출과 가치가 미국 720 억 달러 인 경마 산업의 초석이다.

대부분의 현대 경주마는 이후 1878에서 레이디 앤 블런트가 자란 아라비아 말의 적은 수의 자손입니다. 현대 경주마는 일반적으로 성능 능력에 대한 선택 근친된다. 이들은 알레르기 반응을 탑재 감수성 중 하나는 유전 질환,되기 쉽다. 또한 심지어 가장 심각한 알레르기 인간 (16)보다 1000 배 더 높은 혈청 IgE의 수준을 가지고있다. 말 알레르기 반응은 일반적으로 곤충 물린 과민 반응 (IBH) 17, 18로 나타나있다. 때문에 물기에 피부염에 IBH 결과가 속 Culicoides 곤충을 형성한다. 말 알레르기 질환의 또 다른 형태는 재발 성기도에 장애물 (RAO)이이 폐와기도에 명시되어 있습니다. 그것은 천명 및 실험실 특징OR 연산 호흡. RAO 일반적 포자를 성형하는 응답하여 발생하고, 다른 조사이 20를 확인되지 않았지만 높은 알레르겐 - 특이 IgE 수준 한 연구 19 RAO 앓고 말에 기록되었다.

말 알레르기에 대한 연구가 시도 모니터링에서 안티 말 IgE의 단클론 항체 (21, 22)을 개발하여 말 IgE의 중화 주위에 회귀. 또한 23 의한 연구 말 고친 화성 Fc 수용체의 α의 세포 외 도메인의 생성을 논의 말 혈청의 IgE를 감지하고 정량화하려는 시도에 체인 (FcεRIα) 수용체. Ledin (24)에 의해 관련 연구는 자기 / 비 자기 면역원을 사용하여 면역 체계를 프라이밍에 의해 혈청의 IgE를 중화하기위한 새로운 접근 방법에 대해 설명합니다. 이러한 모든 연구는, 그러나, 이들 프로토콜의 안전성과 효능을 테스트하기 위해 효과적인 분석 결여. 이 글에서, 우리는 지금 이러한 분석 SYS을 제시β-소사 미나을 출시, 세포 매개 탈과립의 지표로, 말 FcεRIα을 표현 RBL-2H3.1 세포에 평가 된 말 시스템, 관련 진단 및 치료 전략의 연구에 적용 TEM. 이 프로토콜은 다른 종으로부터 IgE에 대한 고친 화성 수용체의 IgE 결합 도메인을 코딩하는 유전자로 형질 RBL 세포 공학 기술하는 이전의 간행물 25, 4, 5, 2, 3에 기초한다. 이 프로토콜의 결과는 세중의 실험 표준 편차 평균 ±로 표시되는 β-소사 미나 자료 분석을 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

자료 분석은 처음 Siraganian에 의해 개발과 인간의 알레르기를 연구하는 25 후크했다. 닥터 루벤 Siraganian 이끄는 실험 그룹은 RBL 세포주를 개발했다. 이러한 RBL 세포는 인간 FcεRIα을 표현하기 위해 개발되었고, 프로토콜은 (4)에 의해 출판되었다. 마지막 조각분석은 4- 히드 록시 3 합텐을 대상 IgE의 가변 영역에 대한 마우스 유전자의 하류 중쇄 유전자를 클로닝하여 IgE 항체의 생산을 설명 NEUBERGER (26)에 의해 종이 PSV 플라스미드의 개발과 함께의 니트로 - phenacetyl은 (NP), 결과 키메라 항체는 완벽하게 작동했다. 또한 호 염기성 세포의 탈과립을 측정하는 데 유용하게 분석 프로토콜의 표준화 결과 RBL 세포 표면 수용체를 클로닝하는 동안 능력은 동일한 합텐 타겟팅 임의의 IgE를 개발.

분석은 장점과 단점을 가지고있다. 분석의 장점은 우리 실험실 따라서 인간, 송곳니와 말 시스템의 탈과립을 테스트하는 데 사용되는 한 모든 포유류 시스템에서 사용되는 적응성이며,이 단순히 유기체의 IgE의 합성과 이의 수용체를 복제하여 달성 RBL 세포의 표면 상.

한편,분석의 단점 RBL 세포들이 동일한 분석 내에서 탈과립 레벨의 변화를 만들어주고, 열적, 기계적, PH 변화에 매우 민감하다는 것이다. 따라서 그것은 강하게 분석은 항상 3 회 반복 반복 한 후 평균 그들로부터 촬영하는 것이 좋습니다. 나아가, RBL 세포는 그들의 유지 관리를 복잡하게 연장 된 시간 (> 10 주) 27 조직 배양에 남아 있다면 비 방출 표현형을 향해 이동하는 경향이있다. 또한 광학 현미경에서 볼 수없는 셀의 형태를 변경하지 않는 마이코 플라스마 균에 의한 감염,하는 경향이 있지만, 크게 자신의 탈과립 수준을 변경합니다. 따라서 정기적 인 마이코 플라스마 시험이 필요하다.

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Protocol

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세포주의 1) 준비 :

  1. FcεRI α의 발현 RBL-2H3.1 세포주 개발 :
    1. 28 : 단층 세포 라인에 대한 기본 조직 배양 기술을 이용하여 말 FcεRIα 유전자 (GenBank 등록 Y18204.1)를 들고, pEE6 플라스미드를 사용하는 부모 RBL-2H3.1 세포를 형질. 1.2 X10 7 셀 ML -1의 밀도로 세포의 0.8 ml의 플라스미드 DNA의 2 μg의 μL -1을 추가합니다. 즉시 10 분 동안 얼음에서 인큐베이션 0.4 cm의 electrocuvette를 이용한 250 V 960 μF에서 세포 Electroporate.
    2. 네티의 G418 황산 0.4 g을 포함하는 미디어를 사용하여 형질 전환 된 세포를 선택한 다음, 형광 면역 글로불린 항체로 태그를 지정하여 FACS를 통해 남아있는 살아있는 세포를 정렬 할 수 있습니다. 수사 2, 3에 대해 말 FcεRIα 세포주를 발현 RBL-얻어진 2H3.1 사용.
  2. 사전 분석 항체 감작 :
      5 셀 ML의 -1의 세포 밀도로 배양 배지에 세포를 다시 중단 후 씻는다.
    1. 1 NG ml의 -1의 최종 농도로 일시 중단 된 세포에 관심 IgE에 추가 한 후 1-6 열에서 96 웰 플레이트에 세포를 100 μl를 판 37 ° C ~ + 5 % CO 2 + 90 % 부화 16 시간 동안 상대 습도. 배양 시간 후 및 박리 시험을 수행하기 전에, 잘 자랄 및 세포 부착에 대한 현미경 웰을 확인.

2) 자료 분석 :

  1. 세포를 세척 :
    1. 따뜻한 방출 완충액 37 ° C에서 (25 밀리미터 PIPES, 120 mM 염화나트륨, 5 mM 염화칼륨, 0.04 mM의 염화 마그네슘, 및 1mM의 염화칼슘)은 부드러운 셀 세정을 허용한다.
    2. 세포 용지를 제거하기 위해 판을 튕기 따뜻한 100 μl를 추가하여 3 세포를 씻으7 ° C를 방출 버퍼입니다. 두 번 반복합니다.
  2. 항원 과제 :
    1. 항원의 용액을 희석 0 NG ml의 -1, 0.1 NG ml의 -1, 1 NG ml의 -1, 10 NG ml의 -1, 100 NG ml의 -1 (NIP-HSA 또는 DNP-HSA), 1000 NG ml의 준비 -1, 10,000 NG 릴리스 버퍼 ml의 -1, 37 ° C에서 따뜻한.
    2. 두 번째 셀을 세척 한 후, 미디어를 무시하고 항원 용액 100 ㎕로 대체. 같은 행의 우물 (예를 들어 A1-6)이 그들에 추가 된 동일한 항원 농도가 있는지 확인하십시오.
    3. 0 NG ml의 -1 항원을 추가하여 행에서 음성 대조군을 설정합니다. 트리톤 X-완충액 (5 % 트리톤 X-100), 행 H 세포는 세포를 용해하는 다음 행 (BG) 아래로 증가하는 항원의 농도를 추가 양성 대조군으로 사용한다. 20 분 세포는 매개체를 해제 할 수 있도록, 37 ° C에서 배양하라.
  3. 개별 잘 컨트롤을 설정 :
    1. 배양 후, 플레이트의 나머지 절반 (A1-6 웰 웰 A7-12 행, 등)에 세포 상청액 50 μl를 옮긴다. 상청액의 나머지 50 μl를 버리고 컬럼 1-6 셀 내부 전체 매개체의 비율로 잘 컬럼 7-12의 각 매개체 방출의 양의 측정을 허용하도록 트리톤 X-완충액 50㎕의 교체 .
  4. 효소 기판 :
  5. β-소사 미나 기판 (50 mM의 4- 니트로 N 아세틸 β-D-글루코 시트르산 완충액, 0.2 M 시트르산 및 0.2 M 아세트산 나트륨을 첨가하여 2 mM의 아래로 희석 된 DMSO에서 제조하여 pH 4.5) 50 μl를 추가 모든 웰에 β-소사 미나 제 효소에 의해 4- 니트로 페놀에 대한 기판의 전환을 촉진한다. 2 시간 동안 37 ° C에서 번호판을 품어.

그림 2.4.1

  1. 반응을 종료 :
    1. 각각 150 ㎕를 첨가 트리스 완충액 (1 M 트리스 -HCl, pH가 9)뿐만 아니라 버퍼의 높은 pH로 반응을 정지하여, 반응을 정지하고 황색로 -4- 니트로 페놀 변.
  2. 결과를 읽고 분석 :
    1. 노란 색의 흡광도를 측정하기 위해 405 nm에서 플레이트 분광 광도계를 사용하여 판을 읽어보십시오. 다음 식을 이용하여 풀어 β 헥 소사 미나 백분율 계산 값 :

그림 2.6.1

  1. 평균이 각 행에 대해 수행 된 후 각 웰에이 수식을 적용합니다. A1 및 A7은 96 웰 플레이트에서 웰의 위치를​​ 나타낸다. 전압 강하 (총 중재자 릴리스에 해당) β-소사 미나 릴리스의 비율의 그래프를 그린다NST 항원 농도 (2, 3).

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Representative Results

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부모 RBL-2H3.1 세포 및 말 FcεRIα 수용체 유전자로 형질들은 먼저 마우스의 IgE 항 DNP-HSA 감작과 DNP-HSA 항원으로 감염시켰다. 마우스 IgE의 양쪽 세포주에서 내인성 쥐 수용체에 결합하므로 매개체 (그림 1 A)를 풀어 두 세포주의 분리 가능성을 테스트하기 위해 대조군으로서 작용한다. 이 중요한 검사이며, 세포 배양에 확장 (> 10 주) 통과에 정기적으로 이후 수행되어야한다, RBL-2H3.1 세포는 비 분비 표현형 (27)을 향해 표류. 말 FcεRIα 수용체를 발현하는 세포가 5.76 % ± 45.99 %의 최대 중재자 릴리스가 있었을 때 부모의 세포는 4.79 % ± 51.54 %의 최대 중재자 릴리스를 지원했다. 다음 말의 IgE 항 NIP-HSA 감작 및 NIP-HSA 항원 (도 1 B)와 동일한 도전 선택된 세포주. 부모의 세포가 있기 때문에, 중재자 자료를받지 않았다말의 IgE는 내생 쥐 수용체에 결합하지 않습니다. 예상대로 4.88 % ± 36.68 %의 최대 방출을주고, 말의 IgE 항 NIP-HSA 감작 및 NIP-HSA 항원 도전 때 한편, 말 FcεRIα 수용체를 발현 RBL-2H3.1 세포는 매개체 방출을 시행 .

이러한 결과는 말의 IgE 수용체를 통해 중재자 자료의 조사에서이 릴리스 분석 프로토콜의 효율성을 확인합니다. 그것은이 세포주는 동물 실험의 필요성을 줄여 체외에서 말 알레르기에 엉덩이 소설 치료 개입 전략에 대한 탐구에 유용한 진단 도구입니다 것을 보여줍니다. 동일한 프로토콜은 인간 및 갯과 동물 FcεRIα 수용체로 형질 RBL-2H3.1 셀에 적용 가능하다.

이 프로토콜은도 30의 IgE 항체를 송곳니 혈청 중화하려고 잠재적 면역화 전략의 안전성을 테스트하는 데 사용 하였다. 결과로부터(도 2)에서은 면역화 전략 안전 아니라고 판정 할 수있다. 원래는 혈청 IgE의 중화 및 이의 수용체에 결합되는 것을 방지하기 위해 의도 된대로 항 - 송곳니-IgE의 혈청 성공적 송곳니의 IgE에 결합. 그러나 이것은 비특이적 결합시킨, 따라서 항 IgE의 혈청 크로스이 면역화 전략이 알러지 백신으로서 사용 된 경우 잠재적 과민성 쇼크의 결과, 매개체 방출의 결과, 세포의 표면 상에 수용체 결합.

RBL-2H3.1는 말 FcεRIα을 표현 - - 실험실에서 생산
말의 IgE 항 NIP-HSA - - 실험실에서 생산
96 웰 플레이트 시그마 CLS3595 -
멀티 채널 피펫 Anachem - -
보육 갤럭시 R - -
4Hydroxy -5- 요오도 -3- 카복실산 nitrophenylacetic 캠브리지 연구 바이오 케미컬 N-1070-1 NIP-OH는 실험실에서 NIP-HSA를 만들기 위해 인간 혈청 알부민과 결합 된
인간 혈청 알부민 디 니트로 공역 시그마 A6661 단축 DNP-HSA
플레이트 분광 광도계 Anthos Labtec HT2 - -
파이프 시그마 P1851 -
나트륨 염화물 시그마 S7653 -
염화칼륨 시그마 P9333 -
염화 마그네슘 시그마 M2670 -
칼슘 염화물 시그마 C1016 -
트리톤 X100 시그마 X100 -
4- 니트로 페닐 N- 아세틸-β-D-글루코 시그마 N9376 원액이라고 β-소사 미나 기판의 50 mM은 DMSO를 제조 하였다
디메틸 설폭 사이드 시그마 D2650 -
구연산 시그마 251275 -
아세트산 나트륨 시그마 S7670 -
트리스 시그마 T5941 -

표 1 : 재료 및 장비의 테이블 :

그림 1
그림 1 : 그래프는하지 말 FcεRIα을 표현하고 마우스 IgE를 방지 DNP-HSA를 사용하여 수용체를 발현하는 RBL-2H3.1 세포에 미리 형성 릴리스 분석을 보여줍니다. 따라서 두 세포주가 가능한하고 지원하는지 확인, DNP-HSA 항원에 도전 항원 유도 중재자 릴리스 2, 3의 IgE 매개 성. 그래프 B가 미리 형성 릴리스 분석을 표시 할 때 마우스의 IgE는 중재자의 릴리스에서 발생하는 내인성 쥐의 수용체에 결합 세포 과민성 말 IgE에 방지 NIP-HSA를 사용하여, FcεRIα 그 표현 말 FcεRIα 말을 표현하지 RBL-2H3.1 부모의 세포에. 말 IgE의 조정자 릴리스에서 발생하는 내인성 쥐 수용체를 말 수용체에 결합 아니라, 세포가 말 수용체 지원을 표현하면서이는, 중재자 중재자를 공개하지 않은 부모의 세포 때문에 확인 말은 IgE를 매개로, 항원 유발 , 중재자는 3, 2를 놓습니다.

그림 2
그림 2 : 예방 접종 자료 분석 결과 : 그래프는 세포 과민성 개 IgE에 방지 NIP-HSA를 사용하여, 송곳니 FcεRIα을 표현 RBL-2H3.1 세포에 미리 형성 릴리스 분석을 보여주고, 항원 등의 예방 접종을 쥐 방지 개-IgE 항체 혈청. 사용 제어 혈청 미리 면역하고, 양성 대조군은 NIP-HSA 항원이었다. 송곳니의 IgE는 개과의 수용체에 결합. 또한, 항 IgE의 혈청은 매개체 방출의 결과 세포의 표면에 결합 된 개과의 IgE 수용체와 상호 연결을하고, 수용체에 결합한다. 이것은 사실상, 특정 면역화 전략 과민성 쇼크 반응을 일으킬 가능성이 있고, 따라서 30 안전한 것으로 간주되지 않는다는 것을 증명한다.

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Discussion

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요약하면,이 조사 결과는 말 FcεRIα 발현 RBL-2H3.1 세포는 항원에 의해 말의 IgE로 감작 및 도전 될 때, 그들은 내부 매개체의 총량 4.88 % ± 36.68 %의 피크 매개체 방출을주는 것으로 나타났다 세포, RBL-2H3.1에 ​​비해 부모의 세포가 말 FcεRIα을 표현하지.

따라서이 분석은 조사하고 체외에서 말 알레르기 반응을 연구하기위한 유용한 도구를 제공합니다. 그는 비만 세포 / 호 염기성 혈통의 세포에 의해 발표 중재자의 양의 결정을 할 수 있으며, 따라서, 말 알레르기에서 연구를 발전 할 것으로 예상 에이전트의 원인이 알레르기를 평가, 또는 차단제의 IgE / 수용체를 연구 여부를 할 수 있습니다.

이 분석은 동일한 목적을 위해 인간과 개 알레르기 4529을 연구하는 데 사용 이전의 출판물에서 말 알레르기를 연구하기 위해 수정되었습니다. 조작 된 세포주인간을 표현하는 일이고 송곳니 FcεRIα 그러한의 IgE / 수용체 상호 작용 (30)의 억제를 목표로 백신으로 알레르기 블로킹 제의 효과와 안전성을 연구하기 위해 사용되었다. 조사는 또한 개 (24)에 대한 IgE 매개 알레르기 반응을 감쇠 백신으로 다른 사람에 의해 제안 된 전체 Cε3 도메인을 포함하는 면역원의 anaphylactogenic 부작용을 밝혔다. 조사에 따르면, 잠재적으로 심각한 합병증을위한 분자 기초는 IgE의 경우 가려진되지 Cε3의 에피토프를 대상으로 항 IgE 항체를 함유하는 항 IgE의 면역 혈청에서의 IgE 항체의 에피토프 인식에 기초 합리화 할 수있다 그 수용체 복합체됩니다. 이러한 관찰은이 분석 시스템의 부재하에 제조 및 또한 생체 immuni에 기초하여 항 알러지 개입 전략을 조사 (24)에 의해 조사에 현저한 대조를 이룬다 없었을Cε3 도메인이 아네트하지만 인해 이러한 분석의 부재로 전략의 안전성을 논의하지 않았다.

이 프로토콜의 핵심 단계는 RBL-2H3.1 세포의 대다수가 분비 표현형의 것을 보장하는 것이다; 10보다 주간 그들을 원인 배양 세포를 갖는 관계없이 관심 클로닝 FcεRIα 발현 여부의 비 분비 표현형 27 향해 드리프트 시작. 그러므로 실험 (도 1)과 함께 마우스 IgE의 양의 제어를 실행하고, 분비 세포의 큰 냉동 재고를 유지하는 것이 필수적이다.

또한, 모든 버퍼의 pH는 정확해야하거나 거짓 음성 결과를주는 위험; 버퍼의 저장 수명을 연장하는 것은 자신의 pH를 변경하고, 따라서 어떤 2​​ 개월 이상 폐기 할 필요성 버퍼.

기술은 RBL-2H3.1 세륨과의 화학적 상호 작용을 도시LLS, 그것은, 또는 억제 체외에서의 중재자 방출을 촉진하는 방법에 대해 설명합니다.이 잠재적 인 안티 - 알레르기 치료 전략을 연구 할 때 생체 내에서 일어날 일의 좋은 표시가, 따라서이 프로토콜은 필수적인 단계이다. 기술은, 그러나, 대상 분자와 상호 작용이 항체 / 수용체 복합체의 일부를 나타내지 않는다.

약간의 차이가 이러한에서 모란 등. (31) 칼슘을 테스트하기 위해 총 말 혈청을 사용 2+ 유입과 같은 다른 출판사로 볼 수 있습니다 왜 말 RAO는 IgE의 중재와 관련이없는 것을 나타낼 등 20 다른 연구 작업, RAO는 다른 항체가 세포의 칼슘 유입에 대한 책임 것입니다있는 불특정 reaginic 항체를 사용하여 말을 고통.

상기 분석은 인간과 같은 다른 유기체에 적용 할 수있는 IgE의 매개 과민성,에 특이29 개 및 구체적 합성 / 항 알러지 키메라 항체 30 항 알러지 중재 전략의 안전성을 테스트하는 데 사용.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα - - Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA - - Produced in the lab
96 Well Plate Sigma CLS3595 -
Multi Channel Pipette Anachem - -
Incubator Galaxy R - -
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid Cambridge Research Biochemicals N-1070-1 NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin Sigma A6661 Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer Anthos Labtec HT2 - -
Pipes Sigma P1851 -
Sodium Chloride Sigma S7653 -
Potassium Chloride Sigma P9333 -
Magnesium Chloride Sigma M2670 -
Calcium Chloride Sigma C1016 -
Triton x100 Sigma X100 -
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide Sigma N9376 Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide Sigma D2650 -
Citric Acid Sigma 251275 -
Sodium Acetate Sigma S7670 -
Tris Sigma T5941 -

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References

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개발<em&gt; 체외</em의 상호 작용을 연구&gt; 모델 시스템<em&gt; 에쿠스</em&gt;<em&gt; caballus</em높은 친 화성 수용체 FcεRI에&gt;의 IgE
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Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).More

Sabban, S., Ye, H., Helm, B. Development of an in vitro model system for studying the interaction of Equus caballus IgE with its high-affinity receptor FcεRI. J. Vis. Exp. (93), e52222, doi:10.3791/52222 (2014).

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