Abstract
Candida albicans biofilm udvikling på biotiske og / eller abiotiske overflader udgør en specifik trussel for indlagte patienter. Hidtil C. albicans biofilm er overvejende blevet undersøgt in vitro, men der er et afgørende behov for en bedre forståelse af denne dynamiske proces under in vivo betingelser. Vi udviklede en in vivo subkutan rottemodel at studere C. albicans biofilm formation. I vores model, flere (op til 9) Candida -inficerede indretninger implanteres til den bageste del af dyret. Det giver os en stor fordel i forhold til centralt venekateter model system, da det giver os mulighed for at studere flere uafhængige biofilm i et dyr. For nylig har vi tilpasset denne model til at studere C. albicans biofilm udvikling i BALB / c-mus. I denne model modne C. albicans biofilm udvikle sig inden 48 timer og demonstrere den typiske tredimensionale biofilm arkitektur. Kvantificeringen af fungal biofilmer traditionelt analyseret post mortem og kræver vært offer. Da dette kræver brug af mange dyr til at udføre kinetiske undersøgelser, ansøgte vi non-invasiv bioluminescens imaging (BLI) til længderetningen opfølgning in vivo modne C. albicans biofilm udvikling i vores subkutan model. C. albicans celler blev manipuleret til at udtrykke Gaussia princeps luciferase genet (gluc) fastgjort til cellevæggen. Den bioluminescens frembringes ved luciferase, der konverterer den tilsatte substrat coelenterazin i lys, der kan måles. Den BLI signal lignede celletal opnået fra eksplanterede katetre. Ikke-invasiv billeddannelse til kvantificering in vivo biofilmdannelse giver umiddelbare applikationer til screening og validering af svampemidler under in vivo betingelser, og for undersøgelser baseret på vært-patogen interaktioner, herved bidrage til en bedre forståelseing af patogenesen af kateter infektioner.
Introduction
Candida albicans er en kommensal organisme, som kan findes på forskellige steder i raske individer, for eksempel på huden eller som en del af mave og vaginale flora. Men i indlagt, og især immunkompromitterede patienter, kan det forårsage en lang række infektioner 1. I sådanne personer, den svækket immunsystem gør Candida celler til at formidle ind i blodbanen og at invadere dybere væv forårsager livstruende infektioner. Desuden er tilstedeværelsen af abiotiske substrater, såsom centrale venøse og urinkatetre, kunstige hjerteklapper og led kan give en niche for Candida bilag 2. Adhæsion til sådanne substrater er en forudsætning for yderligere udvikling biofilm, som udgør et lag af gær og svampetrådenes celler indlejret i ekstracellulær polymermateriale, hovedsageligt bestående af polysaccharider 2. C. albicans kateter -associerede infektionerer forbundet med høj dødelighed. En generel karakteristik af biofilm er deres nedsat følsomhed over for kendte lægemidler, såsom azoler 3,4. Kun nyere klasser af antifungale lægemidler, såsom echinocandiner og liposomal formulering af amphotericin B vist sig at være aktive mod kateter infektioner 5-7. På grund af biofilm modstandsdygtighed over for svampemidler, er terapeutiske metoder meget begrænsede, hvilket ofte fører til kateter fjernelse og efterfølgende erstatning som eneste løsning.
De fleste af vores nuværende forståelse af C. albicans biofilm udvikling stammer fra in vitro undersøgelser af abiotiske substrater såsom polystyren, eller plast, der anvendes til fremstilling af ovennævnte enheder, dvs, silikone, polyurethan 2. Disse modeller er ganske avanceret og forsøge at efterligne situationen in vivo så tæt som muligt. Men disse systemer ikke involverer kontinuerlig blodgennemstrømning og than immunsystem værten. Dette resulterede i udviklingen af in vivo-model, såsom den centrale venekateter (CVC) model 8-10 protesen stomatitis model af oral candidiasis 11 og en murin model for kateter-associeret candiduria 12. Derudover C. albicans biofilm udvikling blev undersøgt in vivo på slimhindeoverflader, såsom dem fra skeden 13 og mundhulen 14. Vores laboratorium bidrog med etableringen af en subkutan C. albicans biofilm model, der er baseret på implantatet af inficerede kateter stykker på bagsiden af Sprague Dawley-rotter 15. Denne model blev med held anvendt i vores laboratorium for at teste biofilm modtagelighed for fluconazol og Echinocandin lægemidler 5,16, for at studere virkningen af kombinatorisk terapi af diclofenac og caspofungin 17. Mere for nylig, vi tilpasset dette system til brug i BALB / c-mus 18,19. Isammenligning med andre in vivo-modeller, den vigtigste fordel ved denne subkutan model er muligheden for at studere flere biofilm per dyr udviklet inde i lumen af implanterede kateter stykker.
For at reducere antallet af forsøgsdyr, har vi tilpasset denne model til at studere udviklingen af C. albicans biofilm ikke-invasivt ved hjælp af bioluminescens imaging (BLI) 18,19. Denne metode viste sig at være en kraftfuld teknik, som kan anvendes til at kvantificere biofilm ved at måle den specifikke BLI signal på regionen af interesse (i vores tilfælde området implanterede katetre), undgå dyr offer. I sammenligning med bakterier, som kan udtrykke både genet og substratet kræves til bioluminescensreaktion som følge af indførelsen af en specifik lux operon 20 fleste af de eukaryote organismer, herunder C. albicans, er afhængige af den heterologe ekspression af et luciferasegen kombineret medekstern administration af et specifikt substrat, såsom D-luciferin eller coelenterazin 21. Sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af svampens cellevæg og C. albicans morfogenese, intracellulære levering af substratet for luciferaseenzymet var en vigtig udfordring 21. For at løse dette problem, Enjalbert et al. 22 manipuleret en stamme, hvor en syntetisk C. albicans codon-optimeret version af genet for den naturligt secerneret Gaussia princeps luciferase (gluc) blev fusioneret til den C albicans PGA59 gen, et GPI- forankret cellevæg protein. På grund af tilstedeværelsen af luciferase på cellevæggen, kan problemer med intracellulære tilgængelighed af substratet undgås. Dette særlige system blev anvendt til at undersøge overfladiske infektioner forårsaget af C. albicans 22. For ganske nylig blev BLI også bruges til at følge udviklingen af trøske og dens possible behandling 23. Sådanne fund støtter brugen af BLI som en lovende teknik til at studere infektioner forårsaget af fritlevende celler, men også enhed infektioner.
I denne undersøgelse, beskriver vi C. albicans biofilm udvikling på polyurethan kateter stykker i BALB / c-mus og dens kvantificering ved hjælp BLI. Vi giver en detaljeret protokol af in vitro kolonisering af polyurethan katetre løbet af adhæsion efterfulgt af implantation i mus og efterfølgende biofilm udvikling i levende dyr. Bortset fra at måle BLI udsendt med C. albicans celler, vi også bestemme kolonidannende enheder til sammenligning med standard teknik til biofilm svampe belastning kvantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev godkendt af den etiske komité i KU Leuven (projekt nummer 090/2013). Vedligehold dyr i overensstemmelse med de retningslinjer dyr pleje de KU Leuven.
1. C. albicans Vækst
- Fireogtyve timer før indledningen af dyreforsøg, forberede YPD-plader ved tilsætning af 10 g gærekstrakt granuleret, 20 g bakteriologisk pepton og 15 g granuleret agar. Fyldes op volumen til 900 ml med Milli-Q vand og autoklave.
- 50 ml steril 40% glucose. Bland grundigt og hæld i petriskåle. Lad agarplader at afkøle og størkne.
BEMÆRK: I denne undersøgelse bruge to stammer, nemlig vildtype C. albicans SC5314 - gluc negativ stamme (kaldet WT) og C. albicans SKCA23 stamme, som er en vildtype C. albicans SC5314 transformeret med Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 .I denne stamme (opkaldt SKCA23- ACTgLuc) gluc blev fusioneret til det endogene PGA59 genet under kontrol af AKT1 (actin) promoter (denne promotor er aktiv i gær, samt hyfe fase af svampevækst). Denne stamme kan rekvireres fra laboratoriet af professor Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgien. Plasmid Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmid 22 er venligst doneret af Prof. C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, Frankrig. - Bevar begge stammer i glycerolstamopløsning og opbevares ved -80 ° C.
- Forud for enhver eksperiment streak stammer på en YPD plade. Inkubér pladen ved 37 ° C natten over.
2. Kateter Pieces Forberedelse
- Før forsøget bestemme, hvor mange katetre er nødvendige. Det er muligt at implantere op til 6 kateter stykker per mus (3 katetre til venstre og 3 kateter på højre side af dyret (figur 2A).
- Fireogtyve timer før dyret kirurgi åbne pakkenalder indeholdende triple-lumen kateter under biologisk sikkerhedsskab. Fjern alle unødvendige dele med sterile pincetter og skære del fastgjort til kateteret med en steril skalpel. Placer lineal under plastikken pakke og skære polyurethan kateter stykker af præcis 1 cm i henhold til skalaen på linealen (Figur 1).
BEMÆRK: Det er vigtigt at nævne, at denne type kateter stykke er ikke fosforescerende og derfor velegnet til BLI 18,19. - Placer maksimalt 15 skåret kateter stykker (trin. 2.2) i 2 ml mikrocentrifugerør. Altid forberede 3 stykker ekstra, som bruges til at optælle mængden af vedhæftede Candida celler på enheden efter den periode af friktion.
- Supplement katetre med 1,8 ml 100% føtalt bovint serum (FBS).
- Vortexes kraftigt og tilføje yderligere 100-200 ml 100% FBS. Helt dækker alle kateter stykker med serum.
- Der inkuberes ved 37 ° C natten over.
3. Dyr og Undertrykkelse af immunsystemet
- Hold BALB / c-mus (ca. 8 uger) i individuelt ventilerede filtertoppen bure med fri adgang til standard mad og vand ad libitum.
- Påbegynd undertrykkelse af immunsystemet 24 timer før Dyrekirurgien ved tilsætning dexamethason (0,4 mg / L) til drikkevand af dyr. For at undgå enhver bakteriel kontaminering af værten, supplere drikkevand med antibiotika, f.eks ampicillin natrium pulver (0,5 g / L).
- Hold immunosuppression af dyr under hele forsøget (op til 6 dage).
4. Ex vivo C. albicans vedhæftning på FBS-overtrukne Polyurethan Substrater
- Overfør hver serum-overtrukne kateter stykke i et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Skrab nogle C. albicans celler dyrket på YPD-plader (trin 1) og suspendere dem i 1 ml PBS.
- Fortynd CanDida celler (1: 100) i et separat mikrocentrifugerør. Tag 10 pi af den fortyndede prøve og anvende den på en celle tællekammer. Tæl mindst 16 små firkanter.
- Forbered Candida celler (hver stamme separat) i RPMI 1640 medium til en slutkoncentration på 5 x 10 4 celler / ml.
- Tilsæt 1 ml cellesuspension til hver serum-overtrukne kateter stykke.
- Vortexes kraftigt og sikre, at katetrene er nedsænket i mediet og ikke flyder ovenpå.
- Inkuber katetre ved 37 ° C i 90 minutter (periode med adhæsion).
- Fjern katetre med sterile pincetter og vaske dem to gange med 1 ml PBS. Under dette trin sørge for, at vaskefluiden går gennem hulrummet ved at holde kateteret i lodret position, mens meget forsigtigt skylle katetrene. Vigtigere er det, skal du ikke bruge en stærk strøm, som kan føre til fjernelse af vedhæftede celler.
- Overfør hver vasket kateter til et rent mikrocentrifugerør (ét stykke pr tuvære).
- Sted på is og holde der indtil kirurgi.
5. Anæstesi
- Forbered anæstesi ved at blande 75 pi af ketamin (100 mg / ml) med 100 pi medetomidin (1 mg / ml) og 825 pi sterilt saltvand. Indgives intraperitonealt (ip) 60-80 pi bedøvelsesmiddel cocktail pr 10 g legemsvægt, hvilket resulterer i en dosis på 45-60 mg / kg ketamin og 0,6-0,8 mg / kg medetomidin.
- For tilbageførsel af anæstesi, fortyndes 50 pi atipamezol (5 mg / ml) i 4,95 ml saltvand, administrere ip 100 pi per 10 g legemsvægt som modgift, hvilket resulterer i en dosis på 0,5 mg / kg.
- Efter injektion af anæstesi, sende dyret i en separat bur og vente, indtil det er helt i søvn.
- Bekræft korrekt bedøvelse af dyret med lys hud pinch og tå knibe, som ikke forårsage nogen skade på huden. Alle observerede bevægelse indikerer, at dyret ikke er tilstrækkelig bedøvet til at udføre kirurgi. Hvis dette sker, skal du vente et couple minutter længere, indtil dyret ikke viser nogen tegn på bevægelse upon hud eller tå knivspids.
6. Animal Surgery
- Overførsel bedøvede dyr fra buret på en ren væv placeret på varmepude, præ-opvarmet til 37 ° C (figur 2A) (1).
BEMÆRK: Et billigere alternativ er at bruge elektrisk opvarmede tæpper. Det er også muligt at anvende isothermiske puder, som skal varmes op i mikrobølgeovn inden dyret kirurgi. - Anvend oftalmologiske salve på øjnene.
- Barber lænden af dyret med en elektrisk barbermaskine. Fjern alle dyrehår og overføre dyr på en ren væv. Desinficere huden (f.eks, med 1% jod isopropanol eller 0,5% klorhexidin i 70% alkohol) og efterlade den desinficerede område tørre i ca. 1 min (figur 2A, (2)).
- Lav et lille snit i huden (en til venstre og en på højre side af dyret) (ca. 0,5 &# 8211; 1 cm) (figur 2A, (3)).
- Dissekere underhuden med en saks for at oprette to subkutane tunneler. Hver tunnel skal være ca. 1,5 cm lang og 1 cm bred.
- Sæt tre kateter stykker, der har været inficeret med Candida, i hver enkelt tunnel. Sørg for at katetrene ligger ved siden af hinanden i en vandret arrangement, og at de ikke dækker hinanden for at muliggøre implantation af seks kateter fragmenter i alt (Figur 2A (4)).
- Luk indsnit med suturer. Alternativt kan du bruge Dermabond at lukke såret.
- Desinficer såret meget forsigtigt med 0,5% klorhexidin i 70% alkohol eller med jod isopropanol (1%).
- Påfør lokalbedøvelse (xylocain gel, 2%) direkte på såret.
- Administrer tilbageførsel af anæstesi (protokol 5, trin 2): intraperitonealt 100 pi per 10 g kropsvægt.
- Transfer dyr til et rent bur tidligere placeret på en varmeplade. Hold dyretseparat og varm, indtil dyret er helt vågen. I mellemtiden fortsætter med driften og implantatet af den næste dyr. Når alle opererede dyr er helt vågen. Overførsel til et bur. Overvåg dyr regelmæssigt.
7. Bioluminescens Imaging: Fremstilling af Coelenterazin (CTZ), den substrat for G. Princeps luciferase
- Forbered frisk coelenterazin (CTZ) stamopløsning ved at opløse 5 mg / ml CTZ i syrnet ethanol eller ifølge producentens anvisninger.
- Forbered 1,2 mM arbejdsopløsning ved at fortynde stamopløsningen 1:10 i steril PBS.
BEMÆRK: Der indsprøjtes 100 ul CTZ arbejdsopløsninger subkutant i området omkring katetre. Udnytte insulin sprøjter til subkutan injektion af CTZ. - Hold altid CTZ i mørke (f.eks dække mikrocentrifugerør indeholdende CTZ med alufolie). Opbevar stamopløsning ved -80 ° C for varigheden af eksperimenterne. 8. Bioluminescens Imaging
- Initialiser BLI kamera.
- Bedøve dyr under anvendelse af en induktion kassen. Brug en gasblanding af isofluran i oxygen, N 2 O / O 2 eller luft på 2-3%.
- Efter induktion opretholde anæstesi i induktion kassen og i afbildningskammeret på 1,5-2%.
- Før du starter imaging session, skal du placere imaging plade i position A, hvilket svarer til en FOV på 10 cm. Sørg for, at den rigtige position af anæstesi forretninger og dyr ved at placere en sovende dyr i kassen.
- Tag nogle fotografier, indtil dyret er i den ønskede billedbehandling beliggenhed, i det FOV lige under kameraet.
- Forbered to insulininjektionssprøjter hver indeholdende 100 pi af CTZ brugsopløsning.
- Anbring et dyr på bænken og holde det i søvn ved hjælp af en næse kegle leverer gas anæstesi.
- Bring nåle af sprøjterne på et sted omkring katetre subkutant og injicereDen CTZ samtidigt på toppen af katetre.
- Umiddelbart efter injektion, sende dyret på den varme plade i kameraet boksen og starte den bioluminescence billedet.
- Anskaf scanninger i træk med indfangningstider fra 20 til 60 sek (afhængig af signalet intensitet), indtil den maksimale signal intensitet er nået. Under købet af den næste ramme, måle BLI signal intensiteten af de tidligere erhvervede rammer ved at placere et ROI over hver katetre trio og måle fotonflux gennem denne ROI.
- Gentag fra trin 7 til den næste dyr (s).
- Efter billeddannelse, returnere dyr til deres bur. Gentag BLI i løbet af et eksperiment for langsgående, ikke-invasiv opfølgning af biofilm-dannelse.
- Analyser BLI data ved hjælp af Living Billede software. Placer en rektangulær ROI af fast størrelse over hver kateter trio og måle fotonflux (udstråling) gennem hver ROI. Gentag dette for hvert dyr.
- RapportBLI signalintensiteten af hvert kateter trio som fotonflux per sekund. Repræsenterer BLI data på en logaritmisk skala ved at plotte middelværdien og SD af fotonflux per sekund for hver gruppe. Statistisk analyse af de log 10 transformerede data.
- Forbered mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml PBS, en for hver kateteranordning og holde dem på is.
- Aflive dyr ved cervikal dislokation (figur 2B (1)).
- Desinficere huden på ryggen med 0,5% chlorhexidin i 70% alkohol eller med iod isopropanol (1%).
- Lave et snit (ca. 3 cm) over katetrene.
- Skær subkutant væv og fjerne kateter fragmenter en efter en fra under det subkutane væv ved hjælp af sterile pincetter (figur 2B (2)).
- Håndtag kateter forsigtigt i lodret position og vaske det to gange med 1 ml sterilt PBS. Placer hver kateterstykke ind i et separat mikrocentrifugerør (fremstillet i trin 1).
- Soniker katetre tidligere anbragt i 1 ml PBS i 10 minutter ved 40.000 Hz i et vandbad-sonikator og placere dem på is.
- Efter lydbehandling, energisk vortex i 30 sek og sted igen på is.
- Forbered to yderligere mikrocentrifugerør indeholdende 900 pi PBS.
- Lav 01:10 og 1: 100 fortyndinger fra dit oprindelige prøve (den, der indeholder kateteret), og holde alle mikrocentrifugerør på is.
- Plate 100 pi af de oprindelige prøver, 1:10 og 1: 100 fortyndinger på YPD-agarplader i to eksemplarer.
- Pladerne inkuberes i 2 dage ved 37 ° C og tælle CFU'er.
- Kolonierne dyrket på YPD agarplader (tællelig mængde kolonier, maksimal 300 kolonier / plade) og multiplicerer dem med den rette Dilution faktor (1x-original, 10x eller 100x fortynding). Yderligere multipliceres hver kateter stykke ved 10x, hvilket svarer til det endelige beløb for kolonier i 1 ml rør indeholdende kateteret. Bring det endelige beløb for kolonier at logge 10 celler / kateter stykke med standardafvigelse (SD). Hurtig data som middel ± SD.
- Læg alle værdier for hver kateter og specifik gruppe i et regneark og / eller statistiske program, til at udføre de ovennævnte beregninger og statistiske analyser. Angiv specifikke grupper til at sammenligne, dvs. WT vs mutant eller 2 dage vs. 6 dage biofilm dannelse og udfører uparret t-test og ANOVA med Tukey post-test på log10-transformerede data.
- Udtryk signifikansniveau ved en p-værdi. I denne undersøgelse angiver signifikans, hvis p-værdi <0,05, repræsenteret således: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
9. Kateter Explant
10. Kvantificering af Biofilm-associerede celler af kolonidannende enheder Count (CFU) og statistiske analyser af resultater
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne undersøgelse viser vi den kirurgiske procedure kateter implantatet og eksplantation under in vivo C. albicans biofilm udvikling i en mus. Desuden viser vi kvantificering af modne biofilm ikke blot ved klassisk CFUer tælling, men også ved BLI.
Som vist i figur 1A, var ikke-selvlysende polyurethankateter stykker skæres i 1 cm-enheder og derefter overtrukket med serum. Dette trin er meget vigtigt, fordi det giver mulighed for Candida celler at knytte til underlaget hurtigere sammenlignet med ikke-serum coatede implantater 15. Det er vigtigt at nævne, at der forud for enhver C. albicans eksperiment vi første dokumenterede baggrunden luminescens af vores enheder 18. Dette trin er afgørende, før du udfører nogen BLI fordi høj morild af enheden vil forstyrre vurderingen af de specifikke bioluminiscerende signal og signal kinetik fra gLuc-udtrykkende celler. Dernæst C. albicans celler inkuberes med serum-belagte kateter stykker. Kateter fragmenter implanteres derefter på den bageste del af dyret efter subkutan incision (figur 2A). I denne in vivo oprettet to indsnit udføres (én på den højre og en anden på den venstre side af ryggen af en mus), efterfulgt af dannelse af subkutane tunneler i hver indskæring (figur 2A (3)). Efterfølgende tre enheder, der tidligere er inficeret med Candida celler implanteres i hver operation (figur 2A (3 og 4)). Dette oprettet giver os mulighed for at studere op til seks biofilm per dyr. Det er bemærkelsesværdigt, at to drift sites giver en mulighed for at studere biofilmdannelse af to forskellige stammer af interesse, for eksempel vildtype og mutant i det samme dyr. Figur 2B viser såret indeholdende katetre forud for eksplantering og efterfølgende vasketrin.Biofilm udviklet i den bageste del af dyret blev vurderet for bioluminescens signal målinger. En af de repræsentative dyr, der udviser den bioluminescence signal sammen med rektangler kendetegner regionerne i interesse (ROIs) er vist i figur 3. Efter den sidste BLI tidspunkt, er katetre eksplanteret, sonikeret og derefter hvirvlet og yderligere vurderet til biofilm-dannende celler kvantificering af CFU'er. Dataanalyser demonstrere Log 10 CFU opnået fra hver kateter stykke efter biofilm udvikling og explantation er vist i figur 4A. Desuden blev CFU'er i forhold til BLI signalintensitet og disse data er vist i figur 4B. Halvfems minutter efter implantation et klart BLI frembringes af ACTgLuc udtrykkende biofilm mens der i vildtypestammen, næppe lys frembringes; Intensiteten af lyset detekteret fra ACTgLuc udtrykkendebiofilm er en betydelig forøgelse som biofilmen er dannet, her efter samme mus (figur 4C). Denne stigning i lyset følger samme tendens som stigningen i CFU pr biofilm (figur 4A). I vores forsøg observerede vi også, at en normal vildtypestamme (ikke manipuleret til at udtrykke luciferase) resulterer også i produktion af lys ved tilsætning af substrat. Imidlertid fotonflux var betydeligt lavere end den, der opnås for den konstruerede stamme.
Samlet set vores data viser, at BLI er en kraftfuld teknik til at overvåge og kvantificere in vivo modne C. albicans biofilmdannelse i en subkutan musemodel.
Figur 1: Fremstilling af polyurethan Polyurethan enheder del af kateteret skæres i 1 cm stykker.. Plastic POCked indeholdende kateter er åben under sterile betingelser, og alle dele, undtagen kateteret fjernes fra pakningen. For det andet placeres hersker under plastlomme og skæres nøjagtigt 1 cm polyurethan stykker. Sådanne anordninger er derefter distribueret til mikrocentrifugerør (max 15 stykker / rør) og nedsænket i 100% kalvefosterserum efterfulgt af inkubation natten over ved 37 ° C.
Figur 2: Major trin under dyret kirurgi. (A) Procedure for kateter implantat. (1) Placer bedøvet dyr på en varm pude med papir væv og anvende oftalmologiske salve på øjne. (2) Barber nedre del af ryggen og desinficere. (3) Lav to små. (Ca. 0,5 cm) indsnit gennem huden på venstre og på højre side af ryggen. Opret subkutan tunnel i hver incision og sted 3 katetre indeni. (4) Luk wo und med suturer og sted dyr på en varm pad at komme sig. (B) Procedure for kateter fjernelse. (1) Placer ofrede dyr på en pude og desinficere de opererede side indeholder katetre. Skær såret lige over katetrene. (2) Tag hver kateteret forsigtigt og vask to gange med 1 ml PBS. Placer den separate mikrocentrifugerør.
Figur 3:. Måling Bioluminescens signal in vivo BLI billede fra en repræsentant mus afbildet efter 6 dages biofilm udvikling. Kvantificeringen af signalintensiteten udføres ved at placere et område af interesse (ROI) (rektangulær) omkring katetrene efterfulgt af måling af fotonflux per sekund gennem hver ROI.
fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Kvantificering af modne Candida albicans biofilm ved kolonidannende enheder (CFU'er) og BLI. (A) In vivo modne C. albicans SKCA23- ACTgLuc og SC5314 (WT) biofilm kvantificering af Log10 CFU'er efter 90 min, 2 dage og 6 dage af biofilm udvikling. (B) Bioluminescens signalintensiteten kvantificering fra in vivo biofilm dannet af SKCA23- ACTgLuc og C. albicans WT. Signal blev bestemt efter 90 minutter (periode af friktion), 2 dage og 6 dage biofilm udvikling. Som kontrol anvendte vi mus, som blev implanteret med ikke-koloniserede katetre, og som blev injiceret subkutant med CTZ. Den fotonflux opnået i disse mus resulterer i vores baggrund signal (BG). Data blev udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). Statistisk signifikans er angivet som følger: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af dyremodeller, og især gnaver modeller, til undersøgelser dedikeret til mikrobielle biofilm er meget vigtigt, da værtens immunsystem er en væsentlig faktor i biofilmdannelse at in vitro-modeller ikke kan gøre rede for. I denne undersøgelse, beskriver vi en forholdsvis enkel subkutan C. albicans biofilm musemodel, som let kan vedtages i et forskningslaboratorium og ikke kræver stærke tekniske færdigheder. Denne model blev oprindeligt udviklet for at studere Staphylococcus epidermidis biofilmdannelse i en rotte 24.
I den præsenterede model blev serum-coatede polyurethan katetre udfordret med Candida celler ex vivo i løbet af friktion (90 min, 37 ° C). Denne første in vitro trin kan betragtes som en begrænsende faktor på grund af manglen af immunsystemet på det allerførste stadier af biofilm infektion proces. Efter adhæsion og førkateter implantat, er ikke-enhed er forbundet celler fjernes ved vask. Undgå vasketrinnet efter den periode af friktion kan skabe ukontrollabel mængde celler, der er forbundet med enheden. På grund af denne årsag foreslår vi at vaske katetre før implantatet og derfor at indlede udviklingen af adhærerede celler. Efter denne indledende adhæsion periode katetre indeholder ca. 2,0-2,5 log 10 CFU / enhed spredt langs kateteret lumen 15. I denne fase Candida danner kimtråde, som er fastgjort på underlaget.
For at ligne situationen i hospitalsindlagte patienter, hvoraf immunsystemet er ofte kompromitteret, vi immunsupprimerede rotterne i vores subkutan modelsystem 15. Delvis svækkelse af immunsystemet hos en rotte, før enheden implantatet og i hele biofilm udvikling resulterede i forøget reproducerbarhed af biofilm-dannende celler hentet frakatetre implanteret i den samme vært, og også fra enheder fremstillet af ekstra dyr. På grund af disse resultater foreslår vi at immunosuppress musene før kateteret implantatet og også i løbet af biofilmdannelse. Vores resultater viser imidlertid, at variabiliteten i immunkompetente mus meget mindre sammenlignes med observeret hos rotter, hvilket gør, at mus modelsystem også egnet til at studere rollen af værtens immunsystem på biofilm. I vores oprindelige rottemodel og også i samme model oversat til mus, modne C. albicans biofilm udvikle sig inden 48 timer demonstreret ved tilsvarende mængde CFU'er og biofilm arkitektur mellem 2 og 6 dage 15,18,19.
Den subkutane biofilm model blev med succes anvendt til at følge biofilm udvikling af flere mutanter 15. Det er tidligere blevet vist ved Nobile et al. 25, at C. albicans BCR1 Δ / BCR1 Δ undladt atdanner biofilm i et centralt venekateter (CVC) model. Denne stamme viste rudimentære biofilm funktioner i vores subkutane model peger på, at de fænotypiske ændringer fundet i CVC model kunne gengives i det subkutane model 15.
I sammenligning med andre eksisterende modeller, dvs., CVC model eller protese stomatitis model 8,9,11 tillader den subkutane model at følge biofilm udvikling i flere kateter stykker opnået fra et dyr, hvorved antallet af dyr, der er nødvendige for biofilm studier. På trods af disse fordele, kan en mangel være manglen på blodgennemstrømning, som kan føre til visse berøvelse af næringsstoffer i biofilmen. Derfor på sigt af leverancer næringsstoffer og miljømæssige forhold, den subkutane model er mere relateret til enhedens infektioner udviklet på ledproteser, voice proteser og pacemakere end dem, der er dannet på intravenøse katetre. Endnu vigtigere,oversætte rotte subkutan biofilm systemet til mus gjort denne dyremodel kompatibel med BLI, hvilket yderligere reducerer omkostningerne og vigtigst, antallet af nødvendige dyr. Endvidere oversætte rottemodellen til mus muliggør anvendelsen af transgene musemodeller for at studere værten relevante faktorer kateter-associeret infektion studier.
Den største fordel ved at anvende BLI at kvantificere biofilm i levende dyr ligger ikke kun i den ikke-invasive karakter af denne metode, men også i dens evne til at tilvejebringe dynamisk information om udviklingen af en infektion. I denne undersøgelse gluc udtrykt på cellevæggen C. albicans tilladt bedre tilgængelighed og direkte interaktion med substratet coelenterazin, som er afgørende for en påvisning af bioluminescerende signal in vivo. I undersøgelsen af Vande Velde et al. 18, var vi i stand til at følge den bioluminescerende signal fra C. albicans biofilm udviklet på udenlaGN organer in vitro. Den BLI signal intensitet stærkt svarede med oplysningerne fra flere biofilm kvantificering teknikker, dvs. CFUer beslutsomhed og XTT reduktion assay. Ved siden af disse resultater, viste vi, at bioluminescerende signal fra in vivo biofilm var i overensstemmelse med mængden af biofilm-associerede celler udvundet fra eksplanterede biofilm. Derudover Vande Velde et al. 18 påvist, at BLI kan anvendes til at følge biofilm udvikling af en vild type og også ved C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biofilm-deficient stamme) i det samme dyr på samme tid. Sådanne fund kraftigt understøtte brugen af BLI undersøgelserne dedikeret til vurdering af tidsforløbet for biofilm udvikling og infektion i det samme dyr.
Hermed, beskrev vi en eksperimentel procedure til in vivo subkutant implantat af Candida inficerede enheder med efterfølgende overvågning of in vivo biofilm udvikling ved BLI. Tilsammen BLI viste sig at være en pålidelig teknik, som tilladt os at følge en infektion med tiden undgår dyreofre på hvert tidspunkt af dataanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
