Abstract
Candida albicans biofilm ontwikkeling op biotische en / of abiotische vlakken vormt een specifieke dreiging voor gehospitaliseerde patiënten. Tot nu toe C. albicans biofilms werden voornamelijk bestudeerd in vitro, maar er is een dringende behoefte aan een beter begrip van deze dynamische proces onder in vivo condities. We ontwikkelden een in vivo subcutane rat model om C. te studeren albicans biofilm vorming. In ons model meervoudige (tot 9) Candida geïnfecteerde inrichtingen worden geïmplanteerd om het rugdeel van het dier. Dit geeft ons een groot voordeel ten opzichte van de centrale veneuze katheter modelsysteem als het ons toelaat om verschillende onafhankelijke biofilms studeren in één dier. Onlangs hebben we aangepast deze model naar C. studeren albicans biofilm ontwikkeling in BALB / c muizen. In dit model, volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen binnen 48 hr en tonen de typische driedimensionale biofilm architectuur. Het kwantificeren van schimmels biofilmis van oudsher geanalyseerd post mortem en vereist gastheer opoffering. Omdat dit vereist het gebruik van vele dieren kinetische studies uitvoeren, toegepast worden niet-invasieve bioluminescentie (BLI) longitudinaal volgen in vivo volwassen C. albicans biofilms ontwikkelen in onze subcutane model. C. albicans cellen werden om de Gaussia princeps luciferasegen (GLUC) bevestigd aan de celwand expressie. De bioluminescentie-signaal wordt geproduceerd door het luciferase die het toegevoegde substraat coelenterazine omzet in licht die kan worden gemeten. De BLI signaal leek cel verkregen uit geëxplanteerde katheters telt. Niet-invasieve beeldvorming voor het kwantificeren van in vivo biofilmvorming biedt onmiddellijke toepassingen voor screening en validatie van antimycotica onder in vivo omstandigheden, alsmede voor studies op basis van gastheer-pathogeen interacties hierbij dragen tot een beter begriping van de pathogenese van katheter-gerelateerde infecties.
Introduction
Candida albicans is een commensaal organisme, te vinden op verschillende plaatsen van gezonde individuen, bijvoorbeeld op de huid of als een deel van de tractus en vaginale flora. Echter, in het ziekenhuis, en vooral immunogecompromitteerde patiënten, kan een groot aantal infecties 1 veroorzaken. Bij dergelijke individuen, het verzwakte immuunsysteem maakt Candida cellen te verspreiden in de bloedbaan en diepere weefsels binnen te vallen waardoor levensbedreigende infecties. Bovendien is de aanwezigheid van abiotische substraten zoals centrale veneuze en urinaire katheters, kunstmatige hartkleppen en gewrichten kunnen een niche voor Candida bevestiging 2 verschaffen. Hechting aan dergelijke substraten is voordat verder biofilm ontwikkeling, waarop een laag gist en hyphal cellen ingebed in extracellulair polymeermateriaal vertegenwoordigt hoofdzakelijk uit polysacchariden 2. C. albicans katheter-geassocieerde infectiesworden geassocieerd met een hoog sterftecijfer. Een algemeen kenmerk van biofilms is hun verminderde gevoeligheid voor bekende antimycotica, zoals azolen 3,4. Alleen nieuwere klassen van antimycotica, zoals echinocandinen en liposomale formulering van amfotericine B bleken werkzaam tegen katheter infecties 5-7 zijn. Door biofilm veerkracht antimycotica zijn therapeutische benaderingen erg beperkt, wat vaak leidt tot verwijdering van de katheter en de daaropvolgende vervanging als enige oplossing.
De meeste van onze huidige kennis van C. albicans biofilm ontwikkelen komt uit in vitro naar abiotische substraten zoals polystyreen, of kunststof voor de vervaardiging van bovengenoemde inrichtingen, bijvoorbeeld, silicone, polyurethaan 2. Deze modellen zijn zeer geavanceerd en proberen de situatie in vivo zo goed mogelijke nabootsen. Echter, deze systemen niet betrekking op de continue bloedstroom en thij immuunsysteem van de host. Dit resulteerde in de ontwikkeling van in vivo modelsystemen, zoals centrale veneuze katheter (CVC) model 8-10, de prothese stomatitis model van orale candidiasis 11 en een muizenmodel voor katheters candidurie 12. Bovendien, C. albicans biofilm ontwikkeling werd bestudeerd in vivo op de mucosale oppervlakken, zoals die van de vagina 13 en mondholte 14. Ons laboratorium heeft bijgedragen aan de oprichting van een onderhuidse C. albicans biofilm model, dat is gebaseerd op het implantaat van geïnfecteerde catheter stuks op de achterkant van Sprague Dawley 15. Dit model werd met succes gebruikt in ons laboratorium biofilm gevoeligheid testen fluconazol en echinocandine medicijnen 5,16, namelijk combinatoriële therapie van diclofenac en caspofungine 17 bestuderen. Recenter passen wij deze voor gebruik in BALB / c muizen 18,19. Invergelijking met andere in vivo modellen, het belangrijkste voordeel van deze subcutaan model is de mogelijkheid om meerdere biofilms per dier ontwikkeld binnen het lumen van geïmplanteerde katheter stukken te bestuderen.
Om het aantal proefdieren verminderen, hebben wij dit model aan de ontwikkeling van C. bestuderen aangepast albicans biofilms niet-invasief met behulp van bioluminescentie beeldvorming (BLI) 18,19. Deze werkwijze bleek een krachtige techniek die kan worden gebruikt om biofilms kwantificeren meten van de specifieke BLI signaal op het gebied van belang (in ons geval het gebied van geïmplanteerde katheters), het vermijden van dierlijk offer. In vergelijking met bacteriën die zowel het gen en het substraat vereist voor de bioluminescentie reactie kan uitdrukken door de invoering van een specifiek lux operon 20 meeste eukaryote organismen, zoals C. albicans, zijn afhankelijk van de heterologe expressie van een luciferase gen in combinatie met deexterne toediening van een specifiek substraat, zoals D- luciferine of coelenterazine 21. Waarschijnlijk door de aanwezigheid van de schimmel celwand en C. albicans morfogenese, de intracellulaire aflevering van het substraat voor het enzym luciferase was een grote uitdaging 21. Om dit probleem op te lossen, Enjalbert et al. 22 gemanipuleerde een stam waarin een synthetisch C. albicans-codon geoptimaliseerde versie van het gen voor de natuurlijk uitgescheiden Gaussia princeps luciferase (Gluc) werd gefuseerd met de C albicans PGA59 gen, een GPI verankerde celwand eiwit. Door de aanwezigheid van luciferase in de celwand, kunnen problemen met de intracellulaire beschikbaarheid van het substraat worden voorkomen. Dit bijzondere systeem werd gebruikt om oppervlakkige infecties veroorzaakt door C. bestuderen albicans 22. Zeer recent BLI werd ook gebruikt om de progressie van orofaryngeale candidiasis en mogel followe behandeling 23. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van BLI als een veelbelovende techniek infecties veroorzaakt door vrij levende cellen maar ook device geassocieerde infecties te bestuderen.
In deze studie beschrijven we de C. albicans biofilm ontwikkeling van polyurethaan katheter stukken in BALB / c muizen en kwantificering middels BLI. We geven een gedetailleerd protocol van in vitro kolonisatie van polyurethaan katheters gedurende de adhesie gevolgd door implantatie in muizen en verdere biofilm ontwikkeling in levende dieren. Naast het meten van het BLI-signaal uitgezonden door de C. albicans cellen, ook de kolonievormende eenheden vergelijking met de standaard techniek voor biofilm fungale belasting kwantificering bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van de KU Leuven (projectnummer 090/2013). Behouden dieren in overeenstemming met de KU Leuven dierverzorging richtlijnen.
1. C. albicans Growth
- Vierentwintig uur vóór het begin van het dierproeven voorbereiden YPD platen door 10 g gistextract gegranuleerd, 20 g bacteriologische pepton en 15 g gegranuleerd agar. Make up volume tot 900 ml met Milli-Q water en autoclaaf.
- Voeg 50 ml steriele 40% glucose. Meng goed en giet het in petrischaaltjes. Laat agarplaten afkoelen en stollen.
LET OP: In deze studie gebruiken twee stammen, namelijk wild type C. albicans SC5314 - GLUC negatieve stam (aangeduid als WT) en C. albicans SKCA23 stam, die een wild-type C. albicans SC5314 getransformeerd met Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide op 22 .In deze stam (vernoemd SKCA23- ACTgLuc) Gluc werd gefuseerd aan het endogene PGA59 gen onder controle van WERKW1 (actine) promoter (deze promotor actief in gist, en hyfen stadium schimmelgroei). Deze stam kan worden aangevraagd bij het laboratorium van prof Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, België. Plasmide Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 werd gedoneerd door Prof. C. d'Enfert, Instituut Pasteur, Parijs, Frankrijk. - Behouden beide stammen in glycerol voorraad winkel en bij -80 ° C.
- Voorafgaand aan een experiment streak stammen op een YPD plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende de nacht.
2. Catheter Pieces Voorbereiding
- Voor het experiment bepalen hoeveel katheters nodig. Het is mogelijk om implanteren tot 6 katheter stuks per muis (3 catheters links en 3 catheter aan de rechterzijde van het dier (Figuur 2A).
- Vierentwintig uur voorafgaand aan het dier een operatie, open de verpakkingleeftijd met drievoudig-lumen katheter onder de bioveiligheidskast. Verwijder alle overbodige delen met steriel pincet en snij het deel verbonden aan de katheter met een steriele scalpel. Plaats liniaal onder de plastic verpakking en snij polyurethaan katheter stukken van exact 1 cm volgens de schaal op de liniaal (figuur 1).
OPMERKING: Het is belangrijk te vermelden dat deze soort katheter stuk is niet fosforescerende en dus geschikt voor BLI 18,19. - Plaats een maximum van 15 gesneden katheter stukken (stap. 2.2) in 2 ml microcentrifugebuisjes. Bereiden altijd 3 stuks extra, die worden gebruikt om de hoogte van bijgevoegde Candida cellen op inventarisatie van het apparaat na afloop van hechting.
- Supplement katheters met ongeveer 1,8 ml van 100% foetaal runderserum (FBS).
- Krachtig vortex en voeg extra 100-200 ul 100% FBS. Volledig toereikend katheter stukken met serum.
- Incubeer bij 37 ° C geïncubeerd.
3 dieren en onderdrukking van het immuunsysteem
- Houd vrouwelijke BALB / c-muizen (ongeveer 8 weken oud) in individueel geventileerde filter top kooien met gratis toegang tot de standaard voedsel en water ad libitum.
- Initiëren onderdrukking van het immuunsysteem 24 uur voor de operatie dier door toevoeging van dexamethason (0,4 mg / l) aan het drinkwater van de dieren. Om elke bacteriële besmetting van de gastheer vermijden, vullen het drinkwater met antibioticum, bijvoorbeeld ampicilline natrium- poeder (0,5 g / l).
- Blijf immunosuppressie van dieren tijdens het gehele experiment (tot 6 dagen).
4. Ex vivo C. albicans Hechting op FBS-gecoate Polyurethaan Substrates
- Breng elk serum beklede katheter stuk in een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Schraap sommige C. albicans-cellen gegroeid op YPD platen (stap 1) en suspendeer deze in 1 mi PBS.
- Verdunde Kandida-cellen (1: 100) in een afzonderlijke microcentrifuge buis. Neem 10 pi van de verdunde monster en toe te passen op een mobiele telkamer. Tellen minstens 16 kleine vierkantjes.
- Bereid Candida cellen (elke stam apart) in RPMI 1640 medium tot een eindconcentratie van 5 x 10 4 cellen / ml.
- Voeg 1 ml celsuspensie aan elk serum-gecoate katheter stuk.
- Krachtig Vortex en ervoor te zorgen dat de katheters worden ondergedompeld in het medium en niet drijven op de top.
- Incubeer katheters bij 37 ° C gedurende 90 min (duur van hechting).
- Verwijder katheters met steriele pincet en wassen tweemaal met 1 ml PBS. Tijdens deze stap zorgen dat de wasvloeistof gaat door het lumen van de katheter te houden in verticale stand terwijl zachtjes spoelen van de katheters. Belangrijk gebruik geen sterke stromen kan leiden tot het verwijderen van aangehechte cellen.
- Transfer elk gewassen katheter om een schone microcentrifugebuis (een stuk per tube).
- Plaats op ijs en blijf daar tot een operatie.
5. Anesthesie
- Bereid verdoving door mengen van 75 pl ketamine (100 mg / mL) met 100 pl medetomidine (1 mg / ml) en 825 pl steriele zoutoplossing. Dien intraperitoneaal (ip) 60-80 gl anestheticum cocktail per 10 g lichaamsgewicht, resulterend in een dosis van 45-60 mg / kg ketamine en 0,6-0,8 mg / kg medetomidine.
- Voor omkering van anesthesie, verdun 50 ui atipamezol (5 mg / ml) in 4,95 ml zoutoplossing, toedienen ip 100 ul per 10 g lichaamsgewicht als tegengif, resulterend in een dosis van 0,5 mg / kg.
- Na injectie van verdoving, plaats het dier in een aparte kooi en wacht tot het volledig in slaap.
- Bevestig de juiste verdoving van het dier door licht snuifje huid en teen knijpen, die geen schade aan de huid veroorzaken. Alle waargenomen beweging geeft aan dat het dier onvoldoende verdoofd te opereren. Als dit gebeurt, wacht een couple minuten langer totdat het dier geen tekenen van beweging op de huid of teen knijpen tonen.
6. Dierlijke Chirurgie
- Transfer verdoofd dier uit de kooi op een schoon weefsel geplaatst op het verwarmingselement, voorverwarmd tot 37 ° C (figuur 2A (1)).
OPMERKING: Een goedkoper alternatief is om elektrisch verwarmde dekens gebruiken. Het is ook mogelijk isothermische pads, die omhoog worden opgewarmd in de magnetron voor het dier operatie gebruikt. - Toepassing oogzalf op de ogen.
- Scheer de lage rug van het dier met een elektrisch scheerapparaat. Verwijder alle haren van dieren en de overdracht van dier op van een schone tissue. Ontsmet de huid (bijvoorbeeld met 1% jood isopropanol of 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol) en laat het gedesinfecteerde ruimte drogen ongeveer 1 min (Figuur 2A, (2)).
- Maak een kleine incisie in de huid (één links en één rechts van het dier) (ongeveer 0,5 &# 8211; 1 cm) (Figuur 2A, (3)).
- Ontleden de subcutis met een schaar tot twee subcutane tunnels te creëren. Elke tunnel moet ongeveer 1,5 cm lang en 1 cm breed.
- Plaats drie katheter stukjes, die eerder geïnfecteerd met Candida, in elke tunnel. Zorg ervoor dat de katheters liggen naast elkaar in een horizontale opstelling en dat deze niet op elkaar om de implantatie van zes katheter fragmenten in totaal mogelijk (figuur 2A (4)).
- Sluiten insnijdingen met hechtingen. U kunt ook gebruik maken van Dermabond om de wond te sluiten.
- Desinfecteer de wond zeer voorzichtig met 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol of jodium isopropanol (1%).
- Pas lokale verdoving (xylocaine gel, 2%) direct op de wond.
- Dien omkering van de anesthesie (protocol 5, stap 2): intraperitoneaal 100 ul per 10 g lichaamsgewicht.
- Transfer dier naar een schone kooi eerder op een verwarmingsplaat geplaatst. Houd het dierafzonderlijke warme tot het dier volledig wakker. Ondertussen blijven met de werking en implantaat van het volgende dier. Zodra alle bediend dieren helemaal wakker. Over te dragen aan een kooi. Regelmatig toezicht op dieren.
7. bioluminescentiebeeldvorming: Voorbereiding van Coelenterazine (CTZ), het substraat voor G. princeps luciferase
- Bereid vers coelenterazine (CTZ) voorraadoplossing door het oplossen van 5 mg / ml CTZ in aangezuurde ethanol of volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid 1,2 mM werkoplossing door verdunning van de stockoplossing 01:10 in steriele PBS.
OPMERKING: Injecteer 100 ui CTZ werkoplossingen subcutaan in de omgeving van de katheters. Gebruik van insuline spuiten voor subcutane injectie van CTZ. - Houden CTZ in het donker Always (bijvoorbeeld betrekking microcentrifuge buisjes met CTZ met aluminiumfolie). Bewaar de stockoplossing bij -80 ° C gedurende de duur van de experimenten. 8. bioluminescentiebeeldvorming
- Initialiseer de BLI camera.
- Verdoven het Dieren met behulp van een inductie in. Gebruik een gasmengsel van isofluraan in zuurstof, N2O / O2 of lucht bij 2-3%.
- Na inductie, onderhouden anesthesie in het vak inductie en in de beeldvorming kamer bij 1,5-2%.
- Voordat de opnamesessie, plaatst de beeldplaat in de stand A, hetgeen overeenkomt met een FOV van 10 cm. Zorg ervoor dat de juiste positie van de anesthesie outlets en dier door het plaatsen van een slapend dier in de doos.
- Neem paar foto tot dier in de gewenste positie beeldvorming, in het FOV direct onder de camera.
- Bereid twee insuline injectiespuiten elk 100 pl van de CTZ werkoplossing.
- Plaats één dier op de bank en houd het in slaap door middel van een neuskegel verstrekken gas anesthesie.
- Breng de naalden van de spuiten in een plaats rond katheters subcutaan en injecteerde CTZ gelijktijdig bovenop de katheters.
- Onmiddellijk na de injectie, plaatst het dier op de warme plaat in de doos camera en start de afbeelding bioluminescentie overname.
- Verwerven opeenvolgende scans met opnametijden van 20 tot 60 seconden (afhankelijk van de signaalintensiteit) totdat de maximale signaalintensiteit wordt bereikt. Tijdens het verwerven van het volgende frame, meet de BLI signaalintensiteit van de eerder verworven beelden door een ROI van elk katheters trio en meten foton flux door deze ROI.
- Herhaal vanaf stap 7 voor het volgende dier (en).
- Na beeldvorming terug dieren naar de kooi. Herhaal BLI tijdens een experiment voor longitudinaal, niet- invasieve opvolging van biofilm vorming.
- Analyseer de BLI gegevens met behulp van Living Image software. Plaats een rechthoekig ROI van vaste grootte over elke katheter trio en meet de fotonflux (straling) door elke ROI. Herhaal dit voor elk dier.
- Rapportde BLI signaal intensiteit van elke katheter trio als fotonflux per seconde. Vertegenwoordigen de BLI gegevens op een logaritmische schaal door het uitzetten van het gemiddelde en SD van het foton flux per seconde voor elke groep. Uitvoeren statistische analyse op de log 10 getransformeerde gegevens.
- Bereid microcentrifuge buisjes met 1 ml PBS, één voor elke katheter apparaat en bewaar ze op ijs.
- Euthanaseren de dieren door cervicale dislocatie (figuur 2B (1)).
- Ontsmet de huid van de rug met 0,5% chloorhexidine in 70% alcohol of met jodium isopropanol (1%).
- Maak een insnijding (ongeveer 3 cm) boven de katheters.
- Knip subcutane weefsel en een verwijder de catheter fragmenten door een onder het subcutane weefsel met steriele pincet (Figuur 2B, (2)).
- Handvat katheter zachtjes in verticale positie en was het tweemaal met 1 ml steriel PBS. Plaats elke katheterstuk in een aparte microcentrifugebuis (bereid in trap 1).
- Ultrasone trillingen katheters eerder in 1 ml PBS gedurende 10 min bij 40000 Hz in een waterbad ultrasoonapparaat en plaats ze op ijs.
- Na sonicatie, krachtig vortex gedurende 30 seconden en plaats weer op ijs.
- Bereid twee extra microcentrifugebuisjes met 900 ul van PBS.
- Maak 1:10 en 1 100 verdunningen van uw oorspronkelijke monster (degene die de katheter bevat) en houdt al microcentrifugebuisjes op ijs.
- Plaat 100 pl van de oorspronkelijke monsters, 1:10 en 1: 100 verdunningen op YPD agar platen in tweevoud.
- Incubeer de platen gedurende 2 dagen bij 37 ° C en tellen CFU.
- Tel de kolonies gegroeid op YPD agarplaten (telbare hoeveelheid kolonies, maximaal 300 kolonies / plaat) en vermenigvuldigt deze vervolgens met de juiste Dilutie factor (1x-origineel, 10x of 100x verdunning). Verder vermenigvuldigen elke katheter stuk 10x, hetgeen overeenkomt met de uiteindelijke hoeveelheid kolonies in 1 ml buisje met de katheter. Breng het uiteindelijke bedrag van de kolonies tot 10 cellen / katheter stuk met standaarddeviatie (SD) log. Versneld gegevens als gemiddelde ± SD.
- Plaats alle waarden voor elke katheter en specifieke groep in een spreadsheet en / of statistische programma voor de bovengenoemde berekeningen en statistische analyses. Geef aan specifieke groepen te vergelijken, dwz WT versus mutant of 2 dagen vs. 6 dagen biofilmvorming en het uitvoeren van ongepaarde t-toets en ANOVA met Tukey post-test op de log10-getransformeerde gegevens.
- Versneld het niveau van significantie door een p waarde. In deze studie geven betekenis als p waarde <0,05, als volgt weergegeven: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0.0005.
9. Catheter Explantatie
10. De kwantificering van de biofilm-geassocieerde cellen door Colony Forming Units Graaf (CFU's) en statistische analyses van de resultaten
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In deze studie tonen we de operatie van katheter implantaat en explantaat tijdens de in vivo C. albicans biofilm ontwikkeling in een muis. Bovendien geven we de kwantificering van volwassen biofilms niet alleen klassieke CFU opsomming, maar ook door BLI.
Zoals getoond in figuur 1A, werden niet-fosforescerende polyurethaan katheter stukjes gesneden in 1 cm inrichtingen en vervolgens bekleed met serum. Deze stap is zeer belangrijk omdat het laat Candida-cellen om sneller te hechten aan het substraat vergeleken met niet-serum beklede implantaten 15. Het is belangrijk dat voorafgaand aan elke C tot zwijgen albicans experiment we eerst een reportage over de achtergrond luminescentie van onze apparaten 18. Deze stap is essentieel vóór alle BLI vanwege hoge fosforescentie van de inrichting zal interfereren met de evaluatie van de specifieke lichtgevende signaalintensiteit en signaal kinetiek van gLuc-expressie brengen. Vervolgens C. albicans cellen worden geïncubeerd met het serum beklede katheter stukken. Katheter fragmenten worden geïmplanteerd op de rug van het dier na de subcutane incisie (Figuur 2A). In dit in vivo opzetten, twee insnijdingen zijn uitgevoerd (één rechts en één aan de linkerzijde van de rug van een muis) gevolgd door de vorming van subcutane tunnels in elke incisie (Figuur 2A (3)). Vervolgens drie apparaten, die eerder geïnfecteerd met Candida cellen worden geïmplanteerd in elk operatiegebied (Figuur 2A (3 en 4)). Deze opzet stelt ons in staat om te studeren tot zes biofilms per dier. Het is opmerkelijk dat twee vestigingsplaatsen bieden een mogelijkheid om biofilmvorming te bestuderen door twee verschillende stammen van belang, bijvoorbeeld wildtype en mutante in hetzelfde dier. Figuur 2B toont de wond met katheters voor de inrichting explantaat en volgende wasstappen.Biofilms ontwikkeld in het achterste deel van het dier werden onderzocht bioluminescentie signaal metingen. Een van de representatieve dieren waarbij de bioluminescentie signaal samen met rechthoeken karakterisering van de gebieden van belang (ROI) wordt getoond in figuur 3. Na de laatste BLI tijdstip, katheters worden geëxplanteerd, gesoniceerd en vervolgens gewerveld en verder beoordeeld op de biofilm vormende cellen kwantificering van CFU's. Data analyse waaruit de log10 CFU's die uit elk katheter stuk na biofilm ontwikkeling en explantatie worden getoond in Figuur 4A. Daarnaast werden CFU vergeleken met BLI signaalintensiteit en de gegevens worden getoond in figuur 4B. Negentig minuten na implantatie een duidelijk BLI signaal wordt geproduceerd door de ACTgLuc -waar biofilms, terwijl er in het wild type stam, nauwelijks licht wordt geproduceerd; De intensiteit van het licht gedetecteerd van de ACTgLuc -waarbiofilms aanzienlijk toe naarmate de biofilm wordt gevormd, hier volgens dezelfde muis (Figuur 4C). Deze toename van het licht volgt dezelfde trend als de toename van de CFU's per biofilm (figuur 4A). In onze experimenten ook waargenomen dat een normale wildtype stam (niet ontworpen om luciferase expressie) resulteert ook in de productie van licht na toevoeging van de ondergrond. De foton flux was significant lager dan die verkregen voor de gemanipuleerde stam.
Samengevat tonen onze gegevens dat BLI is een techniek te volgen en kwantificeren vivo volwassen C. albicans biofilm vorming in een subcutane muismodel.
Figuur 1: Bereiding van polyurethaan inrichtingen Polyurethaan deel van de katheter gesneden in 1 cm gesneden.. Plastic pocKet bevattende katheter geopend onder steriele omstandigheden en alle delen, behalve katheter uit de verpakking. Ten tweede plaatst heerser onder de plastic zak en snijd precies 1 cm polyurethaan stukken. Dergelijke inrichtingen worden vervolgens verdeeld microcentrifugebuizen (max 15 stuks / buis) en ondergedompeld in 100% foetaal runderserum, gevolgd door overnacht incubatie bij 37 ° C.
Figuur 2: belangrijke stappen tijdens het dier operatie. (A) Procedure katheter implantaat. (1) Plaats verdoofd dier op een warme pad met papieren tissue en breng de oogzalf op de ogen. (2) Scheer onderste deel van de rug en te ontsmetten zijn. (3) Maak twee kleine (ong. 0.5 cm) incisies door de huid links en rechts van de rug. Maak subcutane tunnel binnen elke incisie en plaats 3 katheters binnen. (4) Sluit de wo und met hechtingen en plek dier op een warme pad om te herstellen. (B) Procedure van de verwijdering van de katheter. (1) Plaats geofferd dier op een pad en desinfecteren van de geopereerde zijde met katheters. Snijd de wond recht boven de katheters. (2) Neem elke katheter voorzichtig en was tweemaal met 1 ml PBS. Plaats de aparte microcentrifugebuis.
Figuur 3:. Beeld In vivo BLI Bioluminescence signaal meting uit één vertegenwoordiger muis afgebeeld na 6 dagen van biofilm ontwikkeling. De kwantificering van de signaalintensiteit wordt uitgevoerd door een gebied van belang (ROI) (rechthoekige) rondom de katheters gevolgd door meting van de foton flux per seconde door elke ROI.
fig4highres.jpg "/>
Figuur 4: Kwantificering van rijpe Candida albicans biofilms door kolonievormende eenheden (CFU's) en BLI. (A) In vivo rijpen C. albicans SKCA23- ACTgLuc en SC5314 (WT) biofilm kwantificering door Log10 CFU's na 90 min, 2 dagen en 6 dagen biofilm ontwikkeling. (B) Bioluminescence signaalintensiteit kwantificering van in vivo biofilms gevormd door SKCA23- ACTgLuc en door C. albicans WT. Signaal werd bepaald na 90 min (periode van hechting), 2 dagen en 6 dagen van de biofilm ontwikkeling. Als controle gebruikten we muizen die werden geïmplanteerd met niet gekoloniseerde katheters en werden subcutaan geïnjecteerd met CTZ. De fotonflux verkregen in deze muizen levert ons achtergrondsignaal (BG). Gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Statistische significantie wordt als volgt aangegeven: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0.0005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De toepassing van diermodellen en vooral knaagdiermodellen, voor studies gewijd aan microbiële biofilms zeer belangrijk als gastheer immuunsysteem is een essentiële factor bij biofilmvorming die in vitro modellen kunnen niet verklaren. In deze studie beschrijven we een relatief eenvoudige subcutane C. albicans biofilm muismodel, die gemakkelijk in een onderzoekslaboratorium kan worden vastgesteld en geen sterke technische vaardigheden vereist. Dit model is aanvankelijk ontwikkeld Staphylococcus epidermidis biofilmvorming studie in een rat 24.
In de gepresenteerde model, werden serum gecoat polyurethaan katheters geprikkeld met Candida cellen ex vivo gedurende de hechting (90 min, 37 ° C). Dat eerste in vitro stap zou worden als een beperkende factor vanwege gebrek aan het immuunsysteem in het eerste stadium van het biofilm infectie verwerken. Na hechting en vóórcatheter implantaat worden niet-inrichting geassocieerde cellen verwijderd door wassen. Het vermijden van de wasstap na de periode van de hechting kunnen oncontroleerbare hoeveelheid cellen in verband met het apparaat te maken. Vanwege deze reden stellen wij voor om katheters te wassen voordat het implantaat en dus, om haar ontwikkeling te starten vanaf gehandeld-cellen. Na deze initiële hechting periode, catheters bevatten ongeveer 2,0-2,5 Log 10 CFU / apparaat verspreid langs de katheterlumen 15. Tijdens deze fase maakt Candida kiembuizen, die bevestigd op de ondergrond.
Om de situatie bij gehospitaliseerde patiënten waarvan het immuunsysteem wordt vaak aangetast lijken, we immunosuppressie de ratten subcutaan in ons modelsysteem 15. Gedeeltelijke aantasting van het immuunsysteem van een rat, voorafgaand aan de implantatie apparaat en gedurende de biofilm ontwikkeling resulteerde in verhoogde reproduceerbaarheid van biofilm-vormende cellen afkomstig uitkatheters geïmplanteerd in dezelfde gastheer en ook van apparaten verkregen van extra dieren. Vanwege deze bevindingen suggereren wij de muizen immunosuppress vóór katheter implantaat en ook tijdens de periode van biofilmvorming. Echter, onze resultaten tonen dat de variabiliteit in immunocompetente muizen veel minder is in vergelijking met die waargenomen bij ratten, waarin dat muizen modelsysteem geschikt voor het bestuderen van de rol van het gastheerimmuunsysteem op biofilms maakt. Bij ons origineel diermodel en in hetzelfde model vertaald naar muizen, volwassen K. albicans biofilms ontwikkelen binnen 48 uur aangetoond door de soortgelijke hoeveelheid CFU en biofilm tussen 2 en 6 dagen 15,18,19.
Subcutaan biofilm-model werd succesvol gebruikt om biofilm ontwikkeling volgen door in verschillende mutanten 15. Het is eerder aangetoond door Nobile et al. 25 dat C. albicans BCR1 Δ / BCR1 Δ verzuimdvorm biofilms in een centraal veneuze katheter (CVC) model. Deze stam weergegeven rudimentaire biofilm functies in ons subcutane model wijst erop dat de fenotypische veranderingen in de CVC model kan worden opgenomen in het subcutane model 15.
Vergeleken met andere bestaande modellen, namelijk., CVC type of prothese stomatitis type 8,9,11, subcutane voorbeeld laat toe biofilm ontwikkeling in verschillende katheter delen verkregen uit één dierlijke volgen, waardoor het aantal dieren nodig voor biofilm studies gereduceerd. Ondanks deze voordelen, kan een tekortkoming het gebrek aan bloedtoevoer die kunnen leiden tot bepaalde deprivatie van voedingsstoffen in de biofilm worden. Derhalve, op termijn van voedingsstoffen leveringen en omgevingsomstandigheden, het subcutaan-model is meer gerelateerd te-device geassocieerde infecties ontwikkeld op gewrichtsprothesen stemprotheses en pacemakers zijn dan degenen opgericht op Intraveneuze katheters. Nog belangrijkervertalen van de rat subcutaan biofilm systeem muizen maakte dit diermodel geschikt BLI, die verder verlaagt en belangrijker, het aantal benodigde dieren. Bovendien is het vertalen van de rat-model aan muizen maakt het gebruik van transgene muismodellen voor de gastheer factoren to-katheter geassocieerd infectie studies relevant onderzoek.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik BLI biofilms te kwantificeren levende dieren ligt niet alleen in de niet-invasieve karakter van deze werkwijze, maar ook in zijn vermogen om dynamische informatie over de ontwikkeling van een infectie. In dit onderzoek GLUC uitgedrukt op het celwand C. albicans toegestaan betere bereikbaarheid en directe interactie met de ondergrond coelenterazine, die cruciaal zijn voor een detectie van bioluminescentie signaal in vivo zijn. In de studie van Vande Velde et al. 18, waren we in staat om de bioluminescent signaal van C. volgen albicans biofilms ontwikkeld op foreign lichamen in vitro. De BLI intensiteit van het signaal sterk overeen met de resultaten van aanvullende biofilm kwantificatie technieken, dat wil zeggen, CFU's vastberadenheid en XTT- reductie assay gegevens. Naast deze resultaten, hebben we aangetoond dat de bioluminescentie signaal van in vivo biofilms was in overeenstemming met de hoeveelheid biofilm geassocieerde cellen hersteld van geëxplanteerde biofilms. Daarnaast Vande Velde et al. 18 aangetoond dat BLI kan worden om biofilm ontwikkeling te volgen door een wildtype en door C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (biofilm-deficiënte stam) in hetzelfde dier tegelijk. Dergelijke bevindingen het gebruik van BLI ondersteunen sterk tijdens het onderzoek gewijd aan de beoordeling van het tijdsverloop van biofilm ontwikkeling en infectie bij hetzelfde dier.
Hierbij beschreven we een experimentele procedure voor in vivo subcutane implantatie van Candida geïnfecteerde apparaten met het toezicht a of in vivo biofilm ontwikkeling door BLI. Samen genomen, BLI toonde een betrouwbare techniek, die ons toeliet om een infectie te volgen in de tijd het vermijden van dierenoffers op elk tijdstip van de gegevens analyseert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast extract granulated | Merck | MERC1.03753.0500 | |
| Bacteriological peptone | Oxoid | LP037B | |
| Agar granulated | Difco | 214530 | |
| D-(+)-glucose | Fluka | 49159-5KG | |
| Phosphate buffered saline | Prepared in the laboratory | for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 | |
| RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate | Sigma | R6504-1L | Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing |
| 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma | M1254 | MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0) |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730) | BBraun | CV-15703 | Polyurethane part cut into 1 cm pieces |
| Dexamethasone | Fagron SAS, France | 611139 | Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml) |
| Ampicillin | Duchefa Biochemie, The Netherlands | A0104 | Antibacterial prophylaxis |
| Ketamine 1000 | Pfizer | 804 119 | Anesthetic |
| Domitor | Pfizer | 134737-1 | Anesthetic |
| Antisedan | Pfizer | 134783-2 | Reversal of anesthesia |
| Xylocaine gel (2%) - this is Linisol | AstraZeneca | 352 1206 | Local anesthetic for the skin |
| Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment | To prevent drying and infection of eyes | ||
| Coelenterazine | Prolume (Nanolight) | NF-CTZ-FB | Light sensitive agent (must be kept in the dark) |
| Iodine isopropanol (1%) | 3M™ DuraPrep™ | Disinfectant for the skin | |
| 0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol. | Cedium | Disinfectant for the skin | |
| Equipment | |||
| Cell counting chamber | |||
| Insulin syringes (0.3 ml) | Terumo Myjector 29G | 324826 | For injection of coelenterazine |
| Electric razor | For small animals | ||
| Sterile surgical tools | Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel | ||
| Heating pad | Leica | 14042321474 | |
| Skin suture | Johnson&Johnson | K890H | Surgical thread, needle |
| Water bath sonicator | Branson 2210 | ||
| BLI camera (IVIS Spectrum) | Perkin Elmer, Alameda | IVISSPE | |
| Living Image software | Perkin Elmer, Alameda | (version 4.2) |
References
- Yapar, N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 10, 95-105 (2014).
- Tournu, H., Van Dijck, P. Candida biofims and the host: models and new concepts for eradication. Int J Microbiol. 2012, 845352 (2012).
- Taff, H. T., Mitchell, K. F., Edward, J. A., Andes, D. R. Mechanisms of Candida biofilm drug resistance. Future Microbiol. 8 (10), 1325-1337 (2013).
- Mathé, L., Van Dijck, P. Recent insights into Candida albicans biofilm resistance mechanisms. Curr Genet. 59 (4), 251-264 (2013).
- Kucharíková, S., et al. Activities of systematically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans. biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2365-2368 (2013).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents Chemother. 46 (6), 1773-1780 (2002).
- Ramage, G., et al. Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 57 (5), 2369-2371 (2013).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Schinabeck, M. K., et al. Rabbit model of Candida albicans biofilm infection: liposomal amphotericin B antifungal lock therapy. Antimicrob Agents Chemother. 48 (5), 1727-1732 (2004).
- Lazzell, A. L., et al. Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. J Antimicrob Chemother. 64 (3), 567-570 (2009).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Wang, X., Fries, B. A murine model for catheter associated Candiduria. J Med Microbiol. 60 (10), 1523-1529 (2011).
- Harriott, M. M., Lilly, E. A., Rodriguez, T. E., Fidel, P. L. J., Noverr, M. C. Candida albicans forms biofilms on the vaginal mucosa. Microbiology. 156 (12), 3635-3644 (2010).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characerterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4, e7976 (2009).
- Ricicová, M., Kucharíková, S., Tournu, H., Hendrix, J., Bujdáková, H., Van Eldere, J., Lagrou, K., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiol. 156, 909-919 (2010).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., Lagrou, K. In vivo efficacy of anidulafungin against Candida albicans mature biofilms in a novel rat model of catheter-associated candidiasis. Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4474-4478 (2010).
- Bink, A., et al. The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. J Infect Dis. 206 (11), 1790-1797 (2012).
- Van de Velde, G., Kucharíková, D., Schrevens, D., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cell Microbiol. 16 (1), 115-130 (2014).
- Van de Velde, G., Kucharíková, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging of fungal biofilm development in live animals. Methods in Molecular Biology. 1098, 153-167 (2014).
- Gahan, C. G. The bacterial lux reporter system: applications in bacterial localisation studies. Curr Gene Ther. 12 (1), 12-19 (2012).
- Doyle, T. C., Nawotka, K. A., Kawahara, C. B., Francis, K. P., Contag, P. R. Visualizing fungal infections in living mice using bioluminescent pathogenic Candida albicans strains transformed with the firefly luciferase gene. Microb Pathog. 40 (2), 82-90 (2006).
- Enjalbert, B., et al. A multifunctional synthetic Gaussia princeps luciferase reporter for live imaging of Candida albicans infections. Infect Immun. 77 (11), 4847-4858 (2009).
- Mosci, P., et al. A novel bioluminescence mouse model for monitoring oropharyngeal candidiasis in mice. Virulence. 4 (3), 250-254 (2013).
- Van Wijngaerden, E., et al. Foreign body infection: a new rat model for prophylaxis and treatment. J. Antimicrob. Chemoth. 44 (5), 669-674 (1999).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr. Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
