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Medicine

Bioluminescence इमेजिंग के बाद माउस चमड़े के नीचे मॉडल में चिकित्सकीय प्रासंगिक विदेशी निकायों पर कैंडिडा सफेद Biofilm विकास

Published: January 27, 2015 doi: 10.3791/52239
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Molecular Microbiology, Laboratory of Molecular Cell Biology, Institute of Botany and Microbiology, VIB, KU Leuven, 2Biomedical MRI Unit/ MoSAIC, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven

Abstract

जैविक और / या अजैव सतहों पर कैंडिडा सफेद biofilm विकास अस्पताल में भर्ती रोगियों के लिए एक विशिष्ट खतरा प्रतिनिधित्व करता है। अब तक, सी श्वेत biofilms इन विट्रो में मुख्य रूप से अध्ययन किया गया है, लेकिन इन विवो शर्तों के तहत इस गतिशील प्रक्रिया की बेहतर समझ के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है। हम सी अध्ययन करने के लिए एक Vivo में चमड़े के नीचे चूहे मॉडल विकसित श्वेत biofilm गठन। हमारे मॉडल में, (9 तक) के कई कैंडिडा -infected उपकरणों पशु के पीछे के भाग को प्रत्यारोपित कर रहे हैं। यह हमें एक जानवर में कई स्वतंत्र biofilms अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है के रूप में यह केंद्रीय शिरापरक कैथेटर मॉडल प्रणाली पर अमेरिका के एक प्रमुख लाभ देता है। हाल ही में, हम सी अध्ययन करने के लिए इस मॉडल को अनुकूलित BALB / ग चूहों में श्वेत biofilm विकास। इस मॉडल में, सी परिपक्व श्वेत biofilms 48 घंटा के भीतर विकसित करने और ठेठ तीन आयामी biofilm वास्तुकला प्रदर्शित करता है। फंगल biofilm की मात्रा का ठहरावपरंपरागत रूप से विश्लेषण किया पोस्टमार्टम है और मेजबान बलिदान की आवश्यकता है। इस गतिज पढ़ाई प्रदर्शन करने के लिए कई जानवरों के उपयोग की आवश्यकता है, क्योंकि हम अनुलंबीय परिपक्व vivo में अनुवर्ती कार्रवाई सी के लिए गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग (BLI) लागू श्वेत हमारे चमड़े के नीचे मॉडल में विकासशील biofilms। सी श्वेत कोशिकाओं सेल दीवार से जुड़ी Gaussia princeps luciferase जीन (gLuc) को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर थे। bioluminescence संकेत मापा जा सकता है कि प्रकाश में जोड़ा सब्सट्रेट coelenterazine कि धर्मान्तरित luciferase द्वारा निर्मित है। BLI संकेत explanted कैथेटर से प्राप्त कोशिकाओं की गिनती जैसे लगते थे। विवो biofilm गठन में बढ़ाता के लिए गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए एक बेहतर समझने के लिए, इसके द्वारा योगदान के साथ ही मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर आधारित अध्ययन के लिए इन विवो शर्तों के तहत स्क्रीनिंग और रोधी दवाओं के सत्यापन के लिए तत्काल आवेदन पत्र प्रदान करता है,कैथेटर जुड़े संक्रमण के रोगजनन की आईएनजी।

Introduction

कैंडिडा सफेद त्वचा पर या जठरांत्र और योनि वनस्पति के एक भाग के रूप में, उदाहरण के लिए, स्वस्थ व्यक्तियों के विभिन्न स्थलों पर पाया जा सकता है जो एक खानेवाला जीव है। हालांकि, में अस्पताल में भर्ती है, और विशेष रूप से रोगियों immunocompromised, यह संक्रमण एक की एक विस्तृत श्रृंखला का कारण बन सकता है। ऐसे व्यक्तियों में, कमजोर प्रतिरक्षा प्रणाली कैंडिडा कोशिकाओं खून में प्रसार करने के लिए और जीवन के लिए खतरा संक्रमण के कारण गहरे ऊतकों पर आक्रमण करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तरह के केंद्रीय शिरापरक और मूत्र कैथेटर के रूप में अजैव substrates की उपस्थिति, कृत्रिम हृदय वाल्व और जोड़ों कैंडिडा लगाव 2 के लिए एक आला प्रदान कर सकता है। ऐसे substrates के लिए आसंजन मुख्य रूप से polysaccharides दो से मिलकर, कोशिकी polymeric सामग्री में एम्बेडेड खमीर और hyphal कोशिकाओं की एक परत का प्रतिनिधित्व करता है जो आगे biofilm विकास के लिए एक शर्त है। सी श्वेत कैथेटर -associated संक्रमणउच्च मृत्यु दर के साथ जुड़े रहे हैं। Biofilms के एक सामान्य लक्षण ऐसे azoles 3,4 के रूप में जाना antifungals, को उनकी कमी हुई संवेदनशीलता है। ऐसे echinocandins और Amphotericin बी के लिपोसोमल तैयार करने के रूप में रोधी दवाओं का केवल नए वर्गों, कैथेटर जुड़े संक्रमण 5-7 के खिलाफ सक्रिय साबित हुई। क्योंकि antifungals को biofilm लचीलापन की, चिकित्सकीय दृष्टिकोण बहुत बार कैथेटर को हटाने और एक एकमात्र समाधान के रूप में इसके बाद के प्रतिस्थापन के लिए अग्रणी सीमित हैं।

सी की हमारी वर्तमान समझ के अधिकांश श्वेत biofilm विकास उपर्युक्त उपकरणों, यानी, सिलिकॉन, polyurethane 2 के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया अजैव ऐसे polystyrene के रूप में substrates, या प्लास्टिक पर इन विट्रो अध्ययन में से निकलती है। इन मॉडलों को काफी उन्नत कर रहे हैं और संभव के रूप में बारीकी से विवो में स्थिति की नकल करने की कोशिश करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों निरंतर रक्त प्रवाह और टी शामिल नहीं हैवह मेजबान की प्रतिरक्षा प्रणाली। यह एक ऐसी केंद्रीय शिरापरक कैथेटर (सीवीसी) मॉडल 8-10, मौखिक कैंडिडिआसिस 11 के कृत्रिम दांतों मुखशोथ मॉडल और कैथेटर जुड़े candiduria 12 के लिए एक murine मॉडल के रूप में vivo मॉडल प्रणाली के विकास में हुई। इसके अतिरिक्त, सी श्वेत biofilm विकास ऐसी योनि 13 और मौखिक गुहा 14 से उन लोगों के रूप mucosal सतहों, पर विवो में अध्ययन किया गया। हमारी प्रयोगशाला में एक चमड़े के नीचे सी की स्थापना के साथ योगदान Sprague Dawley चूहों 15 की पीठ पर संक्रमित कैथेटर टुकड़े के प्रत्यारोपण पर आधारित है जो श्वेत biofilm मॉडल। इस मॉडल को सफलतापूर्वक डाईक्लोफेनाक और caspofungin 17 के मिश्रित चिकित्सा के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, दवाओं 5,16 fluconazole के लिए biofilm संवेदनशीलता का परीक्षण और echinocandin करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया था। हाल ही में, हम BALB / ग चूहों 18,19 में इस्तेमाल के लिए इस प्रणाली को रूपांतरित किया। मेंविवो मॉडल में एक दूसरे के साथ तुलना में, इस चमड़े के नीचे मॉडल का मुख्य लाभ प्रत्यारोपित कैथेटर टुकड़े के लुमेन अंदर विकसित पशु प्रति एकाधिक biofilms अध्ययन करने की संभावना है।

प्रयोगशाला पशुओं की संख्या को कम करने के लिए, हम सी के विकास का अध्ययन करने के लिए इस मॉडल को ढाल लिया है श्वेत bioluminescence इमेजिंग (BLI) 18,19 का उपयोग करके गैर invasively biofilms। इस विधि पशु बलि से परहेज (हमारे मामले में प्रत्यारोपित कैथेटर का क्षेत्र) ब्याज के क्षेत्र में विशिष्ट BLI संकेत को मापने के द्वारा biofilms यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक शक्तिशाली तकनीक, साबित हुई। सी सहित वजह से एक विशिष्ट लक्स ओपेरोन 20 की शुरुआत करने के लिए जीन और bioluminescence प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सब्सट्रेट दोनों व्यक्त कर सकते हैं, जो बैक्टीरिया की तुलना में, के सबसे यूकेरियोटिक जीवों, श्वेत, के साथ मिलकर luciferase जीन की heterologous अभिव्यक्ति पर निर्भर कर रहे हैंऐसे डी luciferin या coelenterazine 21 के रूप में एक विशिष्ट सब्सट्रेट, के बाहरी प्रशासन। शायद की वजह से फंगल सेल की दीवार और सी की उपस्थिति के लिए श्वेत morphogenesis, luciferase एंजाइम के लिए सब्सट्रेट के intracellular वितरण एक मुख्य चुनौती 21 थी। इस समस्या को हल करने के लिए, Enjalbert एट अल। 22 एक तनाव इंजीनियर जहां एक सिंथेटिक सी स्वाभाविक रूप से स्रावित Gaussia princeps luciferase के लिए जीन (gLuc) की श्वेत कोडोन अनुकूलित संस्करण सी करने के लिए जुड़े हुए किया गया था श्वेत PGA59 जीन, एक GPI- कोशिका दीवार प्रोटीन लंगर डाले। क्योंकि कोशिका दीवार पर luciferase की मौजूदगी की वजह से, सब्सट्रेट के intracellular उपलब्धता के विषय में समस्याओं से बचा जा सकता है। यह विशेष रूप से प्रणाली सी की वजह से सतही संक्रमण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था श्वेत 22। हाल ही में, BLI भी मुखग्रसनीय कैंडिडिआसिस और उसके संभव की प्रगति का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई उपचार 23। इस तरह के निष्कर्ष मुक्त जीवित कोशिकाओं लेकिन यह भी डिवाइस से जुड़े संक्रमण की वजह से संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक तकनीक के रूप में BLI के उपयोग का समर्थन।

इस अध्ययन में, हम सी का वर्णन BLI का उपयोग कर पोल्यूरिथेन कैथेटर BALB / ग चूहों में टुकड़े और इसकी मात्रा का ठहराव पर श्वेत biofilm विकास। हम जीवित पशुओं में चूहों में आरोपण और बाद biofilm विकास के बाद आसंजन की अवधि के दौरान पोल्यूरिथेन कैथेटर की इन विट्रो में उपनिवेशवाद का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इसके अलावा सी द्वारा उत्सर्जित BLI संकेत मापने से श्वेत कोशिकाओं, हम भी biofilm फंगल लोड मात्रा का ठहराव के लिए मानक तकनीक के साथ तुलना के लिए इकाइयों के गठन कॉलोनी निर्धारित करते हैं।

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Protocol

नोट: सभी पशु प्रयोगों के यू लोवेन (परियोजना संख्या 090/2013) की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। केयू लोवेन जानवरों की देखभाल के दिशा-निर्देशों के अनुसार जानवरों को बनाए रखें।

1. सी श्वेत ग्रोथ

  1. चौबीस घंटे पशु प्रयोग की दीक्षा से पहले, खमीर निकालने दानेदार के 10 ग्राम, जीवाणु peptone के 20 ग्राम, और दानेदार अगर की 15 ग्राम जोड़कर YPD प्लेटें तैयार करते हैं। मिल्ली क्यू पानी और आटोक्लेव के साथ 900 मिलीलीटर मात्रा अप करें।
  2. बाँझ 40% ग्लूकोज के 50 मिलीलीटर जोड़ें। अच्छी तरह मिक्स और पेट्री डिश में डाल देना। शांत और जमना करने के लिए अगर प्लेट छोड़ दें।
    नोट: इस अध्ययन में, दो उपभेदों, अर्थात् जंगली प्रकार सी का उपयोग श्वेत SC5314 - gLuc नकारात्मक (गुम्मट के रूप में करने के लिए कहा गया है) तनाव और सी एक जंगली प्रकार सी है जो श्वेत SKCA23 तनाव, SKCA23- नामित इस तनाव (.in Clp10 :: Act1p-gLUC59 प्लाज्मिड 22 के साथ बदल श्वेत SC5314CTgLuc) gLuc (इस प्रमोटर कवक विकास के रूप में अच्छी तरह hyphal मंच, खमीर में सक्रिय है) ACT1 (एक्टिन) प्रमोटर के नियंत्रण के तहत अंतर्जात PGA59 जीन से जुड़े हुए किया गया था। इस तनाव प्रो पैट्रिक वान Dijck, केयू लोवेन, बेल्जियम, बेल्जियम की प्रयोगशाला से अनुरोध किया जा सकता है। प्लास्मिड Clp10 :: Act1p-gLUC59 प्लाज्मिड 22 कृपया प्रो सी डी 'Enfert, संस्थान पाश्चर, पेरिस, फ्रांस द्वारा दान किया गया था।
  3. -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयर और दुकान में दोनों उपभेदों बनाए रखें।
  4. एक YPD थाली पर किसी भी प्रयोग लकीर उपभेदों करने से पहले। रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।

2. कैथेटर मोहरे तैयारी

  1. प्रयोग से पहले की जरूरत है, कितने कैथेटर का निर्धारण। यह माउस प्रति 6 कैथेटर टुकड़े (बाईं ओर तीन कैथेटर और पशु (2A चित्रा के सही पक्ष पर तीन कैथेटर) तक समाविष्ट करने के लिए संभव है।
  2. चौबीस घंटा पशु सर्जरी से पहले, पैक खोलनेजैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत ट्रिपल लुमेन कैथेटर युक्त उम्र। एक बाँझ स्केलपेल के साथ कैथेटर से जुड़ी हिस्सा बाँझ चिमटी के साथ सभी अनावश्यक भागों निकालें और काट दिया। प्लास्टिक पैकेज के तहत शासक प्लेस और शासक पर पैमाने (चित्रा 1) के अनुसार वास्तव में एक सेमी के polyurethane कैथेटर टुकड़े काट लें।
    नोट: यह कैथेटर टुकड़ा के इस प्रकार के स्फुरदीप्त और BLI 18,19 के लिए इसलिए उपयुक्त नहीं है कि उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में 15 कटौती कैथेटर टुकड़े (कदम। 2.2) की एक अधिकतम रखें। हमेशा आसंजन की अवधि के बाद डिवाइस पर संलग्न कैंडिडा कोशिकाओं की राशि की गणना करने में उपयोग किया जाता है जो अतिरिक्त तीन टुकड़े, तैयार करते हैं।
  4. लगभग 1.8 एमएल 100% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ कैथेटर अनुपूरक।
  5. सख्ती भंवर और 100% FBS की अतिरिक्त 100-200 μl जोड़ें। पूरी तरह से सीरम के साथ सभी कैथेटर टुकड़े को कवर किया।
  6. रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

    3. पशु और प्रतिरक्षा प्रणाली के दमन

    1. मानक भोजन और पानी यथेच्छ करने के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ व्यक्तिगत रूप से हवादार फिल्टर शीर्ष पिंजरों में महिला BALB / ग चूहों (उम्र के लगभग आठ सप्ताह) रखें।
    2. पशुओं के पीने के पानी के लिए dexamethasone (0.4 मिलीग्राम / एल) जोड़कर पशु शल्य चिकित्सा से पहले प्रतिरक्षा प्रणाली को 24 घंटा के दमन आरंभ करें। मेजबान के किसी भी बैक्टीरियल संक्रमण से बचने के क्रम में, एंटीबायोटिक के साथ पीने के पानी के पूरक है, जैसे, एम्पीसिलीन सोडियम पाउडर (0.5 ग्राम / एल)।
    3. (6 दिनों के लिए) पूरे प्रयोग के दौरान पशुओं के प्रतिरक्षादमन रखें।

    4. पर पूर्व vivo सी श्वेत आसंजन FBS के-लेपित Polyurethane Substrates

    1. एक ताजा 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक सीरम लेपित कैथेटर टुकड़ा स्थानांतरण।
    2. कुछ सी परिमार्जन श्वेत कोशिकाओं YPD प्लेट (चरण 1) पर वृद्धि हुई है और पीबीएस के 1 मिलीलीटर में उन्हें निलंबित।
    3. कमजोर कर सकते हैंएक अलग microcentrifuge ट्यूब में: Dida कोशिकाओं (100) 1। पतला नमूना के 10 μl ले लो और एक सेल गिनती चैम्बर पर लागू होते हैं। कम से कम 16 छोटे वर्गों की गणना।
    4. 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1640 RPMI माध्यम में कैंडिडा कोशिकाओं (प्रत्येक को अलग से तनाव) तैयार करें।
    5. प्रत्येक सीरम लेपित कैथेटर टुकड़ा करने के लिए सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    6. सख्ती भंवर और कैथेटर मध्यम में डूबे हुए हैं और शीर्ष पर चल नहीं कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
    7. 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (आसंजन की अवधि) में कैथेटर सेते हैं।
    8. बाँझ चिमटी के साथ कैथेटर निकालें और पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार उन्हें धोने। इस चरण के दौरान धोने तरल पदार्थ बहुत धीरे कैथेटर निस्तब्धता जबकि ऊर्ध्वाधर स्थिति में कैथेटर रखने के द्वारा लुमेन के माध्यम से चला जाता है सुनिश्चित करें। महत्वपूर्ण बात है, संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जो एक मजबूत प्रवाह का उपयोग नहीं करते।
    9. टीयू प्रति एक साफ microcentrifuge ट्यूब (एक टुकड़ा करने के लिए प्रत्येक धोया कैथेटर स्थानांतरण) हो।
    10. बर्फ पर रखें और सर्जरी तक वहां रहते हैं।

    5. संज्ञाहरण

    1. Medetomidine के 100 μl (1 मिलीग्राम / एमएल) और बाँझ खारा के 825 μl साथ ketamine का 75 μl (100 मिलीग्राम / एमएल) के मिश्रण से संज्ञाहरण तैयार करें। 45-60 मिलीग्राम / किग्रा ketamine और 0.6-0.8 मिलीग्राम / किग्रा medetomidine की एक खुराक में जिसके परिणामस्वरूप, 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति संवेदनाहारी कॉकटेल के intraperitoneally (आईपी) 60-80 μl प्रशासन।
    2. संज्ञाहरण के उत्क्रमण के लिए, 0.5 मिलीग्राम / किग्रा की एक खुराक में जिसके परिणामस्वरूप, इलाज के रूप में आईपी प्रशासन, 4.95 मिलीलीटर खारा में 10 ग्राम शरीर के वजन के प्रति 100 μl 50 μl atipamezole (5 मिलीग्राम / एमएल) पतला।
    3. एनेस्थीसिया के इंजेक्शन के बाद, एक अलग पिंजरे में जानवरों की जगह है और यह पूरी तरह से सो रहा है जब तक प्रतीक्षा करें।
    4. प्रकाश त्वचा चुटकी और त्वचा को कोई नुकसान का कारण नहीं है, जो पैर की अंगुली चुटकी, जानवर के द्वारा उचित anesthetization की पुष्टि करें। किसी भी मनाया आंदोलन पशु पर्याप्त सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए anesthetized नहीं है कि इंगित करता है। यदि ऐसा होता है, एक cou के इंतजारअब पशु जब तक मिनट की मिसाल त्वचा या पैर के अंगूठे चुटकी पर आंदोलन के कोई लक्षण नहीं दिखा है।

    6. पशु शल्य चिकित्सा

    1. स्थानांतरण हीटिंग पैड पर रखा एक साफ ऊतक पर पिंजरे से पशु anesthetized, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म (2A चित्रा, (1))।
      ध्यान दें: एक सस्ता विकल्प विद्युत गरम कंबल का उपयोग करने के लिए है। यह जानवर सर्जरी से पहले माइक्रोवेव में गरम किया जाना चाहिए जो isothermic पैड, उपयोग करने के लिए भी संभव है।
    2. आंखों पर नेत्र मरहम लागू करें।
    3. एक बिजली के रेजर के साथ जानवर की पीठ के निचले हिस्से दाढ़ी। सभी पशु बाल निकालें और एक साफ ऊतक पर पशु हस्तांतरण। (1% आयोडीन isopropanol या 70% शराब में 0.5% chlorhexidine के साथ, उदाहरण के लिए) त्वचा को शुद्ध करना और लगभग एक मिनट के लिए शुष्क करने कीटाणुरहित क्षेत्र को छोड़ (2A चित्रा (2))।
    4. (त्वचा में लगभग 0.5 (पशु के दाईं ओर बाईं तरफ एक और एक) एक छोटा सा चीरा और# 8211; 1 सेमी) (2A चित्रा, (3))।
    5. दो चमड़े के नीचे सुरंगों को बनाने के लिए एक कैंची के साथ subcutis काटना। प्रत्येक सुरंग लगभग 1.5 सेमी लंबी और 1 सेमी चौड़ा होना चाहिए।
    6. प्रत्येक सुरंग में, पहले से कैंडिडा से संक्रमित तीन कैथेटर टुकड़े, डालें। कैथेटर एक क्षैतिज व्यवस्था में एक दूसरे के बगल झूठ सुनिश्चित करें कि और वे कुल में छह कैथेटर टुकड़े का आरोपण सक्षम करने के लिए एक दूसरे को कवर नहीं है कि (2A चित्रा (4))।
    7. Sutures के साथ चीरों बंद करें। वैकल्पिक रूप से, घाव बंद करने के लिए Dermabond का उपयोग करें।
    8. 70% शराब में या आयोडीन isopropanol (1%) के साथ बहुत धीरे 0.5% chlorhexidine साथ घाव कीटाणुरहित।
    9. सीधे घाव पर स्थानीय संवेदनाहारी (xylocaine जेल, 2%) लागू करें।
    10. संज्ञाहरण के उलट (प्रोटोकॉल 5, चरण 2) प्रशासन: intraperitoneally 100 μl 10 प्रति छ शरीर के वजन।
    11. एक साफ पिंजरे में ट्रांसफर पशु पहले से एक गर्म थाली पर रख दिया गया। पशु रखेंअलग और गर्म जानवर पूरी तरह से जाग रहा है जब तक। इस बीच, अगले जानवर के संचालन और प्रत्यारोपण के साथ जारी है। एक बार सभी संचालित जानवरों पूरी तरह से जाग रहे हैं। एक पिंजरे में स्थानांतरण। नियमित रूप से जानवरों की निगरानी करें।

    7. Bioluminescence इमेजिंग: coelenterazine (CTZ) की तैयारी के जी लिए, सब्सट्रेट princeps luciferase

    1. Acidified इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल CTZ भंग या निर्माता के निर्देशों के अनुसार की ताजा coelenterazine (CTZ) शेयर समाधान तैयार है।
    2. बाँझ पीबीएस में शेयर समाधान 01:10 गिराए द्वारा 1.2 मिमी काम कर समाधान तैयार है।
      नोट: कैथेटर के आसपास के क्षेत्र में 100 μl CTZ काम कर समाधान subcutaneously इंजेक्षन। CTZ के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए इंसुलिन सीरिंज का प्रयोग करें।
    3. हमेशा अंधेरे में CTZ रखने के (जैसे, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ CTZ युक्त microcentrifuge ट्यूब कवर)। प्रयोगों की अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान स्टोर।
      4. 8. Bioluminescence इमेजिंग

      1. BLI कैमरा इनिशियलाइज़।
      2. एक प्रेरण बॉक्स का उपयोग जानवरों anesthetize। 2-3% से कम, ऑक्सीजन में 2 एन ओ / ओ 2, या हवा isoflurane की एक गैस मिश्रण का प्रयोग करें।
      3. अधिष्ठापन के बाद, प्रेरण बॉक्स में और 1.5-2% पर इमेजिंग कक्ष में संज्ञाहरण बनाए रखें।
      4. इमेजिंग सत्र शुरू करने से पहले, 10 सेमी की एक FOV से मेल खाती है, जो स्थिति में इमेजिंग थाली, जगह है। सुनिश्चित करें कि बॉक्स में एक नींद पशु रखकर संज्ञाहरण दुकानों और जानवर की सही स्थिति है।
      5. पशु अधिकार कैमरा के तहत FOV में वांछित इमेजिंग की स्थिति में है जब तक कुछ तस्वीरें ले लो।
      6. दो इंसुलिन सीरिंज CTZ काम कर समाधान के प्रत्येक युक्त 100 μl तैयार करें।
      7. बेंच पर एक पशु प्लेस और गैस संज्ञाहरण उपलब्ध कराने के एक नाक शंकु के माध्यम से सो इसे रख लो।
      8. कैथेटर subcutaneously आस-पास के एक स्थान में सीरिंज की सुई ले आओ और इंजेक्षनCTZ एक साथ कैथेटर के शीर्ष पर।
      9. तुरंत इंजेक्शन के बाद, कैमरा बॉक्स में गर्म प्लेट पर जानवरों की जगह और bioluminescence छवि अधिग्रहण शुरू करते हैं।
      10. 20 से अधिकतम संकेत तीव्रता तक पहुँच जाता है 60 सेकंड (संकेत तीव्रता पर निर्भर करता है) को लेकर अधिग्रहण के समय के साथ लगातार स्कैन मोल। अगले फ्रेम के अधिग्रहण के दौरान, इस आरओआई के माध्यम से फोटॉन प्रवाह प्रत्येक कैथेटर तिकड़ी पर एक आरओआई रखने और मापने के द्वारा पहले से हासिल कर लिया तख्ते की BLI संकेत तीव्रता को मापने।
      11. अगले जानवर (ओं) के लिए चरण 7 से दोहराएँ।
      12. इमेजिंग के बाद, उनके पिंजरे में जानवरों वापसी। Biofilm गठन के अनुदैर्ध्य, गैर इनवेसिव अनुवर्ती के लिए एक प्रयोग के दौरान BLI दोहराएँ।
      13. जीवित प्रतिमा और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर BLI डेटा का विश्लेषण। प्रत्येक कैथेटर तिकड़ी से अधिक निश्चित आकार की एक आयताकार आरओआई प्लेस और प्रत्येक रॉय के माध्यम से फोटॉन प्रवाह (चमक) को मापने। हर जानवर के लिए इस दोहराएँ।
      14. रिपोर्टप्रति सेकंड फोटॉन प्रवाह के रूप में प्रत्येक कैथेटर तिकड़ी के BLI संकेत तीव्रता। मतलब है और प्रत्येक समूह के लिए प्रति सेकंड फोटॉन प्रवाह के एसडी साजिश रचने के द्वारा एक लघुगणकीय पैमाने पर BLI डेटा प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रवेश 10 तब्दील डेटा पर सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं।

      9. कैथेटर explant

      1. प्रत्येक कैथेटर डिवाइस के लिए पीबीएस, एक के 1 मिलीलीटर युक्त microcentrifuge ट्यूब तैयार करें और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
      2. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से जानवरों Euthanize (चित्रा 2B, (1))।
      3. 70% शराब में या आयोडीन isopropanol (1%) के साथ 0.5% chlorhexidine के साथ वापस की त्वचा कीटाणुरहित।
      4. कैथेटर के ऊपर एक चीरा (लगभग 3 सेमी) बनाते हैं।
      5. चमड़े के नीचे ऊतक में कटौती और बाँझ चिमटी का उपयोग करते हुए चमड़े के नीचे ऊतक के नीचे से एक एक करके कैथेटर टुकड़े एक हटाने के लिए (चित्रा 2B, (2))।
      6. ऊर्ध्वाधर स्थिति में धीरे कैथेटर संभाल और बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धो लें। प्रत्येक कैथेटर रखेंएक अलग microcentrifuge ट्यूब में टुकड़ा (चरण 1 में तैयार)।

      कॉलोनी बनाने इकाइयों की गणना (CFUs) और परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण से 10 की मात्रा biofilm से जुड़े प्रकोष्ठों

      1. Sonicate कैथेटर पहले से एक पानी के स्नान sonicator में 40,000 हर्ट्ज पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर में रखा जाता है और बर्फ पर उन्हें जगह है।
      2. Sonication के बाद, सख्ती बर्फ पर फिर से 30 सेकंड और जगह के लिए भंवर।
      3. पीबीएस के 900 μl युक्त दो अतिरिक्त microcentrifuge ट्यूब तैयार करें।
      4. अपने मूल नमूना (कैथेटर शामिल है जो एक) से 100 dilutions और बर्फ पर सभी microcentrifuge ट्यूब रखें: 01:10 और एक बनाओ।
      5. प्लेट मूल नमूने के 100 μl, 1:10 और 1: दो प्रतियों में YPD अगर प्लेटों पर 100 dilutions के।
      6. 37 डिग्री सेल्सियस पर दो दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं और CFUs गिनती।
      7. YPD अगर प्लेटों पर हो कालोनियों (कालोनियों के गणनीय राशि, अधिकतम 300 कालोनियों / प्लेट) की गणना और उचित dilu द्वारा उन्हें गुणाtion के कारक (1x-मूल, 10x या 100x कमजोर पड़ने)। इसके अलावा कैथेटर युक्त 1 मिलीलीटर ट्यूब में कालोनियों की अंतिम राशि से मेल खाती है जो 10x द्वारा प्रत्येक कैथेटर टुकड़ा, गुणा। 10 कोशिकाओं / मानक विचलन (एसडी) के साथ कैथेटर टुकड़ा लॉग इन करने की कालोनियों की अंतिम राशि लाओ। एसडी ± एक मतलब के रूप में डेटा व्यक्त करते हैं।
      8. उपर्युक्त गणित और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, एक स्प्रेडशीट और / या सांख्यिकीय कार्यक्रम में प्रत्येक कैथेटर और विशिष्ट समूह के लिए सभी मूल्यों रखें। तुलना करने के लिए विशिष्ट समूहों संकेत मिलता है, यानी गुम्मट बनाम उत्परिवर्ती या दो दिनों बनाम। 6 दिन biofilm गठन और log10 तब्दील डेटा पर Tukey के बाद परीक्षण के साथ unpaired टी-परीक्षण और एनोवा प्रदर्शन करते हैं।
        1. एक पी मूल्य द्वारा महत्व के स्तर व्यक्त करते हैं। के रूप में प्रतिनिधित्व पी मूल्य <0.05, इस प्रकार अगर इस अध्ययन में महत्व का संकेत: * पी ​​<0.05, ** पी <0.005, *** पी <.0005।

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Representative Results

इस अध्ययन में, हम एक माउस में इन विवो सी श्वेत biofilm विकास के दौरान कैथेटर प्रत्यारोपण और explant के शल्य प्रक्रिया दिखा। इसके अलावा, हम शास्त्रीय CFUs गणन द्वारा बल्कि BLI द्वारा न केवल परिपक्व biofilms के मात्रा का ठहराव प्रदर्शित करते हैं।

चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, गैर-स्फुरदीप्त पोल्यूरिथेन कैथेटर टुकड़े 1 सेमी उपकरणों में कटौती करने और बाद में सीरम के साथ लेपित किया गया। यह कैंडिडा कोशिकाओं गैर सीरम लेपित प्रत्यारोपण 15 के साथ तुलना में अधिक तेजी से सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देता है, क्योंकि यह कदम बहुत महत्वपूर्ण है। यह किसी भी सी के लिए है कि पूर्व उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है श्वेत प्रयोग हम पहले हमारे उपकरणों 18 वर्ष की पृष्ठभूमि luminescence के दस्तावेज। डिवाइस की उच्च स्फुरदीप्ति gLuc- से विशिष्ट bioluminescent संकेत तीव्रता और संकेत कैनेटीक्स के मूल्यांकन के साथ हस्तक्षेप करेगा क्योंकि यह कदम किसी भी BLI प्रदर्शन से पहले महत्वपूर्ण हैकोशिकाओं को व्यक्त। अगला, सी श्वेत कोशिकाओं सीरम लेपित कैथेटर टुकड़ों के साथ incubated हैं। कैथेटर टुकड़े तो चमड़े के नीचे चीरा (2A चित्रा) के बाद पशु के पीछे के भाग पर प्रत्यारोपित कर रहे हैं। इस में स्थापित विवो में, दो चीरों प्रत्येक चीरा अंदर चमड़े के नीचे सुरंगों के गठन के द्वारा पीछा किया (दाएं और एक चूहे के पीछे के बाईं ओर एक और एक पर एक) प्रदर्शन कर रहे हैं (2A चित्रा (3))। बाद में, पहले से कैंडिडा कोशिकाओं से संक्रमित तीन उपकरणों, प्रत्येक आपरेशन साइट के अंदर प्रत्यारोपित (2A चित्रा (3 और 4)) हैं। इस सेट अप हमें पशु प्रति छह biofilms अप करने के लिए अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है। यह दो आपरेशन साइटों को एक ही पशु में उदाहरण के जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती के लिए ब्याज की दो विभिन्न प्रकारों से biofilm गठन का अध्ययन करने के लिए एक संभावना प्रदान उल्लेखनीय है कि। चित्रा 2B डिवाइस explant और बाद में धोने कदम के लिए पहले कैथेटर युक्त घाव प्रदर्शित करता है।पशु के पीछे के भाग के अंदर विकसित biofilms bioluminescence संकेत माप के लिए मूल्यांकन किया गया। हित के क्षेत्रों (ROIs) निस्र्पक आयतों के साथ मिलकर bioluminescence संकेत प्रदर्शित प्रतिनिधि जानवरों में से एक में 3 चित्र में दिखाया गया है। पिछले BLI समय बिंदु के बाद, कैथेटर, explanted sonicated और बाद में vortexed और आगे biofilm से गठन की कोशिकाओं के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं CFUs द्वारा मात्रा का ठहराव। Biofilm विकास और explantation चित्रा -4 ए में दिखाया जाता है के बाद डाटा प्रत्येक कैथेटर टुकड़ा से प्राप्त प्रवेश 10 CFUs प्रदर्शन विश्लेषण करती है। अगला कि करने के लिए, CFUs BLI संकेत तीव्रता के साथ तुलना की गई है और इन आंकड़ों 4B चित्रा में दिखाए जाते हैं। नब्बे मिनट आरोपण के बाद एक स्पष्ट BLI संकेत जंगली प्रकार तनाव में है, शायद ही किसी भी प्रकाश वहाँ का उत्पादन किया है, जबकि ACTgLuc biofilms -expressing द्वारा निर्मित है; ACTgLuc -expressing से पता चला प्रकाश की तीव्रताbiofilm एक ही माउस (चित्रा 4C) निम्न यहां बनाई है, के रूप में biofilms काफी बढ़ रही है। प्रकाश में यह वृद्धि बायोफिल्म (चित्रा -4 ए) के अनुसार CFUs में वृद्धि के रूप में एक ही प्रवृत्ति के बाद। हमारे प्रयोगों में हम भी नहीं है (luciferase व्यक्त करने के लिए इंजीनियर) एक सामान्य जंगली प्रकार तनाव भी सब्सट्रेट के अलावा पर प्रकाश के उत्पादन में परिणाम है कि मनाया। हालांकि, फोटोन प्रवाह इंजीनियर तनाव के लिए प्राप्त की तुलना में काफी कम थी।

साथ में ले ली, हमारे डेटा BLI सी नजर रखने और यों में विवो परिपक्व करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना एक चमड़े के नीचे माउस मॉडल में श्वेत biofilm गठन।

चित्रा 1
चित्रा 1: Polyurethane उपकरणों की तैयारी 1 सेमी टुकड़ों में काट कैथेटर के polyurethane हिस्सा है।। प्लास्टिक पीओसीकैथेटर पैकेज से हटा रहे हैं को छोड़कर बाजार युक्त कैथेटर, बाँझ शर्तों और सभी भागों के तहत खुला है। दूसरे, प्लास्टिक की जेब के तहत शासक जगह है और वास्तव में एक सेमी polyurethane के टुकड़े काट लें। इस तरह के उपकरणों बाद में microcentrifuge ट्यूब (अधिकतम 15 टुकड़े / ट्यूब) के लिए वितरित और 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊष्मायन द्वारा पीछा 100% भ्रूण गोजातीय सीरम में डूबे हुए हैं।

चित्रा 2
चित्रा 2: पशु शल्य चिकित्सा के दौरान प्रमुख कदम। (ए) कैथेटर प्रत्यारोपण की प्रक्रिया। (1) प्लेस कागज ऊतक युक्त एक गर्म पैड पर पशु anesthetized और आंखों पर नेत्र मरहम लागू होते हैं। (2) पीठ और कीटाणुरहित के निचले हिस्से दाढ़ी। (3) छोड़ दिया और पीठ के दाईं ओर त्वचा के माध्यम से दो छोटे (लगभग। 0.5 सेमी) चीरों बनाएँ। प्रत्येक चीरा अंदर चमड़े के नीचे सुरंग बना सकते हैं और अंदर तीन कैथेटर जगह है। (4) है wo बंद करें एक गर्म पैड पर टांके और जगह जानवर के साथ अंड। उबरने कैथेटर को हटाने का (बी) प्रक्रिया करने के लिए। (1) प्लेस एक पैड पर पशु का बलिदान और ऑपरेशन की ओर से युक्त कैथेटर कीटाणुरहित। सही कैथेटर के ऊपर घाव काटें। (2) धीरे प्रत्येक कैथेटर बाहर ले जाओ और पीबीएस के 1 एमएल के साथ दो बार धो लें। अलग microcentrifuge ट्यूब रखें।

चित्रा 3
चित्रा 3:। Bioluminescence संकेत माप में vivo BLI छवि एक प्रतिनिधि माउस से biofilm विकास के 6 दिन बाद imaged। संकेत तीव्रता की मात्रा का ठहराव हर आरओआई के माध्यम से प्रति सेकंड फोटॉन प्रवाह की माप के द्वारा पीछा कैथेटर के आसपास (आयताकार) ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र रखकर किया जाता है।

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चित्रा 4: कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) द्वारा और BLI द्वारा परिपक्व कैंडिडा सफेद biofilms के मात्रा। (ए) में विवो सी परिपक्व श्वेत SKCA23- ACTgLuc और SC5314 (डब्ल्यूटी) 90 मिनट, 2 दिन और biofilm विकास के 6 दिन बाद log10 CFUs द्वारा biofilm मात्रा का ठहराव। (बी) SKCA23- ACTgLuc द्वारा और सी द्वारा गठित इन विवो biofilms से Bioluminescence संकेत तीव्रता मात्रा का ठहराव श्वेत गुम्मट। सिग्नल 90 मिनट (आसंजन की अवधि), 2 दिन और biofilm विकास के 6 दिन बाद निर्धारित किया गया था। एक नियंत्रण के रूप में, हम गैर-उपनिवेश कैथेटर के साथ प्रत्यारोपित किया गया और कहा कि subcutaneously CTZ इंजेक्शन के साथ किया गया है कि चूहों का इस्तेमाल किया। इन चूहों में प्राप्त फोटॉन प्रवाह हमारी पृष्ठभूमि संकेत (बीजी) में यह परिणाम है। डेटा मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में व्यक्त कर रहे थे। इस प्रकार के रूप सांख्यिकीय महत्व संकेत दिया है: * पी ​​<0.05, ** पी <0.005, *** पी <.0005। में विवो जंगली प्रकार सी युक्त कैथेटर टुकड़े के साथ प्रत्यारोपित किया गया था कि एक प्रतिनिधि माउस से bioluminescence छवियों सही पक्ष पर बाईं ओर श्वेत कोशिकाओं और ACTgLuc -expressing कोशिकाओं। माउस 2 दिन और 6 दिन कैथिटर टुकड़े के आरोपण के बाद, 90 मिनट, यानी तीन अलग अलग समय अवधि में उतारी थी।

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Discussion

मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली के लिए इन विट्रो मॉडल के लिए खाते में नहीं कर सकते हैं कि biofilm गठन में एक आवश्यक कारक है के रूप में माइक्रोबियल biofilms के लिए समर्पित अध्ययन के लिए पशु मॉडल, और विशेष रूप से कृंतक मॉडल का उपयोग करते हैं, बहुत महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में, हम एक अपेक्षाकृत सरल चमड़े के नीचे सी का वर्णन आसानी से एक अनुसंधान प्रयोगशाला में अपनाया जा सकता है और मजबूत तकनीकी कौशल की आवश्यकता नहीं है, जो श्वेत biofilm माउस मॉडल,। यह मॉडल मूल रूप से एक चूहा 24 में स्टाफीलोकोकस एपिडिडर्मिस biofilm गठन का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था।

प्रस्तुत मॉडल में, सीरम लेपित Polyurethane कैथेटर आसंजन की अवधि (90 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस) के दौरान कैंडिडा कोशिकाओं पूर्व vivo के साथ चुनौती दी थी। यह पहली बार में इन विट्रो कदम क्योंकि biofilm संक्रमण प्रक्रिया के पहले ही चरणों में प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी का एक सीमित कारक के रूप में माना जा सकता है। आसंजन और पहले निम्नकैथेटर प्रत्यारोपण, गैर डिवाइस जुड़े कोशिकाओं धोने से हटा रहे हैं। आसंजन की अवधि के बाद धोने कदम से बचना डिवाइस के साथ जुड़े कोशिकाओं की बेकाबू राशि बना सकते हैं। इस कारण के कारण, हम पालन कोशिकाओं से इसके विकास आरंभ करने के लिए, पूर्व प्रत्यारोपण के लिए है और इसलिए कैथेटर को धोने के लिए सुझाव देते हैं। इस प्रारंभिक आसंजन अवधि के बाद, कैथेटर 15 लुमेन कैथेटर के साथ फैल लगभग 2.0-2.5 प्रवेश 10 CFUs / डिवाइस होते हैं। इस चरण के दौरान कैंडिडा सब्सट्रेट पर जुड़े होते हैं जो रोगाणु ट्यूब, रूपों।

प्रतिरक्षा प्रणाली को अक्सर समझौता किया है, जिनमें से अस्पताल में भर्ती रोगियों में स्थिति सदृश करने के क्रम में, हम अपने चमड़े के नीचे मॉडल प्रणाली 15 में चूहों immunosuppressed। एक चूहे की प्रतिरक्षा प्रणाली का आंशिक हानि, डिवाइस प्रत्यारोपण के लिए और biofilm विकास की अवधि के दौरान पूर्व, से लिया गया biofilm से बनाने कोशिकाओं की वृद्धि की reproducibility में हुईएक ही मेजबान में और भी अतिरिक्त जानवरों से प्राप्त उपकरणों से प्रत्यारोपित कैथेटर। क्योंकि इन निष्कर्षों की हम कैथेटर प्रत्यारोपण से पहले और भी biofilm गठन की अवधि के दौरान चूहों immunosuppress करने के लिए सुझाव देते हैं। हालांकि, हमारे परिणाम असुरक्षित चूहे में परिवर्तनशीलता भी biofilms पर मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है कि चूहों मॉडल प्रणाली बनाता है जो चूहों में मनाया कि, बहुत कम की तुलना में है कि पता चलता है। हमारे मूल चूहे मॉडल में और भी चूहों में अनूदित एक ही मॉडल में, सी परिपक्व श्वेत biofilms 2 और 6 दिनों 15,18,19 के बीच समान CFUs की राशि और biofilm वास्तुकला द्वारा प्रदर्शन 48 घंटा के भीतर विकसित करना।

चमड़े के नीचे biofilm मॉडल को सफलतापूर्वक कई म्यूटेंट 15 से biofilm विकास का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह Nobile एट अल द्वारा पहले से दिखाया गया है। 25 कि सी श्वेत bcr1 Δ / Δ करने में विफल रहा bcr1एक केंद्रीय शिरापरक कैथेटर (सीवीसी) मॉडल में फार्म biofilms। इस तनाव सीवीसी मॉडल में पाया प्ररूपी परिवर्तन चमड़े के नीचे मॉडल 15 में reproduced किया जा सकता है तथ्य यह है कि हमारे चमड़े के नीचे मॉडल इशारा में अल्पविकसित biofilm सुविधाओं का प्रदर्शन किया।

अन्य मौजूदा मॉडलों के साथ इसकी तुलना में अर्थात्।, सीवीसी मॉडल या कृत्रिम दांतों मुखशोथ मॉडल 8,9,11, चमड़े के नीचे मॉडल जिससे biofilm पढ़ाई के लिए आवश्यक पशुओं की संख्या को कम करने, एक जानवर से प्राप्त कई कैथेटर टुकड़ों में biofilm विकास का पालन करने की अनुमति देता है। इन फायदों के बावजूद, एक कमी biofilm में पोषक तत्वों की कुछ हानि का कारण हो सकता है कि रक्त प्रवाह की कमी हो सकती है। इसलिए, पोषक तत्वों की आपूर्ति और पर्यावरण की स्थिति की अवधि में, चमड़े के नीचे मॉडल नसों में कैथेटर पर गठित लोगों की तुलना में संयुक्त कृत्रिम अंग, आवाज कृत्रिम अंग और पेसमेकर पर विकसित डिवाइस जुड़े संक्रमण से संबंधित है। इससे भी अधिक महत्वपूर्ण बात,आगे सबसे महत्वपूर्ण बात यह लागत कम कर देता है और जो BLI, आवश्यक पशुओं की संख्या के साथ इस पशु मॉडल संगत बनाया चूहों को चूहे चमड़े के नीचे biofilm प्रणाली अनुवाद। इसके अलावा, चूहों को चूहे मॉडल का अनुवाद कैथेटर जुड़े संक्रमण के अध्ययन के लिए प्रासंगिक मेजबान कारकों का अध्ययन करने के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग सक्षम बनाता है।

जीवित पशुओं में biofilms यों तो BLI का उपयोग करने का प्रमुख लाभ न केवल इस विधि के गैर इनवेसिव चरित्र में निहित है, लेकिन यह भी एक संक्रमण के विकास पर गतिशील जानकारी प्रदान करने के लिए अपनी क्षमता में। इस अध्ययन में, gLuc सी के सेल की दीवार पर व्यक्त श्वेत। विवो में bioluminescent संकेत का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो सब्सट्रेट coelenterazine, साथ बेहतर पहुंच और सीधे संपर्क की अनुमति दी वंदे Velde एट अल। 18 के अध्ययन में, हम सी से bioluminescent संकेत का पालन करने में सक्षम थे श्वेत forei पर विकसित biofilmsइन विट्रो में जीएन निकायों। BLI संकेत तीव्रता दृढ़ता यानी अतिरिक्त biofilm मात्रा का ठहराव तकनीक, CFUs दृढ़ संकल्प और XTT कमी परख से प्राप्त आंकड़ों के साथ corresponded। इन परिणामों के बगल में, हम इन विवो biofilms से bioluminescent संकेत explanted biofilms से बरामद biofilm से जुड़े कोशिकाओं की राशि के साथ समझौते में था कि पता चला है। इसके अतिरिक्त, वंदे Velde एट अल। 18 BLI सी द्वारा भी एक जंगली प्रकार से biofilm विकास का पालन करें और के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शन एक ही समय में एक ही जानवर में श्वेत bcr1Δ / bcr1Δ (biofilm से कमी तनाव)। इस तरह के निष्कर्ष दृढ़ता से एक ही जानवर में biofilm विकास और संक्रमण के समय के पाठ्यक्रम का आकलन करने के लिए समर्पित अध्ययन के दौरान BLI के उपयोग का समर्थन।

इसके साथ, हम बाद में निगरानी ओ के साथ कैंडिडा -infected उपकरणों के vivo चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया में वर्णितBLI द्वारा एफ में विवो biofilm विकास। साथ में ले ली, BLI हमें डेटा का विश्लेषण करती है की हर समय बिंदु पर पशु बलि से परहेज समय के साथ एक संक्रमण का पालन करने की अनुमति दी है, जो एक विश्वसनीय तकनीक होने के लिए दिखाया।

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

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References

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चिकित्सा अंक 95, Biofilm चमड़े के नीचे मॉडल CFUs BALB / ग माउस bioluminescence इमेजिंग, coelenterazine
Bioluminescence इमेजिंग के बाद माउस चमड़े के नीचे मॉडल में चिकित्सकीय प्रासंगिक विदेशी निकायों पर <em>कैंडिडा सफेद</em> Biofilm विकास
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Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

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