Mätning av mRNA dämpfaktorer i<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Använda<em> Rpb1-1</em> Stammar
Summary
Steady state-nivån av specifika mRNA bestäms av graden av syntes och nedbrytning av mRNA. Genomvid mRNA nedbrytningshastigheter eller dämpfaktorer specifika mRNA kan mätas genom att bestämma mRNA halveringstider. Detta protokoll är inriktat på mätning av mRNA avklingningshastigheter i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state-nivåer varierar beroende på miljöförhållanden. Reglering av steady state ackumulering nivåer av ett mRNA ser till att rätt mängd protein syntetiseras för cellens specifika tillväxtbetingelser. Ett tillvägagångssätt för mätning av mRNA-avklingningshastigheter är hämma transkription och därefter övervaka försvinnandet av den redan föreliggande mRNA. Graden av mRNA förfall kan sedan kvantifieras, och en noggrann halveringstid kan bestämmas att använda flera tekniker. I S. cerevisiae, protokoll som mäter mRNA halveringstider har utvecklats och omfattar hämma transkription av mRNA med hjälp stammar som hyser en temperaturkänslig allel av RNA-polymeras II, rpb1-1. Andra tekniker för att mäta mRNA halv liv omfattar hämning transkription med transkription hämmare såsom thiolutin eller 1,10-fenantrolin, eller alternativt, genom att utnyttja mRNA som är under kontroll av en reglerbar promotorsåsom galaktos inducerbara promotorn och Tet-Off-systemet. Här beskriver vi mätning av S. cerevisiae mRNA dämpfaktorer använder temperaturkänsliga allelen av RNA-polymeras II. Denna teknik kan användas för att mäta mRNA dämpfaktorer enskilda mRNA eller genomet hela.
Introduction
Transkriptionen och förfall av specifika mRNA är avgörande faktorer för genuttryck. Hastigheten för syntes och nedbrytning av specifika mRNA bestämmer steady state nivå på just den mRNA. De steady state-nivåer av mRNA reglerar överflöd av mRNA och avgöra hur mycket av varje mRNA är tillgänglig för proteinsyntes. Mätningar av mRNA halveringstider används i stor omfattning för att bestämma dämpfaktorn av mRNA. Specifik mRNA sönderfall i olika takt som är relaterade till funktioner i mRNA, funktionen av proteinet som kodas av mRNA och miljöförhållanden. Beroende på den teknik som används för att bestämma mRNA dämpfaktorer, kan mätningar dämpfaktor bestämmas antingen globalt eller för enskilda avskrifter. I jästen S. cerevisiae, de tekniker som används mest för att mäta total mRNA avklingningshastigheter innefattar utnyttjande av en jäststam som härbärgerar den temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II och kemisk transcriptional inhibitorer såsom thiolutin och 1,10-fenantrolin 1-5. Dessa metoder kan också användas för att mäta individuella mRNA avklingningshastigheter 4. Andra metoder kan också utnyttjas för att mäta mRNA avklingningshastigheter. Dessa metoder innefattar förhållningssätt till steady state märkning eller användning av mRNA-molekyler som uttrycks från en reglerad promotor som uttrycks endast i utvalda förhållanden. Var och en av dessa tekniker har vissa fördelar och begränsningar. Tekniken som beskrivs här utnyttjar den temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II. Denna metod använder S. cerevisiae som modell, men kan modifierats och utnyttjas i andra system med hjälp av specifika transkriptionshämningsteknik 6.
mRNA halveringstid mätningar med temperaturkänsliga allelen av RNA-polymeras II används flitigt både för genomet hela och individuella mätningar av mRNA förfall 4-5. Denna teknik kräver användning av en specific jäststam som hyser en temperaturkänslig allel av RNA-polymeras II, rpb1-1 1. Den logiska grunden för denna teknik är att exponering av temperaturkänsliga jäststam till icke-permissiva temperaturen hämmar mRNA-syntes. Därefter sönderfallet av preexisting mRNA övervakades vid olika tidpunkter efter transkription har inhiberats. Försvinnandet av den redan existerande mRNA övervakas genom att extrahera RNA från jästcellerna vid olika tidpunkter efter transkription har stängts av. De tidpunkter vid vilka jästcellerna skördas är förutbestämda av ett pilotexperiment, och beror på utskrifterna och systemet utreds. Snabbare tidpunkter används för kortlivat transkript, medan längre tidpunkter används för längre levde transkript. Efteråt avklingningen av mRNA övervakas av antingen Northern blot-analys, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Mätning av mRNA halveringstider med hjälp av en temperature känslig allel av RNA-polymeras II har sina fördelar. För det första är denna teknik enkelt och rakt framåt. För det andra, när jäststammen förvärvas eller alstras i laboratoriet halveringstid mätningar mRNA kan bestämmas på olika tillväxtbetingelser; för fastställande av miljöpåverkan på mRNA förfall. För det tredje kan mRNA dämpfaktorer övervakas genomet hela. Användning av andra tekniker transkription hämning har också fördelar och begränsningar. Till exempel, användning av en inducerbar promotor kräver subkloning för att generera ett mRNA som är under kontroll av den reglerade promotorn. Thiolutin är inte lätt tillgänglig och är dyrt när det finns. Dessutom thiolutin verkningsmekanism inte helt klarlagd, och det har rapporterats att påverka andra cellulära processer inklusive hämma mRNA förfall 7. Alternativt, 1,10-fenantrolin, är mer lättillgänglig. Dessutom är samtliga av de tekniker som används för att inhibera transkription kan PERTURB cellulär funktion och kan påverka olika mRNA i olika sätt. En utredare måste bestämma den lämpligaste metoden att använda i sina experimentella förhållanden för att uppnå de mest tillförlitliga resultat. För att avgöra vilken metod som är mest lämplig för deras tillämpning, behöver en forskare att identifiera avskrifter och funktion hos de proteiner som kodas av transkripten utreds. De mest tillförlitliga mätningar mRNA dämpfaktor är de som bestäms med hjälp av flera tekniker och visar samma dämpfaktor. Ingen enskild teknik är alltid det bästa, och den mest lämpliga tekniken beror på den specifika situationen.
Talrika studier i S. cerevisiae har mätt mRNA dämpfaktorer i olika förhållanden och genetisk bakgrund. Villkoren att mRNA avklingningshastigheter mäts i beroende av det specifika experimentet som undersöks. Mätning mRNA dämpfaktorer i olika cellulära miljöer avgör huruvida villkoren ärundersökta företrädesvis påverkar dämpfaktorer specifika mRNA. Dämpfaktorer mRNA kan också variera beroende på jäststammen som används. Till exempel kan mRNA-avklingningshastigheter bestämmas i vildtyp jästceller och jästceller med en icke fungerande nonsens-medierad mRNA-nedbrytning (NMD) vägen. Denna mRNA nedbrytningsvägen finns i alla eukaryota organismer som har undersökts hittills och det utlöser nedbrytning av mRNA som i förtid avsluta translation 8. NMD ursprungligen identifierades som en väg som degraderar mRNA med prematura termineringskodoner eller nonsenscodoner, men är nu erkänd som en väg som också reglerar uttrycket av icke-nonsens som innehåller naturliga mRNA. mRNA som är målen i vägen bryts snabbt ned i jästceller med en funktionell NMD vägen och stabiliseras i jästceller med en icke fungerande NMD väg. Således halveringstiderna för mRNA som är direkta mål för denna väg är kortare i vildtyp jäst cells jämfört med jästceller med en icke fungerande NMD väg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hämning av mRNA-syntes och övervakning mRNA omsättning i avsaknad av ny syntes är en metod som ofta används för att mäta mRNA dämpfaktorer. I S. cerevisiae, är mätning av mRNA avklingningshastigheter genom att hämma transkription med användning av temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II ett av de mest använda metoderna. Denna metod hämmar specifikt RNA-polymeras II. De mest kritiska stegen för bestämning av mRNA-avklingningshastigheter som använder denna teknik är: 1) Före skörd av jä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the author’s laboratory is supported by the Texas Higher Education Coordinating Board’s Norman Hackerman Advanced Research Program and start-up funds from Baylor University.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background | ||
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 .
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 .
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
