Med hjälp av detta protokoll, kunde vi bilden 160 ìm tjock hjärnsektioner från möss infekterade med parasiten Toxoplasma gondii, vilket möjliggör visualisering och analys av rumsliga förhållandet mellan encysting parasit och den infekterade neuron.
Toxoplasma gondii är en obligat, intracellulär parasit med ett brett spektrum av värd, inklusive människor och gnagare. I både människor och gnagare, Toxoplasma etablerar ett livslångt ihållande infektion i hjärnan. Även om detta hjärninfektion är symptomfri i de flesta immunkompetenta människor, i det växande fostret eller nedsatt immunförsvar, såsom förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) patienter, detta förkärlek för och uthållighet i hjärnan kan leda till förödande neurologisk sjukdom. Det är sålunda klart att hjärn Toxoplasma interaktion är kritisk för symtomatisk sjukdom producerad av Toxoplasma, men vi har liten förståelse för det cellulära eller molekylära interaktionen mellan celler i det centrala nervsystemet (CNS) och parasiten. I musmodell av CNS toxoplasmos det har varit känt i över 30 år som nervceller är cellerna där parasiten kvarstår, men lite information finns tillgänglig om vilkadel av neuron är allmänt infekterat (soma, dendrite, axon) och om denna cellulära förhållandet förändras mellan stammar. Delvis denna brist är sekundär till svårigheten att bildbehandling och visualisering hela infekterade nervceller från ett djur. Sådana bilder skulle normalt kräva seriesnittning och sömnad av vävnad avbildas genom elektronmikroskopi eller konfokalmikroskopi efter immunfärgning. Genom att kombinera flera tekniker, den metod som beskrivs här möjliggör användning av tjocka sektioner (160 nm) för att identifiera och bild hela celler som innehåller cystor, vilket gör tredimensionell visualisering och analys av enskilda, kroniskt infekterade nervceller utan behov av immunfärgning, elektronmikroskopi eller seriesnittning och sömnad. Med denna teknik kan vi börja förstå det cellulära förhållandet mellan parasiten och den infekterade neuronen.
Det övergripande målet med denna metod är att med hög upplösning, tredimensionella bilder av enskilda nervceller som är infekterade av obligat intracellulära parasiten Toxoplasma gondii.
Toxoplasma anses ofta vara en av de mest framgångsrika parasiter på grund av dess stora mellanvärdområde, vilket inkluderar människor och gnagare. I både människor och gnagare, efter akut infektion genom intag av förorenad mat eller vatten, är Toxoplasma kan orsaka en ihållande infektion i CNS genom att konvertera från dess snabba repliker formen (den tachyzoite) till dess långsamma replikerande och encysting formen (den bradyzoite ). I immunkompetenta individer, är denna latenta CNS infektion tros vara relativt symptomfria, men med nedsatt immunförsvar såsom AIDS-patienter eller transplanterade patienter, kan nya utbrottet av parasiten leda till dödlig toxoplasmic encefalit 1,2. Dessutom senaste studierna have visat att latent infektion med Toxoplasma kan leda till beteendeförändringar hos gnagare 3,4, men mekanismen är okänd.
Överraskande, trots dessa uppgifter belyser vikten av CNS- Toxoplasma interaktion, är relativt lite känt om detta förhållande, speciellt på cellulär och molekylär nivå. Förmågan att studera även enkla aspekter av hjärn-parasit interaktion har hind delvis av teknologisk begränsningar. Till exempel, de flesta av det arbete som visar att neuroner är de celler i vilka cystor härdar har gjorts med elektronmikroskopi (EM) 5,6. Även EM ger hög upplösning, är det tidskrävande, personalkrävande och dyrt. Immunofluorescens (IF) analyser har nyligen använts i samband med konfokalmikroskopi att bekräfta det arbete som EM 7. IF analyser är tekniskt enkelt att utföra och relativt billiga, men med användning av dessa tekniker för att understand det rumsliga förhållandet mellan cysta och smittade neuron kräver seriell rekonstruktion, vilket är tidskrävande, tekniskt svår, och kan leda till förlust av värdefull information. Därför har vi utvecklat en metod som kan användas med musmodell av CNS toxoplasmos och tillåter oss att bilden helheten av infekterade nervceller utan EM eller immunohistokemi (IHC). Genom att utveckla en sådan teknik, kan vi börja att utforska den cellulära förhållandet mellan den infekterade cellen och cysta på ett relativt snabbt och billigt sätt.
Den metod vi utvecklat kombinerar nyare tekniker för optiskt clearing och bild tjocka hjärnan sektioner av konfokalmikroskopi 8 med ett system som markerar in vivo celler som har injicerats med parasitproteiner 9,10. I detta system, vi infektera Cre-reporter möss som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) endast efter Cre-medierad rekombination 11 med Toxoplasma </em> Stammar som uttrycker en röd fluorescerande protein (RFP) och injicerar Cre rekombinas i värdceller 9. Denna kombination gör att vi kan skörda den infekterade musen hjärnan efter CNS-infektion är etablerad, skär tjocka hjärnan sektioner, och snabbt identifiera relevanta områden till bilden genom att hitta RFP + cystor. Det är viktigt att notera att när värdcell uttryck av GFP beror enbart på injektion av Cre av parasiter, och inte på infektion, ett antal av GFP + celler inte innehåller parasiter 10. Eftersom målet med detta protokoll är att kunna bild hela infekterade nervceller, är fokus bara på GFP + nervceller som även innehåller en RFP + cysta, men protokollet kan också användas för att bilden GFP + / RFP – nervceller.
När den infekterade hjärnan skördas och sektion, är de avsnitt återges transparent med glycerol clearing. Lämpliga områden i sektioner sedan avbildas med konfokalmikroskopi, aljande motstycke visualisering av infekterade värdceller och de inkapslade parasiter i sin helhet. Här ger vi en komplett protokoll för att identifiera, optiskt clearing, och bild smittade nervceller.
Med tanke på att cellförändringar i infekterade värdceller har varit kopplade till sjukdomsutfall i infektioner med andra intracellulära organismer som HIV, Rabies, och Chlamydia 18,19, utvecklade vi en teknik som skulle tillåta oss att studera de intima samspel som sker mellan CNS värdcell och Toxoplasma. Den här beskrivna metoden åstadkommer detta mål genom att möjliggöra effektiv bildåtergivning av kroniskt infekterade neuroner. Före utvecklingen av denna metod, såsom avbildning var…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar hela Koshy labbet för bra diskussioner. Vi tackar Patty Jansma och University of Arizona neurovetenskap Institutionen för råd och hjälp med bildbehandling. Vi tackar också Porreca labbet för användningen av deras Vibratome. Denna forskning stöds av US National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
#1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
Imaris Software | Bitplane | ||
Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |