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Medicine

Candida albicans biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging

doi: 10.3791/52239 Published: January 27, 2015

Abstract

Candida albicans desarrollo de biopelículas en superficies bióticos y / o abióticos representa una amenaza específica para los pacientes hospitalizados. Hasta ahora, C. biofilms albicans se han estudiado principalmente in vitro, pero hay una necesidad crucial para una mejor comprensión de este proceso dinámico en condiciones in vivo. Hemos desarrollado un modelo de rata subcutánea en vivo para estudiar C. la formación de biopelículas albicans. En nuestro modelo, múltiple (hasta 9) dispositivos infectados por Candida se implantan a la parte trasera del animal. Esto nos da una gran ventaja sobre el modelo de sistema de catéter venoso central, ya que nos permite estudiar varios biofilms independientes en un solo animal. Recientemente, hemos adaptado este modelo para estudiar C. el desarrollo del biofilm albicans en ratones Balb / c. En este modelo, madurar C. biofilms albicans se desarrollan dentro de 48 horas y demuestran la arquitectura de las biopelículas tridimensional típico. La cuantificación de biofilm fúngicaes tradicionalmente analizada post mortem y requiere sacrificio anfitrión. Debido a que este requiere el uso de muchos animales para llevar a cabo estudios cinéticos, se aplicó imágenes de bioluminiscencia no invasiva (BLI) longitudinalmente seguimiento in vivo madurar C. albicans biofilms desarrollar en nuestro modelo subcutánea. C. albicans células fueron diseñados para expresar el gen de la luciferasa Gaussia princeps (gluc) unido a la pared celular. La señal de bioluminiscencia es producido por la luciferasa que convierte la coelenterazina sustrato añadido a la luz que se puede medir. La señal de BLI parecía recuentos de células obtenidas de catéteres explantadas. Imagen no invasivas para la cuantificación de la formación de biopelículas vivo ofrece aplicaciones inmediatas para la selección y validación de fármacos antifúngicos en condiciones in vivo, así como para los estudios basados ​​en las interacciones huésped-patógeno, por este medio que contribuye a un mejor entenderción de la patogénesis de las infecciones asociadas al catéter.

Introduction

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Candida albicans es un organismo comensal, que se puede encontrar en diferentes sitios de individuos sanos, por ejemplo sobre la piel o como una parte de la flora gastrointestinal y vaginales. Sin embargo, en hospitalizados, y sobre todo pacientes inmunodeprimidos, puede causar una amplia gama de infecciones 1. En estos individuos, el sistema inmunológico debilitado permite que las células de Candida para difundir en el torrente sanguíneo y que invaden los tejidos más profundos que causan las infecciones que amenazan la vida. Además, la presencia de sustratos abióticos tales como catéteres venosos centrales y urinarios, válvulas cardíacas artificiales y las articulaciones puede proporcionar un nicho para Candida fijación 2. La adhesión a tales sustratos es un requisito previo para el desarrollo de biopelículas, que representa una capa de células de levadura y de hifas embebidos en el material polimérico extracelular, que consiste principalmente de polisacáridos 2. C. infecciones por catéter -asociado albicansestán asociados con una alta tasa de mortalidad. Una característica general de las biopelículas es su disminución de la susceptibilidad a los antifúngicos conocidos, tales como azoles 3,4. Sólo nuevas clases de fármacos antifúngicos, tales como las equinocandinas y la formulación liposomal de anfotericina B demostraron ser activos contra las infecciones asociadas al catéter 5-7. Debido a la resistencia a los antifúngicos biofilm, los enfoques terapéuticos son muy limitados, a menudo conduce a la retirada de la sonda y su posterior reemplazo como solución única.

La mayor parte de nuestra comprensión actual de C. desarrollo de la biopelícula albicans origina a partir de los estudios in vitro sobre sustratos abióticos tales como poliestireno o plásticos utilizados para la fabricación de los dispositivos anteriormente mencionados, es decir, silicona, poliuretano 2. Estos modelos son bastante avanzada y tratar de imitar la situación in vivo tan estrechamente como sea posible. Sin embargo, estos sistemas no implican el flujo de sangre continuo y tque el sistema inmune del huésped. Esto resultó en el desarrollo de sistemas de modelos in vivo, tales como el modelo de catéter venoso central (CVC) 8-10, el modelo estomatitis protésica de la candidiasis oral 11 y un modelo murino para asociada al catéter candiduria 12. Adicionalmente, C. desarrollo de la biopelícula albicans se estudió in vivo en las superficies de las mucosas, tales como las de la vagina 13 y la cavidad oral 14. Nuestro laboratorio contribuyó con la creación de un C. subcutánea modelo de biofilm albicans, que se basa en el implante de piezas catéter infectado en la parte posterior de las ratas Sprague Dawley 15. Este modelo fue utilizado con éxito en nuestro laboratorio para probar la susceptibilidad biofilm al fluconazol y equinocandina drogas 5,16, para estudiar el efecto de la terapia combinatoria de diclofenaco y caspofungina 17. Más recientemente, se adaptó este sistema para su uso en ratones BALB / c 18,19. Encomparación con otros modelos in vivo, la principal ventaja de este modelo subcutánea es la posibilidad de estudiar múltiples biofilms por animal desarrollado en el interior del lumen de piezas catéter implantado.

Para reducir el número de animales de laboratorio, hemos adaptado este modelo para estudiar el desarrollo de C. albicans biofilms no invasiva mediante el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) 18,19. Este método ha demostrado ser una técnica poderosa, que puede ser utilizado para cuantificar las biopelículas mediante la medición de la señal específica BLI en la región de interés (en nuestro caso, el área de catéteres implantados), evitando el sacrificio de animales. En comparación con las bacterias, que puede expresar tanto el gen y el sustrato necesario para la reacción de bioluminiscencia debido a la introducción de un operón lux específica 20, la mayoría de los organismos eucariotas, incluyendo C. albicans, son dependientes de la expresión heteróloga de un gen de la luciferasa, junto con eladministración externa de un sustrato específico, tal como D-luciferina o coelenterazina 21. Probablemente debido a la presencia de la pared celular fúngica y C. morfogénesis albicans, el suministro intracelular del sustrato para la enzima luciferasa fue un reto principal 21. A fin de resolver este problema, Enjalbert et al. 22 diseñado una cepa donde un C. sintética albicans versión codón optimizado del gen para la secretada de forma natural Gaussia princeps luciferasa (gluc) se fusionó a la C. gen albicans PGA59, un GPI- anclado proteínas de la pared celular. Debido a la presencia de la luciferasa en la pared celular, los problemas relativos a la disponibilidad intracelular del sustrato podrían evitarse. Este sistema fue utilizado en particular para estudiar infecciones superficiales causadas por C. 22 albicans. Muy recientemente, BLI también fue utilizado para seguir la progresión de la candidiasis orofaríngea y su possible tratamiento 23. Estos hallazgos apoyan el uso de BLI como una técnica prometedora para estudiar infecciones causadas por las células de vida libre, sino también las infecciones asociadas a dispositivos.

En este estudio, se describe la C. el desarrollo del biofilm albicans en piezas de catéter de poliuretano en ratones Balb / C y su cuantificación mediante BLI. Proporcionamos un protocolo detallado de la colonización in vitro de los catéteres de poliuretano durante el período de adherencia seguida de la implantación en ratones y el desarrollo de biopelículas posterior de animales vivos. Además de la medición de la señal emitida por el BLI C. albicans células, que también determinan el unidades formadoras de colonias para la comparación con la técnica estándar para la carga fúngica biofilm cuantificación.

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Protocol

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NOTA: Todos los experimentos con animales fueron aprobadas por el comité de ética de la Universidad Católica de Lovaina (proyecto número 090/2013). Mantener los animales, de acuerdo con las directrices de cuidado de animales KU Leuven.

1. C. Crecimiento albicans

  1. Veinticuatro horas antes de la iniciación del experimento animal, preparar placas de YPD mediante la adición de 10 g de extracto de levadura granulada, 20 g de peptona bacteriológica, y 15 g de agar granulado. Invente volumen a 900 ml con agua Milli-Q y autoclave.
  2. Añadir 50 ml de 40% de glucosa estéril. Mezclar bien y verter en placas de Petri. Deja placas de agar se enfríe y solidifique.
    NOTA: En este estudio, utilizar dos cepas, es decir, de tipo salvaje C. albicans SC5314 - cepa Gluc negativo (denominado WT) y C. albicans SKCA23 cepa, que es un tipo salvaje C. albicans SC5314 transformada con el plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 .En esta cepa (llamado SKCA23- ACTgLuc) Gluc se fusiona con el gen endógeno PGA59 bajo el control de ACT1 (actina) promotor (es este promotor activo en la levadura, así como la etapa de hifas de crecimiento de hongos). Esta cepa se puede solicitar desde el laboratorio del Prof. Patrick Van Dijck, KU Leuven, Lovaina, Bélgica. Plásmido plásmido CLP10 :: Act1p-gLUC59 22 fue cedida gentilmente por el profesor C. d'Enfert, Instituto Pasteur, París, Francia.
  3. Mantener ambas cepas en glicerol y se almacena a -80 ° C.
  4. Antes de cualquier cepa experimento racha en una placa de YPD. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.

2. Catéter Preparación Piezas

  1. Antes del experimento, determinar el número de catéteres se necesitan. Es posible implantar hasta 6 piezas de catéter por ratón (3 catéteres en la izquierda y 3 del catéter en el lado derecho del animal (Figura 2A).
  2. Veinticuatro horas antes de la cirugía animal, abra el paqueteedad que contiene catéter de triple lumen bajo la cabina de seguridad biológica. Quite todas las partes innecesarias con pinzas estériles y cortar la parte unida al catéter con un bisturí estéril. Coloque gobernante bajo el paquete de plástico y cortar piezas de catéter de poliuretano de exactamente 1 cm de acuerdo con la escala de la regla (Figura 1).
    NOTA: Es importante mencionar que este tipo de pieza catéter no es fosforescente y por lo tanto adecuado para BLI 18,19.
  3. Coloque un máximo de 15 piezas catéter corte (paso. 2.2) en 2 ml tubos de microcentrífuga. Siempre prepare 3 piezas extra, que se usan para enumerar la cantidad de células de Candida adjuntos en el dispositivo después de que el periodo de adhesión.
  4. Suplemento catéteres con aproximadamente 1,8 ml de suero bovino fetal 100% (FBS).
  5. Vigorosamente vórtice y añadir 100-200 l adicional de 100% de SFB. Cubra completamente todas las piezas del catéter con suero.
  6. Incubar a 37 ° C durante la noche.

    3. Los animales y la supresión del sistema inmune

    1. Mantenga hembra BALB / c ratones (aproximadamente 8 semanas de edad) en jaulas ventiladas individualmente superiores de filtro con libre acceso al alimento estándar y agua ad libitum.
    2. Iniciar supresión del sistema inmune 24 hr antes de la cirugía de los animales mediante la adición de dexametasona (0,4 mg / L) al agua de bebida de los animales. Con el fin de evitar cualquier contaminación bacteriana del anfitrión, complementar el agua potable con antibióticos, por ejemplo, polvo de ampicilina de sodio (0,5 g / L).
    3. Mantenga la inmunosupresión de los animales durante todo el experimento (hasta 6 días).

    4. Los sustratos de poliuretano Ex vivo C. albicans Adherencia sobre FBS recubiertas-

    1. Transferir cada pieza catéter suero recubierto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml frescos.
    2. Raspe algunos C. albicans células cultivadas en placas de YPD (Paso 1) y suspender en 1 ml de PBS.
    3. Diluir Cancélulas dida (1: 100) en un tubo de microcentrífuga independiente. Tomar 10 l de la muestra diluida y aplicarlo en una cámara de recuento celular. Contar al menos 16 pequeños cuadrados.
    4. Preparar las células de Candida (cada cepa por separado) en medio RPMI 1640 a una concentración final de 5 x 10 4 células / ml.
    5. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada pieza del equipo de suero-revestido.
    6. Vortex vigorosamente y asegurar que los catéteres están sumergidos en el medio y no flotando en la superficie.
    7. Incubar catéteres a 37 ° C durante 90 min (período de adhesión).
    8. Eliminar catéteres con pinzas estériles y lavar dos veces con 1 ml de PBS. Durante esta etapa de asegurarse de que el fluido de lavado pasa a través del lumen, manteniendo el catéter en posición vertical, mientras que el lavado muy suavemente los catéteres. Es importante destacar que no utilice un fuerte flujo que puede llevar a la eliminación de las células unidas.
    9. Traslado cada catéter se lava a un tubo de microcentrífuga limpio (una pieza per tuser).
    10. Coloque sobre hielo y mantenerlo allí hasta la cirugía.

    5. Anestesia

    1. Preparar la anestesia mediante la mezcla de 75 l de ketamina (100 mg / ml) con 100 l de medetomidina (1 mg / ml) y 825 l de solución salina estéril. Administrar por vía intraperitoneal (ip) 60-80 l de cóctel anestésico por 10 g de peso corporal, lo que resulta en una dosis de 45-60 mg / kg de ketamina y 0,6-0,8 mg / kg de medetomidina.
    2. Para la recuperación de la anestesia, diluir 50 l atipamezol (5 mg / ml) en 4,95 ml de solución salina, administrar ip 100 l por 10 g de peso corporal como antídoto, resultando en una dosis de 0,5 mg / kg.
    3. Después de la inyección de la anestesia, colocar al animal en una jaula separada y espere hasta que esté completamente dormido.
    4. Confirme anestesia adecuada de los subproductos animales pizca de piel clara y una pizca dedo del pie, que no causa ningún daño a la piel. Cualquier movimiento observada indica que el animal no se anestesia suficiente para realizar la cirugía. Si esto sucede, espere un couple de minutos más hasta que el animal no muestra ningún signo de movimiento sobre la piel o del pie sujetador.

    6. Cirugía Animal

    1. Transferencia anestesiado animal de la jaula en un pañuelo de papel limpio colocado sobre el cojín eléctrico, pre-calentado a 37 ° C (Figura 2, (1)).
      NOTA: Una alternativa más barata es usar mantas eléctricas. También es posible usar almohadillas isotérmicas, que deben ser calentados en el microondas antes de la cirugía animal.
    2. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos.
    3. Afeitarse la parte trasera inferior del animal con una rasuradora eléctrica. Retire todos los pelos de animales y traslado de los animales en un pañuelo de papel limpio. Desinfectar la piel (por ejemplo, con 1% de isopropanol yodo o 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol) y dejar el área desinfectada secar durante aproximadamente 1 min (Figura 2A, (2)).
    4. Hacer una pequeña incisión en la piel (uno a la izquierda y uno en el lado derecho del animal) (aproximadamente 0,5 y# 8211; 1 cm) (Figura 2A, (3)).
    5. Diseccionar el tejido subcutáneo con una tijera para crear dos túneles subcutáneos. Cada túnel debe ser de aproximadamente 1,5 cm de largo y 1 cm de ancho.
    6. Inserte tres piezas de catéteres, previamente infectados con Candida, en cada túnel. Asegúrese de que los catéteres se encuentran uno junto al otro en una disposición horizontal y que no cubren entre sí para permitir la implantación de seis fragmentos de catéteres en total (Figura 2A, (4)).
    7. Cerrar las incisiones con suturas. Como alternativa, utilice Dermabond para cerrar la herida.
    8. Desinfectar la herida suavemente con un 0,5% de clorhexidina en alcohol al 70% o con isopropanol yodo (1%).
    9. Aplicar anestésico local (gel de xilocaína, 2%) directamente sobre la herida.
    10. Administrar reversión de la anestesia (protocolo 5, etapa 2): por vía intraperitoneal 100 l por 10 g de peso corporal.
    11. Transferencia animal a una jaula limpia previamente colocada en una placa calefactora. Mantenga al animalindependiente y caliente hasta que el animal está completamente despierto. Mientras tanto, continuar con la operación y el implante de la siguiente animal. Una vez que todos los animales operados son completamente despierto. Transferencia a una jaula. Monitorear los animales regularmente.

    Imagen 7. bioluminiscencia: Preparación de coelenterazina (CTZ), el sustrato para G. luciferasa princeps

    1. Preparar coelenterazina fresca solución madre (CTZ) por disolución de 5 mg / ml CTZ en etanol acidificado o de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Preparar la solución de trabajo mM 1,2 por dilución de la solución madre 1:10 en PBS estéril.
      NOTA: Inyectar 100 l CTZ soluciones de trabajo por vía subcutánea en la zona que rodea a los catéteres. Utilice jeringas de insulina para la inyección subcutánea de CTZ.
    3. Siempre mantenga CTZ en la oscuridad (por ejemplo, cubrir tubos de microcentrífuga que contengan CTZ con papel de aluminio). Almacenar la solución madre a -80 ° C durante la duración de los experimentos.
    4. 8. La bioluminiscencia Imaging

      1. Inicialice la cámara BLI.
      2. Anestesiar a los animales utilizando una caja de inducción. Utilice una mezcla de gas de isoflurano en oxígeno, N 2 O / O 2, o aire a 2-3%.
      3. Después de la inducción, mantener la anestesia en el cuadro de inducción y en la cámara de formación de imágenes en 1,5-2%.
      4. Antes de comenzar la sesión de imágenes, coloque la placa de imagen en la posición A, que corresponde a un FOV de 10 cm. Asegúrese de que la posición correcta de los puntos de venta de anestesia y de los animales mediante la colocación de un animal que duerme en la caja.
      5. Tome algunas fotografías hasta animal está en la posición de imagen deseada, en el FOV justo debajo de la cámara.
      6. Preparar dos jeringas de insulina que contienen cada uno 100 l de la solución de trabajo CTZ.
      7. Coloque un animal en el banco y mantenerlo dormido por medio de un cono de la nariz que proporcionan anestesia gas.
      8. Llevar las agujas de las jeringas en un lugar que rodea catéteres por vía subcutánea e inyectarla CTZ simultáneamente en la parte superior de los catéteres.
      9. Inmediatamente después de la inyección, coloque el animal en el plato caliente en la caja de la cámara y comenzar la adquisición de imágenes de bioluminiscencia.
      10. Adquirir exploraciones consecutivas con tiempos de adquisición de 20 a 60 segundos (dependiendo de la intensidad de la señal) hasta que se alcanza la intensidad máxima de la señal. Durante la adquisición de la trama siguiente, medir la intensidad de la señal BLI de las tramas previamente adquiridos mediante la colocación de un ROI sobre cada trío catéteres y midiendo el flujo de fotones a través de esta ROI.
      11. Repita desde el paso 7 para el siguiente animal (s).
      12. Después de las imágenes, vuelva animales a su jaula. Repita BLI durante el curso de un experimento para longitudinal, no invasivo de seguimiento de la formación de biopelículas.
      13. Analizar los datos de BLI utilizando Vivir software de imagen. Coloque un ROI rectangular de tamaño fijo sobre cada trío catéter y medir el flujo de fotones (radiación) a través de cada ROI. Repita esto para cada animal.
      14. Informela intensidad de la señal BLI de cada trío catéter como flujo de fotones por segundo. Representar los datos de BLI en una escala logarítmica por el trazado de la media y la SD de la flujo de fotones por segundo para cada grupo. Realizar un análisis estadístico de los registro de 10 datos transformados.

      9. Catéter Explante

      1. Preparar tubos de microcentrífuga que contiene 1 ml de PBS, uno para cada dispositivo de catéter y mantenerlos en hielo.
      2. La eutanasia a los animales por dislocación cervical (Figura 2B, (1)).
      3. Desinfectar la piel de la espalda con 0,5% de clorhexidina en 70% de alcohol o de yodo con isopropanol (1%).
      4. Hacer una incisión (aproximadamente 3 cm) por encima de los catéteres.
      5. Cortar tejido subcutáneo y retire los fragmentos de catéter uno por uno desde debajo del tejido subcutáneo utilizando pinzas estériles (Figura 2B, (2)).
      6. Manejar catéter suavemente en posición vertical y lavar dos veces con 1 ml de PBS estéril. Coloque cada catéterpieza en un tubo de microcentrífuga separado (preparado en el Paso 1).

      10. Las células asociadas a Biofilm Cuantificación de formadoras de colonias por Conde Unidades (UFC) y análisis estadístico de los resultados

      1. Catéteres Sonicar colocados previamente en 1 ml de PBS durante 10 minutos a 40.000 Hz en un baño de ultrasonido agua y colocarlos en hielo.
      2. Después de la sonicación y agitar vigorosamente durante 30 segundos y lugar de nuevo en el hielo.
      3. Prepare dos tubos de microcentrífuga adicionales que contienen 900 l de PBS.
      4. Haga 1:10 y 1: 100 diluciones de la muestra original (la que contiene el catéter) y mantener todos los tubos de microcentrífuga en hielo.
      5. Plate 100 l de las muestras originales, 1:10 y 1: 100 diluciones en placas de agar YPD en duplicado.
      6. Incubar las placas durante 2 días a 37 ° C y contar UFC.
      7. Contar las colonias cultivadas en placas de agar YPD (cantidad numerable de colonias, máximo 300 colonias / placa) y multiplicarlos por el Dilu adecuadafactor de la (1x-original, 10x o 100x dilución). Además multiplicar cada pieza catéter por 10 veces, lo que se corresponde con el importe final de las colonias en el tubo 1 ml que contiene el catéter. Llevar el importe final de las colonias para registrar 10 células / pieza catéter con una desviación estándar (DE). Expresar datos como media ± desviación estándar.
      8. Coloque todos los valores para cada catéter y grupo específico en una y / o programa estadístico hoja de cálculo, para realizar los cálculos y análisis estadísticos mencionados anteriormente. Indique grupos específicos para comparar, es decir, WT vs. mutante o 2 días frente. 6 días de formación de biofilm y realizar la prueba t no pareada y ANOVA con Tukey post-test en los datos log10-transformado.
        1. Expresar el nivel de significación por un valor de p. En este estudio indican significación si p <0.05, representada de la siguiente manera: * p <0.05, ** p <0,005, *** p <0,0005.

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Representative Results

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En este estudio, mostramos el procedimiento quirúrgico de implante de catéter y explante in vivo durante el desarrollo de C. albicans biofilm en un ratón. Además, se muestra la cuantificación de los biofilms maduros no sólo por la enumeración UFC clásica, sino también por BLI.

Como se muestra en la Figura 1A, no fosforescentes piezas catéter de poliuretano se cortaron en dispositivos 1 cm y posteriormente recubiertas con suero. Este paso es muy importante porque permite que las células de Candida que se adhieren al sustrato más rápidamente en comparación con los implantes recubiertos no séricas 15. Es importante mencionar que antes de cualquier C. albicans experimento se documentó por primera vez la luminiscencia de fondo de nuestros dispositivos 18. Este paso es crucial antes de realizar cualquier BLI porque la alta fosforescencia del dispositivo va a interferir con la evaluación de la cinética de intensidad de señal y de señal bioluminiscentes específicos de gLuc-las células que expresan. A continuación, C. albicans células se incuban con las piezas de catéteres recubiertos con suero. Fragmentos de catéter entonces se implantan en la parte posterior del animal después de la incisión subcutánea (Figura 2A). En este in vivo establecido, se realizan dos incisiones (uno a la derecha y otro en el lado izquierdo de la espalda de un ratón) seguido de la formación de túneles subcutáneos dentro de cada incisión (Figura 2A (3)). Posteriormente, tres dispositivos, previamente infectados con células de Candida, se implantan dentro de cada sitio de la operación (Figura 2A (3 y 4)). Esta configuración nos permite estudiar hasta seis biofilms por animal. Es de destacar que dos sitios de operación proporcionan una posibilidad de estudiar la formación de biopelículas por dos cepas diferentes de interés, por ejemplo de tipo salvaje y mutante en el mismo animal. La Figura 2B muestra la herida que contiene catéteres antes del explante dispositivo y las etapas de lavado posteriores.Biofilms desarrollados dentro de la parte trasera del animal se evaluaron para las mediciones de la señal de bioluminiscencia. Uno de los animales representativos que muestran la señal de bioluminiscencia junto con rectángulos que caracterizan las regiones de interés (ROIs) se muestra en la Figura 3. Después del último punto de tiempo BLI, catéteres se explantaron, sonicadas y posteriormente a vórtice y se evaluaron adicionalmente para las células de formación de biofilm cuantificación de UFC. Los análisis de datos que demuestran la log10 UFC obtenidas de cada pieza catéter después del desarrollo de biopelículas y la explantación se muestran en la Figura 4A. Junto a esto, las UFC se compararon con la intensidad de la señal BLI y estos datos se muestran en la Figura 4B. Noventa minutos después de la implantación de una señal clara BLI es producido por el ACTgLuc expresando biofilms que hay en la cepa de tipo salvaje, casi no se produce ninguna luz; La intensidad de la luz detectada desde el expresando ACTgLucbiofilms está aumentando significativamente a medida que se forma el biofilm, aquí siguiendo el mismo ratón (Figura 4C). Este aumento en la luz sigue la misma tendencia que el aumento de las UFC por biofilm (Figura 4A). En nuestros experimentos también se observó que una cepa de tipo salvaje normal (no ingeniería genética para expresar luciferasa) también resulta en la producción de luz tras la adición del sustrato. Sin embargo, el flujo de fotones fue significativamente menor que la obtenida para la cepa de ingeniería.

Tomados en conjunto, nuestros datos demuestran que BLI es una poderosa técnica para controlar y cuantificar in vivo madurar C. la formación de biopelículas albicans en un modelo de ratón subcutánea.

Figura 1
Figura 1: Preparación de los dispositivos de poliuretano Poliuretano parte del catéter cortado en trozos de 1 cm.. Poc plásticoKET catéter que contiene está abierto en las condiciones estériles y todas las partes, excepto el catéter se retira del paquete. En segundo lugar, coloque la regla bajo el bolsillo de plástico y cortar exactamente 1 cm piezas de poliuretano. Tales dispositivos se distribuyen posteriormente a tubos de microcentrífuga (max 15 piezas / tubo) y se sumergieron en 100% de suero bovino fetal, seguido de incubación durante la noche a 37 ° C.

Figura 2
Figura 2: Principales pasos durante la cirugía animal. (A) Procedimiento de implante de catéter. (1) Lugar anestesiado animales sobre una almohadilla caliente mezclada con un pañuelo de papel y aplicar el ungüento oftálmico en los ojos. (2) Afeitarse parte baja de la espalda y desinfectar. (3) Crear dos pequeñas (aprox. 0,5 cm) de incisiones a través de la piel de la izquierda y en el lado derecho de la espalda. Crear túnel subcutáneo dentro de cada incisión y colocar 3 catéteres dentro. (4) Cierre la wo und con suturas y el lugar de los animales en una compresa caliente para recuperarse. (B) Procedimiento de retirada de la sonda. (1) Lugar animal sacrificado en un cojín y desinfecte los catéteres laterales que contienen operados. Cortar la herida justo encima de los catéteres. (2) Saque cada catéter suavemente y lavar dos veces con 1 ml de PBS. Coloque el tubo de microcentrífuga separado.

Figura 3
Figura 3:. In vivo imagen BLI medición de señal bioluminiscencia de un ratón representativo fotografiada después de 6 días de desarrollo de la biopelícula. La cuantificación de la intensidad de la señal se realiza mediante la colocación de una región de interés (ROI) (rectangular) alrededor de los catéteres seguida por la medición del flujo de fotones por segundo a través de cada ROI.

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Figura 4: Cuantificación de maduros biopelículas de Candida albicans de unidades formadoras de colonias (UFC) y por BLI. (A) En vivo madurar C. albicans SKCA23- ACTgLuc y SC5314 (WT) biofilm cuantificación por Log10 UFC después de 90 minutos, 2 días y 6 días de desarrollo del biofilm. (B) Señal de bioluminiscencia intensidad cuantificación de biofilms en vivo formadas por SKCA23- ACTgLuc y por C. albicans WT. Señal se determinó después de 90 min (período de adhesión), 2 días y 6 días de desarrollo del biofilm. Como control, se utilizó ratones que fueron implantados con catéteres no colonizados y que fueron inyectados por vía subcutánea con CTZ. El flujo de fotones obtenido en estos ratones resulta en nuestra señal de fondo (BG). Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (SD). La significación estadística se indica como sigue: * p <0,05, ** p <0,005, *** p <0,0005. En vivo imágenes de bioluminiscencia de un representante del ratón que se implantan con fragmentos de catéteres que contienen tipo salvaje C. albicans células en el lado izquierdo y células que expresaban ACTgLuc en el lado derecho. El ratón fue fotografiada en tres períodos de tiempo diferentes, es decir, 90 min, 2 días y 6 días después de la implantación de los fragmentos de catéter.

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Discussion

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El uso de modelos animales, y especialmente los modelos de roedores, los estudios dedicados a las biopelículas microbianas es muy importante ya que el sistema inmune del huésped es un factor esencial en la formación de biopelículas que los modelos in vitro no pueden explicar. En este estudio, se describe un relativamente sencillo subcutánea C. albicans biofilm modelo de ratón, que puede ser fácilmente adoptada en un laboratorio de investigación y no requiere fuertes habilidades técnicas. Este modelo se desarrolló originalmente para estudiar la formación de biofilm Staphylococcus epidermidis en una rata 24.

En el modelo presentado, los catéteres de poliuretano recubierto de suero fueron retados con células de Candida ex vivo durante el periodo de adherencia (90 min, 37 ° C). Este primer paso in vitro podría ser considerado como un factor limitante debido a la falta del sistema inmune en las primeras etapas del proceso de infección biofilm. Después de la adhesión y antescatéter de implante, células asociadas dispositivo no se elimina mediante lavado. Evitando la etapa de lavado después del período de adhesión puede crear cantidad incontrolable de células asociadas con el dispositivo. Debido a esta razón, sugerimos que lavar los catéteres antes del implante y por lo tanto, para iniciar su desarrollo a partir de células adheridas. Después de este período de adhesión inicial, catéteres contienen aproximadamente 2,0 a 2,5 log 10 UFC / dispositivo extendido junto con el catéter de luz 15. Durante esta etapa Candida forma de tubos germinales, que se unen sobre el sustrato.

Con el fin de asemejarse a la situación en pacientes hospitalizados, de los cuales el sistema inmune se compromete a menudo, que inmunosuprimidos las ratas en nuestro modelo de sistema subcutánea 15. Deterioro parcial del sistema inmunológico de una rata, antes de la implantación del dispositivo y durante todo el período de desarrollo de la biopelícula, produjo un aumento de la reproducibilidad de las células de formación de biofilm recuperados decatéteres implantados en el mismo hospedador y también de los dispositivos obtenidos de animales adicionales. Debido a estos resultados se sugiere inmunosuprimir los ratones antes de la implantación del catéter y también durante el período de la formación de biopelículas. Sin embargo, nuestros resultados muestran que la variabilidad en ratones inmunocompetentes es muy inferior a la observada en ratas, lo que hace que el sistema modelo de ratones también adecuado para estudiar el papel del sistema inmune del huésped en biofilms. En nuestro modelo de rata original y también en el mismo modelo traducido a ratones, madurar C. biofilms albicans se desarrollan dentro de 48 hr demostrado por la cantidad similar de UFC y la arquitectura biofilm entre 2 y 6 días 15,18,19.

El modelo de biofilm subcutánea fue utilizado con éxito para seguir el desarrollo del biofilm por varios mutantes 15. Se ha demostrado previamente por Nobile et al. 25 que C. albicans bcr1 Δ / Δ bcr1 no pudoformar biopelículas en un modelo de catéter venoso central (CVC). Esta cepa muestra las características del biofilm rudimentarias en nuestro modelo de apuntado subcutánea al hecho de que los cambios fenotípicos que se encuentran en el modelo de CVC podrían ser reproducidos en el modelo subcutáneo 15.

En comparación con otros modelos existentes, es decir., CVC modelo o modelo de prótesis de la estomatitis 8,9,11, el modelo subcutáneo permite seguir el desarrollo de biopelículas en múltiples piezas de catéter obtenidos a partir de un animal, reduciendo así el número de animales necesarios para los estudios de biofilm. A pesar de estas ventajas, una deficiencia puede ser la falta de flujo sanguíneo que puede conducir a cierta privación de nutrientes en el biofilm. Por lo tanto, en el plazo de los suministros de nutrientes y las condiciones ambientales, el modelo subcutáneo está más relacionada con las infecciones asociadas a dispositivos desarrollados en prótesis articulares, prótesis de voz y marcapasos que las que se forman en los catéteres intravenosos. Aún más importante,la traducción de la rata sistema de biofilm subcutánea a ratones hechas compatible este modelo animal con BLI, lo que reduce aún más los costes y lo más importante, el número de animales necesarios. Además, la traducción del modelo de rata a ratones permite el uso de modelos de ratones transgénicos para estudiar los factores del huésped pertinentes para estudios de infección asociada al catéter.

La principal ventaja de utilizar BLI para cuantificar biofilms en animales vivos no sólo radica en el carácter no invasivo de este método, sino también en su capacidad de proporcionar información dinámica sobre el desarrollo de una infección. En este estudio, gluc expresa en la pared celular de C. albicans permitió una mejor accesibilidad y la interacción directa con el coelenterazina sustrato, que son cruciales para una detección de señal bioluminiscente en vivo. En el estudio de Vande Velde et al. 18, hemos sido capaces de seguir la señal bioluminiscente de C. albicans biofilms desarrolló en foreicuerpos gn in vitro. La intensidad de la señal BLI corresponde fuertemente con los datos obtenidos de técnicas de cuantificación biofilm adicionales, es decir, la determinación de las UFC y ensayo de reducción XTT. Junto a estos resultados, se demostró que la señal bioluminiscente de in vivo biofilms estaba de acuerdo con la cantidad de células del biofilm asociada recuperados de biofilms explantadas. Además, Vande Velde et al. 18 demostró que BLI se puede utilizar para seguir el desarrollo de biopelículas por un tipo salvaje y también por C. albicans bcr1Δ / bcr1Δ (cepa-biofilm deficiente) en el mismo animal al mismo tiempo. Estos hallazgos apoyan fuertemente la utilización de BLI durante los estudios dedicados a la evaluación de la evolución en el tiempo de desarrollo de la biopelícula y la infección en el mismo animal.

Por la presente, se describe un procedimiento experimental en vivo implante subcutáneo de dispositivos Candida infectado con con posterior seguimiento of in vivo el desarrollo del biofilm por BLI. Tomados en conjunto, BLI demostró ser una técnica fiable, lo que nos permitió seguir una infección en el tiempo evitando sacrificios de animales en cada tiempo de análisis de datos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Yeast extract granulated Merck MERC1.03753.0500
Bacteriological peptone Oxoid LP037B
Agar granulated Difco 214530
D-(+)-glucose Fluka 49159-5KG
Phosphate buffered saline  Prepared in the laboratory for 1L of 10x PBS: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4
RPMI1640 with L-glutamine and without sodium carbonate  Sigma R6504-1L Prepare according the protocol for Candida albicans drug susceptibility testing 
3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) Sigma M1254 MOPS is used to adjust the pH of RPMI medium (pH 7.0)
fetal bovine serum (FBS) Sigma F7524
Polyurethane tripe-lumen intravenous catheter piece (2.4 mm diameter, Certofix Trio S730)  BBraun CV-15703 Polyurethane part cut into 1 cm pieces
Dexamethasone Fagron SAS, France 611139 Immunosuppressant (stock solution 10 mg/ml)
Ampicillin  Duchefa Biochemie, The Netherlands A0104 Antibacterial prophylaxis
Ketamine 1000 Pfizer 804 119 Anesthetic
Domitor Pfizer 134737-1 Anesthetic
Antisedan Pfizer 134783-2 Reversal of anesthesia
Xylocaine gel (2%) - this is Linisol AstraZeneca 352 1206 Local anesthetic for the skin
Terramycin/ polymyxin-b ophthalmic ointment To prevent drying and infection of eyes
Coelenterazine  Prolume (Nanolight) NF-CTZ-FB Light sensitive agent (must be kept in the dark)
Iodine isopropanol (1%) 3M™ DuraPrep™  Disinfectant for the skin
0.5 % chlorhexidine in 70 % alcohol.   Cedium Disinfectant for the skin
Equipment
Cell counting chamber
Insulin syringes (0.3 ml) Terumo Myjector 29G 324826 For injection of coelenterazine
Electric razor For small animals
Sterile surgical tools Scissors, 2 pairs of tweezers, scalpel
Heating pad Leica 14042321474
Skin suture Johnson&Johnson K890H Surgical thread, needle
Water bath sonicator Branson 2210
BLI camera (IVIS Spectrum)  Perkin Elmer, Alameda IVISSPE
Living Image software  Perkin Elmer, Alameda (version 4.2) 

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<em>Candida albicans</em> biopelícula Desarrollo de Cuerpos Extraños médicamente relevantes en un modelo de ratón subcutánea Seguido por bioluminiscencia Imaging
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Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).More

Kucharíková, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (95), e52239, doi:10.3791/52239 (2015).

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