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Medicine

Candida albicans biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging

doi: 10.3791/52239 Published: January 27, 2015

Abstract

Candida albicans développement de biofilm sur des surfaces biotiques et / ou abiotiques représente une menace spécifique pour les patients hospitalisés. Jusqu'à présent, C. biofilms albicans ont été étudiés principalement in vitro, mais il ya un besoin crucial pour une meilleure compréhension de ce processus dynamique dans des conditions in vivo. Nous avons développé un modèle de rat sous-cutanée in vivo pour étudier C. albicans formation de biofilm. Dans notre modèle, multiple (jusqu'à 9) appareils infectés par Candida sont implantés à la partie arrière de l'animal. Cela nous donne un avantage majeur sur le système de modèle de cathéter veineux central car il nous permet d'étudier plusieurs biofilms indépendants dans un animal. Récemment, nous avons adapté ce modèle pour étudier C. le développement de biofilm albicans chez la souris BALB / c. Dans ce modèle, mûrir C. biofilms albicans développent dans les 48 heures et démontrent l'architecture du biofilm tridimensionnelle typique. La quantification de biofilm fongiqueest traditionnellement analysé post-mortem et exige le sacrifice d'accueil. Parce que cela nécessite l'utilisation de nombreux animaux pour réaliser des études cinétiques, nous avons appliqué la bioluminescence imagerie non invasive (BLI) de suivre longitudinalement dans vivo mûrir C. albicans biofilms développer dans notre modèle sous-cutanée. C. albicans cellules ont été modifiées pour exprimer le gène de la luciférase de Gaussia princeps (Gluc) fixée à la paroi cellulaire. Le signal de bioluminescence est produite par la luciférase qui convertit la coelentérazine de substrat ajouté à la lumière qui peut être mesurée. Le signal BLI ressemblait nombre de cellules obtenues à partir de cathéters explantées. Imagerie non invasive pour quantifier la formation de biofilm in vivo fournit des applications immédiates pour le dépistage et la validation de médicaments antifongiques dans des conditions in vivo, ainsi que pour les études basées sur les interactions hôte-pathogène et contribuant à une meilleure compréhensiontion de la pathogenèse des infections liées aux cathéters.

Introduction

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Candida albicans est un organisme commensal, qui se trouve à différents sites d'individus en bonne santé, par exemple sur la peau ou en tant que partie de la flore vaginale et gastro-intestinal. Cependant, dans hospitalisé, et surtout les patients immunodéprimés, il peut provoquer un large éventail d'infections 1. Chez ces individus, le système immunitaire est affaibli permet aux cellules de Candida pour diffuser dans la circulation sanguine et envahissent les tissus profonds provoquant des infections potentiellement mortelles. En outre, la présence de substrats abiotiques tels que des cathéters veineux centraux et des voies urinaires, des soupapes et des joints cardiaques artificielles peut fournir un créneau pour Candida accessoire 2. Adhérence à ces substrats est un préalable à la poursuite du développement du biofilm, ce qui représente une couche de cellules de levure et hyphes enrobé dans un matériau polymère extracellulaire, constitué principalement de deux polysaccharides. C. albicans cathéter associée au gène infectionssont associés à des taux de mortalité élevé. Une caractéristique générale de biofilms est leur sensibilité diminuée aux antifongiques connus, tels que les azoles 3,4. Seulement nouvelles classes de médicaments antifongiques tels que échinocandines et formulation liposomale d'amphotéricine B se sont révélées actives contre les infections liées aux cathéters 5-7. En raison de biofilm résilience aux antifongiques, les approches thérapeutiques sont très limitées, conduisant souvent à l'enlèvement du cathéter et son remplacement ultérieur comme une solution unique.

La plupart de notre compréhension actuelle de C. le développement de biofilm albicans provient des études in vitro sur des substrats abiotiques tels que le polystyrène, ou des matières plastiques utilisées pour la fabrication des dispositifs mentionnés ci-dessus, ce est à dire, silicone, polyuréthane 2. Ces modèles sont très avancés et essaient d'imiter le plus fidèlement la situation in vivo que possible. Toutefois, ces systèmes ne comportent pas l'écoulement sanguin continu et til système immunitaire de l'hôte. Il en a résulté le développement de systèmes de modèle in vivo, tels que le modèle cathéter veineux central (CVC) 8-10, le modèle de prothèse dentaire de la stomatite candidose buccale 11 et un modèle murin pour cathéter associé candidurie 12. En outre, C. le développement de biofilm albicans a été étudiée in vivo sur les surfaces des muqueuses, telles que celles de la cavité vaginale 13 et 14 par voie orale. Notre laboratoire a contribué à la création d'un sous-cutanée C. modèle de biofilm albicans, qui est basé sur l'implant de morceaux de cathéters infectés sur le dos de rats Sprague-Dawley 15. Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour tester la sensibilité au fluconazole biofilm et échinocandine médicaments 5,16, pour étudier l'effet de la thérapie combinatoire de diclofénac et caspofungine 17. Plus récemment, nous avons adapté ce système pour une utilisation dans souris BALB / c 18,19. Encomparaison avec d'autres modèles in vivo, le principal avantage de ce modèle sous-cutanée est la possibilité d'étudier plusieurs biofilms par animal développé à l'intérieur du lumen de cathéter de pièces implantées.

Pour réduire le nombre d'animaux de laboratoire, nous avons adapté ce modèle pour étudier le développement de C. albicans biofilms non invasive en utilisant l'imagerie par bioluminescence (BLI) 18,19. Cette méthode se est avérée une technique puissante, qui peut être utilisée pour quantifier les biofilms en mesurant le signal spécifique BLI à la région d'intérêt (dans notre cas, la zone de cathéters implantés), évitant le sacrifice animal. Par rapport à des bactéries, qui peut exprimer à la fois le gène et le substrat nécessaire à la réaction de bioluminescence en raison de l'introduction d'un opéron lux 20 spécifique, la plupart des organismes eucaryotes, y compris C. albicans, dépendent de l'expression hétérologue d'un gène de la luciférase couplée à laadministration externe d'un substrat spécifique, telle que D-luciférine ou 21 coelentérazine. Probablement en raison de la présence de la paroi cellulaire fongique et C. albicans morphogenèse, la délivrance intracellulaire du substrat pour l'enzyme luciférase a été un défi principal 21. Afin de résoudre ce problème, Enjalbert et al. 22 conçu une souche où C. synthétique albicans version optimisée codon du gène de la luciférase de Gaussia princeps naturellement sécrétée (Gluc) a été fusionné à l'C. PGA59 gène albicans, une ancre GPI protéine de la paroi cellulaire. En raison de la présence de la luciférase à la paroi cellulaire, des problèmes concernant la disponibilité intracellulaire du substrat pourraient être évités. Ce système particulier a été utilisé pour étudier les infections superficielles provoquées par C. 22 albicans. Très récemment, BLI a également été utilisé pour suivre la progression de la candidose oropharyngée et son possibltraitement de l'e 23. Ces résultats appuient l'utilisation de BLI comme une technique prometteuse pour étudier les infections causées par des cellules vivant en liberté, mais aussi les infections associées aux périphériques.

Dans cette étude, nous décrivons la C. albicans développement d'un biofilm sur des morceaux de cathéters de polyuréthanne dans des souris BALB / c et sa quantification à l'aide de BLI. Nous fournissons un protocole détaillé de la colonisation in vitro de cathéters de polyuréthanne au cours de la période d'adhérence suivie de l'implantation chez la souris et le développement de biofilm subséquente d'animaux vivants. Outre la mesure du signal émis par le BLI C. cellules albicans, on détermine également la unités formant des colonies pour la comparaison avec la technique classique de biofilm fongique charge quantification.

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Protocol

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NOTE: Toutes les expériences animales ont été approuvés par le comité d'éthique de la KU Leuven (numéro de projet 090/2013). Maintenir les animaux conformément aux lignes directrices de soins aux animaux KU Leuven.

1. C. albicans Croissance

  1. Vingt-quatre heures avant le début de l'expérience animale, préparer des boîtes de YPD en ajoutant 10 g d'extrait de levure de granules, 20 g de peptone bactériologique, et 15 g d'agar granulé. Maquillage volume à 900 ml avec de l'eau Milli-Q et autoclave.
  2. Ajouter 50 ml de 40% de glucose stérile. Bien mélanger et verser dans des boîtes de Pétri. Laissez plaques d'agar refroidir et se solidifier.
    NOTE: Dans cette étude, utiliser deux souches de type sauvage, à savoir C. albicans SC5314 - GLUC souche négative (dénommé WT) et C. albicans SKCA23 souche, qui est un type sauvage C. albicans SC5314 transformée avec Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 .Dans cette souche (nommé SKCA23- ACTgLuc) Gluc a été fusionné au gène endogène PGA59 sous le contrôle de ACT1 (actine) promoteur (ce promoteur est actif dans la levure, ainsi que l'étape de croissance des hyphes fongiques). Cette souche peut être demandé au laboratoire du professeur Patrick Van Dijck, KU Leuven, Leuven, Belgique. Plasmide Clp10 :: Act1p-gLUC59 plasmide 22 a été gracieusement offert par le professeur C. d'Enfert, Institut Pasteur, Paris, France.
  3. Maintenir les deux souches de stock de glycérol et conserver à -80 ° C.
  4. Avant toute expérience souches à balayage sur une plaque YPD. Incuber la plaque à 37 ° C pendant la nuit.

2. Préparation cathéter Pieces

  1. Avant l'expérience, déterminer le nombre de cathéters sont nécessaires. Il est possible d'implanter jusqu'à six morceaux de cathéters par souris (3 cathéters à gauche et trois cathéter sur le côté droit de l'animal (Figure 2A).
  2. Vingt-quatre heures avant la chirurgie animale, ouvrez le packâge contenant triple cathéter à sous le cabinet de sécurité biologique. Retirez toutes les pièces inutiles avec pinces stériles et coupez la partie attachée au cathéter avec un scalpel stérile. Placez la règle sous le paquet en plastique et couper des morceaux de cathéter de polyuréthane d'exactement 1 cm selon l'échelle sur la règle (Figure 1).
    NOTE: Il est important de mentionner que ce type de pièce de cathéter ne est pas phosphorescente et donc approprié pour BLI 18,19.
  3. Placez un maximum de 15 pièces de cathéter de coupe (étape. 2.2) dans 2 ml microtubes. Toujours préparer trois morceaux supplémentaires, qui sont utilisés pour énumérer la quantité de cellules de Candida attachés sur le dispositif après la période d'adhésion.
  4. Supplément cathéters à environ 1,8 ml de 100% de sérum bovin fœtal (FBS).
  5. Vigoureusement vortex et ajouter d'autres 100-200 pi de 100% de FBS. Couvrir complètement toutes les pièces de cathéter avec du sérum.
  6. Incuber à 37 ° C pendant une nuit.

    3. Les animaux et la suppression du système immunitaire

    1. Gardez Female souris BALB / c (environ huit semaines d'âge) dans les cages individuellement ventilées haut de filtres avec un accès libre à la nourriture standard et de l'eau ad libitum.
    2. Initier la suppression de système immunitaire 24 heures avant la chirurgie des animaux par l'addition de dexaméthasone (0,4 mg / L) dans l'eau de boisson des animaux. Afin d'éviter toute contamination bactérienne de l'hôte, de compléter l'eau de boisson avec un antibiotique, par exemple, l'ampicilline de sodium en poudre (0,5 g / L).
    3. Gardez immunosuppression des animaux pendant toute l'expérience (jusqu'à 6 jours).

    4. Substrats de polyuréthane ex vivo C. albicans Adhérence sur FBS revêtues

    1. Transférer chaque pièce de cathéter enduites de sérum dans un nouveau tube de 1,5 ml à centrifuger.
    2. Grattez un certain C. albicans cellules cultivées sur des plaques YPD (étape 1) et les suspendre dans 1 ml de PBS.
    3. Diluer Cancellules Dida (1: 100) dans un tube à centrifuger séparée. Prendre 10 pl de l'échantillon dilué et de l'appliquer sur une chambre de comptage de cellules. Comptez au moins 16 petits carrés.
    4. Préparer cellules de Candida (chaque souche séparément) dans du milieu RPMI 1640 à une concentration finale de 5 x 10 4 cellules / ml.
    5. Ajouter 1 ml de suspension cellulaire à chaque élément de cathéter enduites de sérum.
    6. Vigoureusement Vortex et se assurer que les cathéters sont immergés dans le milieu et non flottant au-dessus.
    7. Incuber les cathéters à 37 ° C pendant 90 minutes (durée de l'adhérence).
    8. Retirer les cathéters avec pinces stériles et les laver deux fois avec 1 ml de PBS. Au cours de cette étape se assurer que le fluide de lavage passe à travers la lumière du cathéter en le mettant en position verticale pendant le rinçage très doucement les cathéters. Surtout, ne pas utiliser un fort débit qui peut conduire à l'élimination des cellules attachées.
    9. Transférer chaque cathéter lavé pour un microtube propre (une pièce par tuêtre).
    10. Placez sur la glace et y tenir jusqu'à ce que la chirurgie.

    5. Anesthésie

    1. Préparer anesthésie en mélangeant 75 ul de kétamine (100 mg / ml) avec 100 ul de médétomidine (1 mg / ml) et 825 ul de solution saline stérile. Administrer par voie intraperitoneale (ip) de 60 à 80 pl de cocktail anesthésiant par 10 g de poids corporel, résultant en une dose de 45-60 mg / kg de kétamine et de 0,6 à 0,8 mg / kg de médétomidine.
    2. Par inversion de l'anesthésie, diluer 50 ul atipamézole (5 mg / ml) dans 4,95 ml de solution saline, d'administrer ip 100 ul par 10 g de poids corporel comme antidote, d'où une dose de 0,5 mg / kg.
    3. Après l'injection de l'anesthésie, placer l'animal dans une cage séparée et attendre jusqu'à ce qu'il soit totalement endormi.
    4. Confirmer le bon anesthésie de l'animal par pincement de la peau claire et pincement de l'orteil, qui ne cause pas de dommages à la peau. Tout mouvement observé indique que l'animal ne est pas suffisamment anesthésiée à pratiquer la chirurgie. Si cela se produit, attendez un couple de minutes de plus jusqu'à ce que l'animal ne montre pas de signes de mouvement sur la peau ou pincement de l'orteil.

    6. chirurgie animale

    1. Transfert anesthésié l'animal de la cage sur un tissu propre placée sur le coussin chauffant, pré-chauffé à 37 ° C (figure 2A, (1)).
      NOTE: Une alternative moins coûteuse est d'utiliser les couvertures chauffantes. Il est également possible d'utiliser des serviettes isothermes, qui doivent être réchauffés au micro-ondes avant la chirurgie des animaux.
    2. Appliquer une pommade ophtalmique pour les yeux.
    3. Raser le bas du dos de l'animal avec un rasoir électrique. Retirez tous les poils d'animaux et de transférer des animaux sur un tissu propre. Désinfecter la peau (par exemple, 1% d'isopropanol avec de l'iode ou 0,5% de chlorhexidine à 70% d'alcool) et quitter la zone désinfecté à sécher pendant environ 1 min (Figure 2A, (2)).
    4. Faire une petite incision dans la peau (un à gauche et l'autre sur le côté droit de l'animal) (environ 0,5 &# 8211; 1 cm) (Figure 2A, (3)).
    5. Disséquer l'hypoderme avec une paire de ciseaux pour créer deux tunnels sous-cutanées. Chaque tunnel devrait être d'environ 1,5 cm de long et 1 cm de large.
    6. Insérez trois pièces de cathéter, préalablement infectées par Candida, dans chaque tunnel. Se assurer que les cathéters se trouvent à côté de l'autre dans une disposition horizontale et qu'ils ne couvrent pas les uns les autres pour permettre l'implantation de six fragments de cathéter au total (Figure 2A, (4)).
    7. Fermez les incisions avec des sutures. Vous pouvez également utiliser Dermabond pour fermer la plaie.
    8. Désinfectez la plaie très doucement avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d'alcool ou avec de l'isopropanol iode (1%).
    9. Appliquer un anesthésique local (gel de xylocaïne à 2%) directement sur la plaie.
    10. Administrer inversion de l'anesthésie (protocole 5, étape 2): voie intrapéritonéale 100 pi par 10 g de poids corporel.
    11. Transfert des animaux dans une cage propre préalablement placé sur une plaque chauffante. Gardez l'animalséparée et chaud jusqu'à ce que l'animal est complètement éveillé. Pendant ce temps, poursuivre l'opération et l'implant de l'animal suivant. Une fois que tous les animaux sont exploités pleinement éveillé. Transfert à une cage. Surveiller régulièrement les animaux.

    7. La bioluminescence Imaging: Préparation de coelentérazine (CTZ), le substrat de G. luciférase princeps

    1. Préparer coélentérazine frais (CTZ) solution mère en dissolvant 5 mg / ml dans de l'éthanol acidifié CTZ ou selon les instructions du fabricant.
    2. Préparer la solution de travail 1,2 mM par dilution de la solution mère 1:10 dans du PBS stérile.
      REMARQUE: Injecter 100 ul CTZ solutions de travail sous-cutanée dans la zone entourant les cathéters. Utiliser des seringues d'insuline pour injection sous-cutanée de la CTZ.
    3. Toujours garder CTZ dans l'obscurité (par exemple, couvrir microtubes contenant CTZ une feuille d'aluminium). Conserver la solution de stock à -80 ° C pendant la durée des expériences.
    4. 8. bioluminescence Imaging

      1. Réinitialisez l'appareil BLI.
      2. Anesthésier les animaux en utilisant une boîte d'induction. Utilisation d'un mélange gazeux d'isoflurane dans de l'oxygène, N 2 O / O 2, ou de l'air à 3.2%.
      3. Après l'induction, de maintenir l'anesthésie dans la zone d'induction et dans la chambre d'imagerie à 1,5 à 2%.
      4. Avant de commencer la session d'imagerie, placer la plaque d'imagerie en position A, qui correspond à un champ de vision de 10 cm. Veiller à ce que la bonne position des sorties d'anesthésie et animaux en plaçant un animal de couchage dans la boîte.
      5. Prenez quelques photos jusqu'à ce que l'animal est en position d'imagerie désiré, dans le champ de vision droite sous la caméra.
      6. Préparer deux seringues à insuline contenant chacun 100 ul de la solution de travail CTZ.
      7. Placez un animal sur le banc et le garder endormi au moyen d'un cône de nez fournissant anesthésie gazeuse.
      8. Apportez les aiguilles des seringues dans un endroit entourant cathéters sous-cutanée et injecterla CTZ simultanément au-dessus des cathéters.
      9. Immédiatement après l'injection, placez l'animal sur la plaque chaude dans la boîte de la caméra et lancer l'acquisition d'image de bioluminescence.
      10. Acquérir des balayages consécutifs avec des temps d'acquisition de 20 à 60 secondes (selon l'intensité du signal) jusqu'à ce que l'intensité du signal maximum est atteint. Lors de l'acquisition de la trame suivante, mesurer l'intensité du signal BLI des cadres précédemment acquis en plaçant un ROI sur chaque cathéters trio et en mesurant le flux de photons à travers ce ROI.
      11. Répétez l'étape 7 pour l'animal (s) suivante.
      12. Après l'imagerie, retourner les animaux dans leur cage. Répétez BLI au cours d'une expérience pour longitudinale, suivi non invasif de la formation de biofilm.
      13. Analyser les données à l'aide de BLI Vivre logiciel Image. Placez un ROI rectangulaire de taille fixe sur chaque trio de cathéter et mesurer le flux de photons (éclat) à travers chaque ROI. Répétez cette opération pour chaque animal.
      14. Rapportl'intensité du signal de chaque BLI trio de cathéter flux de photons par seconde. Représenter les données BLI sur une échelle logarithmique en reportant la moyenne et l'écart du flux de photons par seconde pour chaque groupe. Effectuer une analyse statistique sur les données transformées log 10.

      9. cathéter explantation

      1. Préparer microtubes contenant 1 ml de PBS, un pour chaque dispositif de cathéter et de les garder sur la glace.
      2. Euthanasier les animaux par dislocation cervicale (figure 2B, (1)).
      3. Désinfecter la peau du dos avec 0,5% de chlorhexidine à 70% d'alcool ou de l'iode avec de l'isopropanol (1%).
      4. Faire une incision (environ 3 cm) au-dessus des cathéters.
      5. Couper le tissu sous-cutané et enlever les fragments de cathéter, un par un à partir de sous le tissu sous-cutané en utilisant des pinces stériles (Figure 2B, (2)).
      6. Poignée cathéter doucement en position verticale et laver deux fois avec 1 ml de PBS stérile. Placez chaque cathéterpièce dans un tube de microcentrifugeuse séparé (préparé dans l'étape 1).

      10. Quantification des cellules associées à un biofilm par unités formatrices de colonies comte (UFC) et analyse statistique des résultats

      1. Cathéters Soniquer préalablement placées dans 1 ml de PBS pendant 10 min à 40 000 Hz dans un sonicateur à bain d'eau et de les placer sur la glace.
      2. Après sonication, Vortex vigoureusement pendant 30 secondes et le lieu à nouveau sur la glace.
      3. Préparer deux microtubes supplémentaires contenant 900 pi de PBS.
      4. Assurez 01h10 et 1: 100 dilutions de votre échantillon original (celui qui contient le cathéter) et de garder tous microtubes sur la glace.
      5. Planche 100 pi des échantillons originaux, 1:10 et 1: 100 dilutions sur des plaques de gélose YPD en double.
      6. Incuber les plaques pendant 2 jours à 37 ° C et compter UFC.
      7. Compter les colonies cultivées sur des plaques de gélose YPD (montant dénombrable de colonies, au maximum 300 colonies / plaque) et multipliez-les par le bon dilutionsfacteur de tion (1x-originale, 10x ou 100x dilution). En outre multiplier chaque pièce de cathéter en 10x, ce qui correspond à la quantité finale de colonies en 1 ml tube contenant le cathéter. Apportez le montant final de colonies de se connecter 10 cellules / pièce de cathéter avec une déviation standard (SD). Exprimez données comme une moyenne ± SD.
      8. Placez toutes les valeurs pour chaque cathéter et groupe spécifique dans un tableur et / ou statistique, pour effectuer les calculs mentionnés ci-dessus et des analyses statistiques. Indiquer groupes spécifiques de comparer, à savoir WT vs. mutant ou deux jours vs. 6 jours de formation de biofilm et effectuer des test t non apparié et ANOVA avec Tukey post-test sur les données de log10-transformé.
        1. Exprimer le niveau de signification d'une valeur de p. Dans cette étude indiquer l'importance si la valeur de p <0,05, représentée comme suit: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005.

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Representative Results

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Dans cette étude, nous montrons la procédure chirurgicale d'implant de cathéter et explant in vivo au cours de C. albicans développement du biofilm dans une souris. En outre, nous affichons la quantification des biofilms matures non seulement par UFC recensement classique mais aussi par BLI.

Comme le montre la Figure 1A, phosphorescents non morceaux de cathéters en polyuréthanne ont été coupés en des dispositifs de 1 cm et ensuite revêtus avec du sérum. Cette étape est très importante car elle permet aux cellules de Candida attachent au substrat plus rapidement en comparaison avec les implants non enrobés 15 sérum. Il est important de mentionner que, avant toute C. expérience albicans nous avons documenté la luminescence de nos appareils 18 de fond. Cette étape est cruciale avant d'effectuer toute BLI parce haute phosphorescence de l'appareil va interférer avec l'évaluation de la cinétique spécifiques de l'intensité du signal et de signaux bioluminescents de gLuc-les cellules exprimant. Ensuite, C. albicans cellules sont incubées avec les pièces de cathéter enduites de sérum. fragments de cathéter sont ensuite implantés sur la partie arrière de l'animal après l'incision sous-cutanée (figure 2A). Dans ce in vivo mis en place, deux incisions sont effectuées (une à droite et l'autre sur le côté gauche de l'arrière d'une souris) suivie par la formation de tunnels sous-cutanées dans chaque incision (Figure 2A (3)). Par la suite, trois dispositifs, préalablement infectées avec des cellules de Candida, sont implantés à l'intérieur de chaque site d'opération (figure 2A (3 et 4)). Cette mise en place nous permet d'étudier jusqu'à six biofilms par animal. Il est à noter que deux sites d'exploitation fournissent une possibilité d'étudier la formation de biofilm par deux souches différentes d'intérêt, par exemple le type et mutant sauvage dans le même animal. La figure 2B montre la plaie contenant des cathéters avant l'explant de l'appareil et des étapes de lavage ultérieures.Les biofilms développés intérieur de la partie arrière de l'animal ont été évalués pour les mesures de signal de bioluminescence. Un des animaux représentatifs affichant le signal de bioluminescence avec rectangles caractérisant les régions d'intérêt (ROI) est représenté dans la figure 3. Après le dernier point de temps BLI, cathéters sont explantées, soniquées puis vortex et une évaluation plus approfondie pour les cellules formant les biofilms quantification par UFC. Les analyses des données démontrant le journal 10 UFC obtenues à partir de chaque pièce de cathéter après le développement du biofilm et explantation sont présentés dans la figure 4A. À côté de cela, CFU ont été comparées à l'intensité du signal BLI et ces données sont présentées sur la figure 4B. Quatre-vingt dix minutes après l'implantation d'un signal clair BLI est produit par la ACTgLuc dites-vous alors qu'il biofilms dans la souche de type sauvage, à peine toute la lumière est produite; L'intensité de la lumière détectée à partir de la ACTgLuc dites-vousbiofilms est considérablement augmentent à mesure que le biofilm est formé, voici ci-dessous la même souris (figure 4C). Cette augmentation de la lumière suit la même tendance que l'augmentation de la CFU par biofilm (figure 4A). Dans nos expériences, nous avons également observé que d'une souche de type sauvage normal (pas modifié pour exprimer la luciférase) se traduit également dans la production de la lumière lors de l'addition du substrat. Cependant, le flux de photons est significativement plus faible que celle obtenue pour la souche d'ingénierie.

Pris ensemble, nos données montrent que BLI est une technique puissante pour surveiller et quantifier in vivo mûrir C. albicans formation d'un biofilm dans un modèle murin sous-cutané.

Figure 1
Figure 1: Préparation des dispositifs de polyuréthane polyuréthane partie du cathéter couper en morceaux de 1 cm.. Poc plastiqueché contenant cathéter est ouvert dans les conditions stériles et toutes les parties, à l'exception cathéter sont retirés de l'emballage. Deuxièmement, placer la règle en vertu de la poche plastique et couper des morceaux exactement 1 cm de polyuréthane. De tels dispositifs sont ensuite répartis dans des tubes de microcentrifugation (max 15 pièces / tube) et immergés dans 100% de sérum bovin fœtal suivie d'une incubation pendant une nuit à 37 ° C.

Figure 2
Figure 2: Des mesures importantes au cours de la chirurgie des animaux. (A) Procédure d'implant de cathéter. (1) Lieu anesthésié l'animal sur un pad chaude contenant du tissu de papier et appliquer de la pommade ophtalmique sur les yeux. (2) Rasez partie inférieure du dos et à désinfecter. (3) Créer deux petites (env. 0,5 cm) incisions à travers la peau sur la gauche et sur le côté droit de l'arrière. Créer tunnel sous-cutanée dans chaque incision et placer trois cathéters intérieur. (4) Fermez le wo und avec des sutures et lieu animaux sur un tapis chaud pour récupérer. (B) Procédure de retrait du cathéter. (1) Lieu sacrifiée animaux sur un pad et désinfecter les cathéters secondaires contenant exploités. Couper la blessure juste au-dessus des cathéters. (2) Sortez chaque cathéter doucement et laver deux fois avec 1 ml de PBS. Placez le microtube distinct.

Figure 3
Figure 3:. Mesure de signal bioluminescence in vivo l'image d'une souris BLI représentant imagée après 6 jours de développement du biofilm. La quantification de l'intensité du signal est effectué en plaçant une région d'intérêt (ROI) (rectangulaire) autour des cathéters suivie par mesure du flux de photons par seconde à travers chaque ROI.

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Figure 4: Quantification des matures Candida albicans biofilms par unités formant colonie (UFC) et par BLI. (A) In vivo mûrir C. albicans SKCA23- ACTgLuc et SC5314 (WT) biofilm quantification par Log10 UFC après 90 min, 2 jours et 6 jours de développement du biofilm. (B) signal de bioluminescence intensité quantification des biofilms in vivo formés par SKCA23- ACTgLuc et par C. albicans WT. Signal a été déterminée après 90 min (durée de l'adhérence), 2 jours et 6 jours de développement du biofilm. Comme témoin, on a utilisé des souris qui ont été implantés avec des cathéters non colonisé et qui ont été injection sous-cutanée CTZ. Le flux de photons obtenue chez ces souris se traduit par notre signal d'arrière-plan (BG). Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type (SD). La signification statistique est indiquée comme suit: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005. In vivo images de bioluminescence de la souris une représentante qui a été implantés avec des fragments de cathéters contenant sauvage de type C. cellules albicans sur le côté gauche et les cellules dites-vous ACTgLuc sur le côté droit. La souris a été imagée en trois périodes de temps différentes, à savoir 90 min, 2 jours et 6 jours après l'implantation des fragments de cathéter.

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Discussion

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L'utilisation de modèles animaux, et en particulier les modèles rongeurs, pour les études réservés aux biofilms microbiens est très important que le système immunitaire de l'hôte est un facteur essentiel dans la formation de biofilm que les modèles in vitro ne peuvent pas expliquer. Dans cette étude, nous décrivons un sous-cutanée C. relativement simple biofilm modèle de la souris albicans, qui peut être facilement adopté dans un laboratoire de recherche et ne nécessite pas de compétences techniques fortes. Ce modèle a été développé pour étudier la formation de biofilm de Staphylococcus epidermidis dans un 24 rat.

Dans le modèle présenté, les cathéters de polyuréthanne enduites de sérum ont été provoquées avec des cellules de Candida ex vivo au cours de la période d'adhérence (90 min, 37 ° C). Cette première étape in vitro peut être considéré comme un facteur limitatif en raison de l'absence du système immunitaire chez les premières étapes du processus de l'infection par le biofilm. À la suite de l'adhésion et avantImplant de cathéter, les cellules non liées sont éliminées par l'appareil de lavage. En évitant l'étape de lavage après la période d'adhérence peut créer quantité incontrôlable de cellules associées à l'appareil. Pour cette raison, nous vous conseillons de laver cathéters avant l'implant et donc, d'initier son développement à partir de cellules adhérentes. Après cette période d'adhésion initiale, cathéters contiennent environ 2,0 à 2,5 log 10 UFC / dispositif se propager le long de la lumière du cathéter 15. Au cours de cette étape Candida forme des tubes de germes, qui sont fixés sur le substrat.

Afin de ressembler à la situation chez les patients hospitalisés dont le système immunitaire est souvent compromise, nous les rats immunodéprimés dans notre système modèle sous-cutanée 15. Altération partielle du système immunitaire d'un rat, préalablement à l'implantation du dispositif et pendant toute la période du développement d'un biofilm, la reproductibilité a entraîné une augmentation des cellules formant les biofilms récupérées à partir decathéters implantés dans le même hôte et aussi de dispositifs obtenus à partir d'animaux supplémentaires. En raison de ces résultats, nous vous suggérons de immunosuppress les souris avant l'implantation du cathéter et aussi pendant la période de formation de biofilm. Cependant, nos résultats montrent que la variabilité des souris immunocompétentes est beaucoup moins par rapport à celle observée chez le rat, ce qui rend ce système de modèle de souris également approprié pour étudier le rôle du système immunitaire de l'hôte dans les biofilms. Dans notre modèle de rat d'origine et aussi dans le même modèle traduit à souris, mûrir C. albicans biofilms se développent dans les 48 heures démontré par la même quantité de CFU et de l'architecture du biofilm entre 2 et 6 jours 15,18,19.

Le modèle de biofilm sous-cutanée a été utilisée avec succès pour suivre le développement du biofilm par plusieurs mutants 15. Il a été montré précédemment par Nobile et al. 25 que C. albicans bcr1 Δ / Δ n'a pas bcr1former des biofilms dans un modèle cathéter veineux central (CVC). Cette souche affiche les caractéristiques du biofilm rudimentaires dans notre modèle sous-cutané de pointage du fait que les changements phénotypiques trouvées dans le modèle CVC pu être reproduits dans le modèle sous-cutané 15.

En comparaison avec d'autres modèles existants, à savoir., CVC modèle ou de modèle de prothèse stomatite 8,9,11, le modèle sous-cutanée permet de suivre le développement de biofilms dans plusieurs pièces de cathéter obtenues d'un animal, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires pour les études de biofilm. Malgré ces avantages, une lacune peut être le manque de flux sanguin qui peut conduire à la privation de certains nutriments dans le biofilm. Par conséquent, en terme de fournitures de nutriments et les conditions environnementales, le modèle sous-cutanée est plus liée à des infections associées aux périphériques développés sur prothèses articulaires, prothèses vocales et les stimulateurs cardiaques que celles formées sur cathéters intraveineux. Plus important encore,traduire le rat système de biofilm sous-cutanée à des souris fait de ce modèle animal compatible avec BLI, ce qui réduit encore les coûts et le plus important, le nombre d'animaux nécessaires. En outre, traduisant le modèle de rat à des souris permet l'utilisation de modèles de souris transgéniques pour étudier les facteurs de l'hôte pertinentes à des études d'infection de cathéter associé.

L'avantage majeur de l'utilisation de quantifier BLI biofilms dans les animaux vivants ne réside pas seulement dans le caractère non-invasif de ce procédé, mais également dans sa capacité à fournir des informations dynamiques sur le développement d'une infection. Dans cette étude, Gluc exprimé à la paroi cellulaire de C. albicans a permis une meilleure accessibilité et une interaction directe avec le substrat coelentérazine, qui sont cruciales pour la détection d'un signal bioluminescente in vivo. Dans l'étude de Vande Velde et al. 18, nous avons été en mesure de suivre le signal bioluminescente de C. albicans biofilms développé sur foreiorganismes gn in vitro. L'intensité du signal BLI fortement correspondait avec les données obtenues par des techniques de quantification biofilm supplémentaires, à savoir, la détermination et UFC XTT dosage de réduction. Suivant ces résultats, nous avons montré que le signal de biofilms bioluminescente in vivo était en accord avec la quantité de cellules associées à un biofilm récupérés de biofilms explantées. En outre, Vande Velde et al. 18 a démontré que BLI peut être utilisé pour suivre le développement de biofilm par un type sauvage et également de C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (souche déficiente en biofilm) chez le même animal en même temps. Ces résultats soutiennent fortement l'utilisation de BLI pendant les études consacrées à l'évaluation de l'évolution dans le temps du développement du biofilm et l'infection chez le même animal.

Ici, nous avons décrit une procédure expérimentale pour une implantation sous-cutanée in vivo des dispositifs de Candida avec suivi ultérieur of in vivo le développement de biofilm par BLI. Pris ensemble, BLI a montré être une technique fiable, qui nous a permis de suivre une infection au fil du temps en évitant les sacrifices d'animaux à chaque point de temps de l'analyse des données.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ne ont aucun intérêt financier concurrentes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

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References

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<em>Candida albicans</em> biofilm développement sur ​​les organismes étrangères médicalement pertinents dans une souris modèle sous-cutanée Suivi par bioluminescence Imaging
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Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).More

Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

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