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Summary
Unter Verwendung dieses Protokolls konnten wir Bild 160 um dicke Gehirnschnitte von Mäusen mit dem Parasiten Toxoplasma gondii, der Visualisierung und Analyse der räumlichen Beziehung zwischen dem encysting Parasiten und der infizierten Neuronen ermöglicht infiziert.
Abstract
Toxoplasma gondii ist ein obligat intrazelluläre Parasiten mit einem breiten Wirtsbereich, einschließlich des Menschen und Nagetieren. Bei Mensch und Nager, stellt Toxoplasma eine lebenslange persistierende Infektion im Gehirn. Während dieses Gehirn-Infektion ist asymptomatisch in den meisten immunkompetenten Personen, in den sich entwickelnden Fötus oder immungeschwächten Personen wie das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) Patienten, diese Vorliebe für und Persistenz im Gehirn können zu verheerenden neurologischen Krankheit führen. Somit ist es klar, dass die Hirn Toxoplasma-Wechselwirkung ist für die durch Toxoplasma hergestellt symptomatischen Erkrankungen, doch wir haben wenig Verständnis der zellulären oder molekularen Interaktion zwischen Zellen des Zentralnervensystems (ZNS) und den Parasiten. Im Mausmodell von ZNS-Toxoplasmose es seit über 30 Jahren, die Neurone sind die Zellen, in denen der Parasit besteht bekannt, aber wenig bekannt ist über dieTeil des Neurons wird in der Regel infiziert (Soma, Dendriten, Axonen) und wenn das Mobil Beziehung ändert sich zwischen den Stämmen. Teilweise ist dieses Fehlen Sekundär der Schwierigkeit Bildgebung und Visualisierung ganzen infizierten Neuronen aus einem Tier. Solche Bilder würde typischerweise erfordern Serienschnitt und Heften von Gewebe durch Elektronenmikroskopie oder konfokale Mikroskopie nach Immunfärbung abgebildet. Durch die Kombination mehrerer Methoden, die hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Verwendung von dicken Abschnitten (160 um) zu erkennen und Bild ganze Zellen, Zysten enthält, so dass eine dreidimensionale Visualisierung und Analyse von einzelnen, chronisch infizierten Neuronen ohne Immunofärbung Elektronenmikroskopie oder Serienschnitt und Nähen. Mit dieser Technik können wir damit beginnen, die zelluläre Beziehung zwischen dem Parasiten und den infizierten Neuronen zu verstehen.
Introduction
Das Gesamtziel dieses Verfahrens ist, eine hohe Auflösung, dreidimensionale Bilder von einzelnen Neuronen, die durch die obligate intrazelluläre Parasiten Toxoplasma gondii infiziert werden erhalten.
Toxoplasma wird oft als eines der erfolgreichsten Parasiten wegen seiner großen Zwischenwirtsspektrum, die Menschen und Nagetieren umfasst. Bei Mensch und Nager, nach einer akuten Infektion durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser, ist Toxoplasma der Lage, eine anhaltende Infektion des ZNS durch Umwandlung von seiner schnellen replizierenden Form (der Tachyzoiten) seiner langsamen replizieren und encysting Form führen (die bradyzoite ). Bei immunkompetenten Personen wird dieses latente ZNS-Infektion gedacht relativ asymptomatisch zu sein, aber bei immungeschwächten Personen wie AIDS-Patienten oder Transplantatempfängern, kann Wiederaufleben des Parasiten zu tödlichen Toxoplasma-Enzephalitis 1,2 führen. Darüber hinaus neuere Studien hahabe gezeigt, dass eine latente Infektion mit Toxoplasma kann zu Verhaltensänderungen bei Nagern 3,4 führen, obwohl der Mechanismus ist unbekannt.
Überraschenderweise trotz dieser Daten unterstreichen die Bedeutung des ZNS Toxoplasma Interaktion, ist relativ wenig über diese Beziehung bekannt, vor allem auf zellulärer und molekularer Ebene. Die Fähigkeit, selbst einfache Aspekte der Gehirnparasit Interaktion zu studieren, wurde teilweise durch technologische Einschränkungen behindert. Beispielsweise kann der Großteil der Arbeit, die die Nervenzellen sind die Zellen, in denen Zysten bestehen mit der Elektronenmikroskopie (EM) 5,6 geschehen. Obwohl EM bietet hohe Auflösung, es ist zeitaufwendig, arbeitsintensiv und teuer. Immunfluoreszenz (IF) -Assays wurden kürzlich im Zusammenhang mit der konfokalen Mikroskopie verwendet worden, um die Arbeit von EM 7 getan bestätigen. IF Assays sind technisch leicht durchzuführen und relativ preiswert, aber die Verwendung dieser Techniken zu Untermaßtand die räumliche Beziehung zwischen der Zyste und der infizierten Nervenzelle erfordert Serien Rekonstruktion, die zeitaufwendig, technisch schwierig ist, und können zum Verlust der wertvollen Informationen führen. Daher haben wir eine Methode, die mit dem Mausmodell der Toxoplasmose ZNS verwendet werden können und ermöglicht es uns, Bild die Gesamtheit der infizierten Nervenzellen ohne EM oder Immunhistochemie (IHC) entwickelt. Durch die Entwicklung einer solchen Technik, können wir beginnen, die zelluläre Beziehung zwischen der infizierten Zelle und der Zyste in einem relativ schnelle und kostengünstige Art und Weise zu erkunden.
Die Methode, die wir entwickelt verbindet neuere Techniken zur optischen Clearing- und Abbildungs dicke Gehirnschnitte durch konfokale Mikroskopie 8 mit einem System, das in vivo Zellen, die mit Parasiten Proteine 9,10 injiziert wurden markiert. In diesem System zu infizieren wir Cre-Reportermäusen, die ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) exprimieren nur nach Cre-vermittelte Rekombination 11 mit Toxoplasma 9. Diese Kombination ermöglicht es uns, die infizierte Mäusehirn ernten nach ZNS-Infektion festgestellt, schneiden dicke Gehirnschnitte und schnell zu identifizieren relevante Bereiche für Bild durch Auffinden der RFP + Zysten. Es ist wichtig zu beachten, daß als Wirtszelle die Expression von GFP, hängt ausschließlich von der Injektion von Cre durch Parasiten und nicht auf eine Infektion, eine Anzahl der GFP + -Zellen keine Parasiten 10 enthalten. Da das Ziel dieses Protokolls ist es, in der Lage, Bild gesamten infizierten Nervenzellen sein, ist der Fokus nur auf GFP + Neuronen, die auch ein RFP + Zyste enthalten, aber das Protokoll kann auch für Bild verwendet werden, die das GFP + / RFP - Neuronen.
Sobald der infizierten Gehirn geerntet und geschnitten werden die Abschnitte transparent durch Glycerin Clearing gerendert. Geeignete Bereiche der Abschnitte werden dann mit Konfokalmikroskopie al abzubildendengenden beispiellose Visualisierung der infizierten Wirtszellen und den eingekapselten Parasiten in ihrer Gesamtheit. Hier bieten wir Ihnen ein komplettes Protokoll zur Identifizierung, optisch Clearing-und Imaging-infizierten Nervenzellen.
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Protocol
HINWEIS: Die Mäuse wurden gezüchtet und in einer kontrollierter Temperatur und Luftfeuchtigkeit Zimmer mit 12 h gehalten rückgängig Hell / Dunkel-Zyklen mit Futter und Wasser ad libitum an der Universität von Arizona. Die Experimente wurden unter Richtlinien und Zustimmung des Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of Arizona durchgeführt. Alle Anstrengungen wurden unternommen, um das Leiden zu minimieren. Die Cre-Reporter-Mäuse sind auf einem C57BL / 6 Hintergrund 11 und sind im Handel erhältlich.
1. Maus-Infektion
HINWEIS: - 12 Verfahren Maus Infektion mit Toxoplasma gondii unten beschrieben hat in bisher veröffentlichten 10 Studien verwendet.
- Wachsen Toxoplasma Stämme in der menschlichen Vorhaut-Fibroblasten (HFFs) in Dulbeccos Hohe Glucose kultiviert modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS, 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (cDMEM) in einem T-25-Kolben in einem 5% CO 2 kultiviert, bis Parasiten großen parasitophoren Vakuolen gebildet.
- Spritze Freisetzung Parasiten durch Abschaben Zellen vom Boden des Kolbens und der sich ergebende Lösung durch eine 25-Gauge-Nadel in eine 3 ml Spritze verbunden 2mal im Kolben übertragen dann alle Lösung auf eine 5 ml Spritze Fall einer 27-Gauge-Nadel verbunden ist, daß auf den Kopf in einem konischen 15 ml-Röhrchen gegeben. Schließen Sie den Kolben in die Spritze, und übergeben Sie den Parasiten Lösung in den konischen Rohr.
- Zentrifugenröhrchen 10 Minuten bei 300 x g. Den Überstand aspirieren dann das Pellet in 4-6 ml sterilem USP-Qualität 1x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4 (Stammlösung).
- Legen Sie eine Hämozytometer mit 10 ul Stammlösung, warten Sie 5-10 Minuten für die Parasiten, um dann in den vier Ecken und in der Mitte Quadrate der mittleren großen Platz nieder zählen die Anzahl der Parasiten.
- Verdünnen paraStandorte geeignete Inokulumgrße von 100K / 200 ul 1x PBS injizieren Mäusen intraperitoneal (ip) mit einem Gesamtvolumen von 200 ul.
HINWEIS: Für dieses Verfahren wurden die Mäuse mit 100 K Type III (CEP) 13 Tachyzoiten in 200 ul 1x PBS inokuliert. Wenn Infizieren von Mäusen mit anderen Stämmen von Toxoplasma, muss Konzentration des Inokulums eingestellt werden, um für die Virulenz ausmachen.
2. Perfusion und Neuro Harvesting
Hinweis: Dieses Protokoll wurde 21 Tage nach der Infektion (dpi) durchgeführt, da dies den Zeitpunkt, zu dem Peaknummern der Zysten im Gehirn von Mäusen festgestellt, aber auch andere Zeitpunkte verwendet werden. Größe, Anzahl, Lage und Vorhandensein oder Fehlen von Zysten, hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich Mausstamm, Parasitenstamm Typ sowie Inokulumgröße 7,14 - 17. Die Ermittler müssen individuell die geeignete Inokulum für die Maus und Toxoplasma Dehnungs er / sie verwendet.
- Setup alle chirurgischen Erntewerkzeuge (Abbildung 1).
- Für jede Maus, vorzubereiten und zu halten auf dem Eis: 20 ml Spritze mit 0,9% Natriumchlorid (NaCl) gefüllt + 10 U / ml Heparin in 1x sterile USP-Qualität PBS (Heparin / Kochsalzlösung); 20 ml-Spritze mit 4% Paraformaldehyd (PFA) gefüllt ist; Szintillationsfläschchen mit 15 ml 4% PFA. Für mehrere Mäuse, bereiten Sie einen Becher mit der gesamten Menge von jedem für alle Mäuse benötigt dann erstellt eine frische Spritze voller Lösung für jede Perfusion-Lösung gefüllt.
- Anesthetize die Maus ip mit 200 & mgr; l / 25 g Körpergewicht Ketamin / Xylazin-Cocktail (24 mg / ml und 4,8 mg / ml) am Tag von Interesse. Überwachen Sie die Maus für die Narkosetiefe, indem Sie Zehe Prise Reflex. Fahren Sie mit dem Protokoll nur einmal die Maus zeigt keine Reaktion auf eine feste Zehe Prise.
HINWEIS: Weitere Methoden der Anästhesie verwendet werden, solange die angemessene Höhe der Anästhesie vor ErreichenUm mit dem Protokoll. - Platzieren Sie die Maus in Rückenlage auf der überdachten Schaum Plattform. Pin alle vier Gliedmaßen bei den Füßen, dann sprühen die Brust und Bauch mit 70% Ethanol (EtOH) (Abbildung 2A). Zusatz von mehreren sterilen Papierhandtüchern unter der Maus kann verwendet werden, um Überlauf zu absorbieren Perfusion Flüssigkeiten.
- Fahrstuhl Haut direkt unter dem Brustbein mit einer Pinzette dann mit einer Schere, um einen Schnitt zu machen. Ziehen Sie die Haut wieder auf die Brust (2B) aus.
- Heben Xiphoidbasis und eine Bauchschnitt gerade unterhalb der Membran, indem die Leber, die stumpf von der Membran weg seziert wird. Make zwei Einschnitte, eine auf der linken und auf der rechten Seite durch die Membran und dem Boden der Rippen. Erweitern Sie die linke und rechte Einschnitte etwa 1 / 2-2 / 3-Weg den Brustkorb, die dann zurückreflektiert, um den Brustkorb (2C) zu öffnen.
HINWEIS: Darauf achten, dass keine Organe geschnitten oder großen Blutgefäße duRing dieses Verfahren, da andernfalls die Qualität der Durchblutung beeinträchtigen. - Perfuse transkardial mit 10-20 ml Heparin / Kochsalzlösung, gefolgt von 10 bis 20 ml 4% PFA.
HINWEIS: Wenn die Durchblutung richtig gemacht wird, wird die Leber aus rot werden zu tan (2D). Wenn nicht richtig gemacht, wird die Blutgefäße sichtbar (Abbildung 2E) sein. - Drehen Sie die Maus über auf seinem Bauch, wieder Stift Füße sprühen dann Kopf und Hals mit 70% EtOH. Heben Sie die Haut von der Basis des Halses und einen Einschnitt. Entfernen Sie die Haut am Schädel (2F) aus. Enthaupten Kopf auf Höhe der Schultern. Entfernen Sie den Schädel, entfernen Sie vorsichtig das Gehirn, und legen Sie sie in eine Szintillationsfläschchen mit 4% PFA (2G-H) gefüllt.
HINWEIS: Wenn gut durchblutet, wird das Gehirn weiß ohne sichtbare Blutgefäße (2I) angezeigt. Wenn das Gehirn nicht gut durchblutet, werden Blutgefäße sichtbar (2J) sein. - Stellen Sie das Scintillation Fläschchen mit Gehirn in 4% PFA bei 4 ° C über Nacht, vor Licht bedeckt. Spülen Sie das Gehirn in nicht-USP-Qualität 1x PBS und Transfer zu einem neuen Szintillationsfläschchen mit gekühltem 1x PBS gefüllt. Lagern Sie das Gehirn in 1x PBS bei 4 ° C, licht bedeckt.
HINWEIS: Erfolgreiche Clearing und Bildgebung mit Abschnitten in 1x PBS für bis zu einen Monat gelagert erreicht worden, aber es ist am besten, Abschnitt das Gehirn innerhalb von wenigen Tagen nach längerer Lagerung in PBS wird die PFA Fixierung rückgängig zu machen und könnte zu suboptimalen Bildern führen . Autofluoreszenz und erhöhter Unschärfe haben in einigen Bereichen nach einer Lagerung von einem Monat oder länger abgebildet in 1x PBS festgestellt worden.
3. Hirn Schnitte
- Entfernen Sie das Gehirn vor 1x PBS und legen Sie sie in eine Gehirnmatrix (3A), um eine präzisere ermöglichen und schneidet auch durch das Gehirn. Schneiden Sie die Kleinhirn und Riechkolben, falls vorhanden, und schneiden Sie dann das Gehirn koronal in 2 oder 3 Teile.
- Befestigen Sie jede Hirnschnitt auf eine Probe Montageblock mit Sekundenkleber. Anbringung eines kleinen Block von 5% Agarosegel hinter Gehirn Abschnitt zum Träger (3B).
HINWEIS: Andere Unterstützungsmechanismen verwendet werden, aber ohne Unterstützung kann der Vibratom auf das Gehirn verursacht ungleichmäßige Schnitte zu schieben. - Geschnitten Gewebe in 160 & mgr; m (Arbeitsabstand des für die Bildgebung verwendeten Objektivs) dicke Abschnitte mit dem Vibratom auf eine Geschwindigkeit von 4 und Amplitude von 9 eingestellt.
HINWEIS: Die Einstellungen für die Geschwindigkeit und Amplitude in Abhängigkeit von der jeweiligen Maschine angepasst werden, wobei, um auch erhalten, glatten Abschnitten eingesetzt. Wenn die Einstellungennicht korrekt ist, kann das Ergebnis Unebenheiten, Reißen von Gewebe oder Rattermarken können. - Sammeln Gewebeschnitte in eine Szintillationsfläschchen gefüllt mit frischen, gekühlten 1x PBS, wenn sie gehen, um innerhalb einer Woche gelöscht. Sofern Teile werden nicht innerhalb einer Woche gelöscht werden, statt Abschnitte in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit Kryokonservierungslösung und bei -20 ° C gefüllt.
4. Optische Clearing von Hirngewebe
Hinweis: Dieses Protokoll wurde von einem zuvor veröffentlichten Verfahrens 8 modifiziert.
- Bereiten Sie 25%, 50%, 75% und 90% v / v Glycerol in 1x PBS + 2% Tween-20 (Gl / PBST).
- Abschnitte entfernen 1x PBS oder, falls in Kryokonservierungsmittel gründlich in 1x PBS und Transfer in ein Szintillationsfläschchen mit 10 ml 25% Gl / PBST. Ort Fläschchen auf einem Schüttler bei 4 ° C, bedeckt von der Exposition gegenüber Licht, 12 h lang.
- Bestätigen Sie, dass alle Abschnitte mit dem bo versenktttom des Fläschchens. Saugen Sie das 25% Gl / PBST, lassen Sie nur genug zur Deckung der Abschnitte dann füllen Sie das Fläschchen mit 10 ml 50% Gl / PBST und auf einem Schüttler bei 4 ° C, vor Licht bedeckt, 12 h. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die 75% Gl / PBST dann die 90% Gl / PBST. Lassen Abschnitte in der 90% Gl / PBST für 24 Stunden, um eine maximale Lichtung erreichen. Im Laufe des Clearing-Prozesses, beobachten schrittweise optische Clearing (Abbildung 4).
HINWEIS: Dieser Vorgang kann beschleunigt, wenn Lösungen verändert unmittelbar nach Sektionen wurden dem Boden des Fläschchens versenkt werden. In 75% & 90% ige Lösungen, werden Abschnitte nicht sinken ganzen Weg zum Boden der Ampulle wird aber in der Mitte schweben.
5. Montage Hirngewebeschnitten
- Schneiden Sie ein 1,5 Nr Deckglas in 5 Stück, einen Abstandhalter zu schaffen. Verwenden Sie einen Bleistift Lineal und Diamant entlang der in 5A gezeigten gestrichelten Linien ein Tor und brechen das Deckglas. Verwerfen ter Herzstück, ordnen Sie die 4 äußeren Stücke auf einem einfachen Glasobjektträger, um ein Fenster zu erstellen, und dann mit der Bürste klaren Nagellack auf den Nähten, um die Stücke des Abstandhalters mit dem Schieber in der richtigen Konfiguration (5B) zu halten.
HINWEIS: Das Distanzstück wird verwendet, um den notwendigen Raum zwischen dem Schieber und dem Deckglas für die Montage der Sektionen zu erstellen gelöscht werden. Das Deckglas kann in unterschiedlicher Weise auf eine beliebige Größe Fenster erforderlich erstellen geschnitten werden. Vorgeschnittene Schaumabstandhalter sind auch im Handel erhältlich. Damit Nagellack vollständig trocknen, ist es am besten, um Objektträger mit Abstandshalter mindestens einen Tag vor der Befestigungsabschnitte zu machen. - Übertragungsabschnitten zu einer Folie mit einer Kunststofftransferpipette mit der Spitze abgeschnitten. Achten Sie darauf, in der Umgebung mit 90% Gl / PBST zu füllen. Vorsichtig absenken ein Deckglas über die Abschnitte um sicherzustellen, dass keine Luftblasen einzuführen. Überschüssiges Gl / PBST kann weg mit einem fusselfreien Wisch böse werden.
- Bild GFP + Neuronen RFP enthält +
HINWEIS: Alternativ Dichtung gleitet vollständig um alle Kanten zu speichern und zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet. Die Verwendung von klaren Nagellack zu versiegeln slide ist optional und kann es schwieriger machen, um Deckglas zu entfernen wenn man die Abschnitte von der Folie zu einem späteren Zeitpunkt für die weitere Verarbeitung zu entfernen.
6. Imaging
HINWEIS: Jede Mikroskop verwendet werden, die die Fähigkeit zur Gewinnung hochauflösende z-Stapel hat.
- Nachdem zunächst der Suche nach der Brennebene bei 10X, 20X zu einem Ziel zu ändern und Scan durch den Abschnitt, um eine Zyste in einem GFP + Zellen befindet identifizieren. Zentrieren Sie die Region of Interest (ROI) in das Blickfeld.
- Wechseln Sie zu einem 40X-Objektiv. Konzentrieren Sie sich auf und ab durch den gesamten ROI um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle und cyst sind sichtbar.
HINWEIS: Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Oil DIC M27 Ziel erreicht. - Mit der installierten Bildbearbeitungssoftware, erhalten eine Z-Stapel, der die gesamte Zelle mit Zyste enthält. Durchschnittliche Einstellungen verwendet, um Bilder zu erhalten, sind in 6 gezeigt.
HINWEIS: Die Einstellungen müssen in Abhängigkeit von jeder Ermittler Gewebeschnitten und Mikroskopfunktionen angepasst werden. - Besorgen Sie sich eine maximale Projektionsbild des Z-Stapel, indem Sie die Anzahl der Vorsprünge auf 1. Besorgen Sie sich eine vollständige Dreh Ansicht, indem Sie die Anzahl der Vorsprünge 64.
Hinweis: andere Software-Pakete stehen zur Verfügung und kann verwendet werden, um eine maximale Projektion zu erhalten, Dreh sowie andere Blick auf Z-Stapel-Bildern. - Analysieren Bildes mit Bildanalyse-Software.
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Representative Results
Figur 7 enthält repräsentative Bilder von zwei Zyste haltigen GFP + Neuronen aus zwei verschiedenen 160 & mgr; m dicke Abschnitte sowie eine repräsentative Messung der Entfernung von Zysten-zu-Zell-Körper 7B dar. Die Figuren 7A und B zeigen, daß diese neue Protokoll ermöglicht die Visualisierung der infizierten Neuronen in seiner Gesamtheit. 7C zeigt, daß mit dieser Abbildungstechnik, ist es nun möglich, den Abstand zwischen der Zyste und dem Zellenkörper (Imaris 7.7) zu quantifizieren. 7D ist ein Volldrehansicht der Fig 7B. Visualisierung des Z-Stapel auf diese Weise ermöglicht die Prüfung des gesamten Abscheidung der Zelle und Zysten. 7E ist eine 3D-Rotations Film zeigt, wie das Bild aus 7D durch Imaris 7.7 Software analysiert, um den Abstand von der Zyste zu messen der Zellkörper entweder von Mitte-zu-Mitte or Kante zu Kante. Obwohl die gezeigten Mess wurde mit einer geraden Linie zwischen der Zyste und dem Zellkörper, einer Messung nach der eigentlichen GFP + Prozess zum Zellkörper getan können auch erzeugt werden (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 1: OP-Ausrüstung für die Beseitigung von Maushirn. (A) saugfähige Unterlage. (B) Schaumstoffblock. (C) Nadeln in Fuß fassen. (D) 25 G Blutentnahme-Set. (D) 3-Wege-Hahn. (F) 20 ml Spritze für Heparin / Kochsalzlösung. ( G) 20 ml Spritze für 4% PFA. (H) Thumb Pinzette. (I) Feinschere, abgewinkelt zu Seite, scharf scharf. (J) Sharp-scharfen Schere. (K) Kelly Hämostatika. (L) Mayo Schere. (M) (N) Szintillationsfläschchen 4% PFA. Balken = 8 cm.
Abbildung 2: Ernten Maushirn. (A) Maus festgenagelt und Brust mit 70% EtOH gesprüht. (B) ausgesetzt Brust. (C) Brusthöhle geöffnet. (D) Liver nach dem richtigen Durchblutung. (E) Leber nach unsachgemäße Durchblutung. (F) ausgesetzt Schädel. ( G) mit einem halben Gehirn Schädel entfernt. (H) Geerntet Gehirn in einem Fläschchen mit 4% PFA. (I) nach entsprechender Hirndurchblutung gefüllt. (J) Gehirn nach unsachgemäße Durchblutung.
Abbildung 3: Schnitte Maushirn. (A) Maus Gehirn matri x. (B) Maus Gehirn und Agarose-Gel, um Montageblock mit Sekunden innerhalb Vibratom Kammer mit gekühlten 1x PBS gefüllt angebracht.
Abbildung 4: Löschen von Prozessbeauftragten Bilder eines Mäusegehirns Abschnitt bei jedem Schritt des Clearing-Prozesses..
Abbildung 5: Schneiden und Befestigung Distanz zu gleiten. A Nr. 1.5 Deckglas mit repräsentativen Markierungen zum Schneiden Deckglas in 5 Teile. B. Plain Glasobjektträger mit jedem Stück von geschnittenen Deck geheftet in Stelle mit klarem Nagellack, um ein Fenster zu erstellen.
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Abbildung 6: Screenshot zur Bildaufnahme verwendet allgemeine Parameter.
Abb. 7: Toxoplasma gondii Zysten können im fernen neuronale Prozesse aufhalten (AB) Maximale Projektionsbilder von GFP + Neuronen RFP + Zysten (weiße Pfeile) enthalten. Balken = 20 um. (CE) bieten zusätzliche Visualisierung und Analyse der in B gezeigt Zyste-Neuron-Beziehung. (C) Imaris generierte direkte Inline-Messung von Abstand vom Rand der Zyste an den Rand des Zellkörpers (149μm ). (D) 3-D Dreh Film . (E) Imaris generiertenwww.jove.com/files/ftp_upload/52237/Animated-Video Abbildung 7E.avi "target =" _ blank "> 3-D-Film, die Zyste-Zell-Körpervermessung sowohl von Mitte-zu-Mitte (163 um) und Kante zu Kante (149 um).
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Discussion
Da die zellulären Veränderungen in infizierten Wirtszellen haben, um Krankheitsverläufe bei Infektionen mit anderen intrazellulären Organismen wie HIV, Tollwut und Chlamydia 18,19 in Verbindung gebracht worden, eine Technik, die es uns ermöglichen, die intimen Interaktionen, die zwischen dem ZNS auftreten Studie entwickelten wir Wirtszelle und Toxoplasma. Das hier beschriebene Verfahren erreicht dieses Ziel durch eine effiziente Abbildung von chronisch infizierten Neuronen. Vor der Entwicklung dieses Verfahrens, wie Abbildungs war zeitraubend, kostspielig oder gar nicht möglich.
Jetzt können wir diese Technik, um grundlegende Fragen der Toxoplasma -neuron Interaktion, wie sie spezifische neuronale Gebiete durch den Parasiten gezielt beantworten? Bedeutet dies unterscheiden zwischen Toxoplasma Stämme? Haben die zellulare Bereiche, in denen die Zyste befindet sich von dem Rest der Zelle (dh nicht infizierten und nicht infizierten Dendriten aus demselben Neuron haben die gleiche Anzahl von Stacheln)? Was sind die zellulären Eigenschaften von infizierten Nervenzellen geteilt? Die Fähigkeit, solche Fragen zu beantworten ist wichtig, zu verstehen, wie Toxoplasma-Infektion ändert das ZNS, einschließlich auf der Ebene des Verhaltens.
Um die besten Bilder möglich zu erhalten, ist es sehr wichtig, um sicherzustellen, dass das Gewebe in noch Abschnitte geschnitten. Wenn die Abschnitte uneben sind, das Deckglas nicht richtig auf dem Abschnitt, die zu ungleichmäßigen Kontakt mit dem Ziel, was zu suboptimalen Abbildungs sitzen. Bei der Optimierung des Protokolls wurden verschiedene Modifikationen vorgenommen. Die ursprüngliche Clearing-Prozess wurde mit Fructose in einem Versuch, in einer Technik, die als SeeDB 20 bekannt gezeigten Ergebnisse zu reproduzieren getan. Diese Methode war mit diesem Modell nicht vereinbar, da sie abgeschreckt die RFP (insbesondere mCherry). Ein weiterer wichtiger Schritt, und wahrscheinlich der wichtigste von allen ist, so dass für maximale Clearing von Gewebeschnitten. Wenn nicht richtig gelöscht, werden Hintergrundlichtbeugung höher sein undBilder werden laut. Wir fanden, dass die Zugabe von Tween-20 zu dem Glycerin wurde eine leicht klareres Bild von Glycerin allein. Die derzeitige Technologie ermöglicht es uns, Z-Stapel-Bildern über 160 um dicken Hirngewebe zu erhalten, aber in der Zukunft werden wir uns auf diese Dicke auf 500 um oder mehr zu erhöhen, um für noch mehr eingehende Analyse zu ermöglichen.
Es ist nur, indem man die gesamte Zelle und ihrer Verbindungen, die wir beginnen, eine mechanistische Vorstellung davon, wie das Gehirn wird weltweit von Toxoplasma betroffen zu entwickeln. Dieses neue Protokoll bietet die Möglichkeit, die Toxoplasma -neuron Interaktion auf Einzelzellebene zu lernen und so in eine schnelle, wirtschaftliche Weise. Wir haben noch nicht alle Einsatzmöglichkeiten für dieses Protokoll zu erforschen und wie sie auf andere Systeme zu übersetzen, aber wir erwarten, wird es mehrere Anwendungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken dem gesamten Koshy für die Diskussionen. Wir danken Patty Jansma und die University of Arizona Neuroscience Institut für Beratung und Hilfe bei der Bildgebung. Wir danken auch den Porreca Labor für die Nutzung ihrer Vibratom. Diese Forschung wurde von der US National Institutes of Health (NIH NS065116, AAK) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100 mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20 mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1x Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10x, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20 ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10 ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible - used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25 G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
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Neurobiologie Neurowissenschaft konfokale Mikroskopie Maus Gehirn Clearing Fluoreszierende Proteine,Erratum
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 09/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
