Summary
Steady state-nivån av specifika mRNA bestäms av graden av syntes och nedbrytning av mRNA. Genomvid mRNA nedbrytningshastigheter eller dämpfaktorer specifika mRNA kan mätas genom att bestämma mRNA halveringstider. Detta protokoll är inriktat på mätning av mRNA avklingningshastigheter i Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
mRNA steady state-nivåer varierar beroende på miljöförhållanden. Reglering av steady state ackumulering nivåer av ett mRNA ser till att rätt mängd protein syntetiseras för cellens specifika tillväxtbetingelser. Ett tillvägagångssätt för mätning av mRNA-avklingningshastigheter är hämma transkription och därefter övervaka försvinnandet av den redan föreliggande mRNA. Graden av mRNA förfall kan sedan kvantifieras, och en noggrann halveringstid kan bestämmas att använda flera tekniker. I S. cerevisiae, protokoll som mäter mRNA halveringstider har utvecklats och omfattar hämma transkription av mRNA med hjälp stammar som hyser en temperaturkänslig allel av RNA-polymeras II, rpb1-1. Andra tekniker för att mäta mRNA halv liv omfattar hämning transkription med transkription hämmare såsom thiolutin eller 1,10-fenantrolin, eller alternativt, genom att utnyttja mRNA som är under kontroll av en reglerbar promotorsåsom galaktos inducerbara promotorn och Tet-Off-systemet. Här beskriver vi mätning av S. cerevisiae mRNA dämpfaktorer använder temperaturkänsliga allelen av RNA-polymeras II. Denna teknik kan användas för att mäta mRNA dämpfaktorer enskilda mRNA eller genomet hela.
Introduction
Transkriptionen och förfall av specifika mRNA är avgörande faktorer för genuttryck. Hastigheten för syntes och nedbrytning av specifika mRNA bestämmer steady state nivå på just den mRNA. De steady state-nivåer av mRNA reglerar överflöd av mRNA och avgöra hur mycket av varje mRNA är tillgänglig för proteinsyntes. Mätningar av mRNA halveringstider används i stor omfattning för att bestämma dämpfaktorn av mRNA. Specifik mRNA sönderfall i olika takt som är relaterade till funktioner i mRNA, funktionen av proteinet som kodas av mRNA och miljöförhållanden. Beroende på den teknik som används för att bestämma mRNA dämpfaktorer, kan mätningar dämpfaktor bestämmas antingen globalt eller för enskilda avskrifter. I jästen S. cerevisiae, de tekniker som används mest för att mäta total mRNA avklingningshastigheter innefattar utnyttjande av en jäststam som härbärgerar den temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II och kemisk transcriptional inhibitorer såsom thiolutin och 1,10-fenantrolin 1-5. Dessa metoder kan också användas för att mäta individuella mRNA avklingningshastigheter 4. Andra metoder kan också utnyttjas för att mäta mRNA avklingningshastigheter. Dessa metoder innefattar förhållningssätt till steady state märkning eller användning av mRNA-molekyler som uttrycks från en reglerad promotor som uttrycks endast i utvalda förhållanden. Var och en av dessa tekniker har vissa fördelar och begränsningar. Tekniken som beskrivs här utnyttjar den temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II. Denna metod använder S. cerevisiae som modell, men kan modifierats och utnyttjas i andra system med hjälp av specifika transkriptionshämningsteknik 6.
mRNA halveringstid mätningar med temperaturkänsliga allelen av RNA-polymeras II används flitigt både för genomet hela och individuella mätningar av mRNA förfall 4-5. Denna teknik kräver användning av en specific jäststam som hyser en temperaturkänslig allel av RNA-polymeras II, rpb1-1 1. Den logiska grunden för denna teknik är att exponering av temperaturkänsliga jäststam till icke-permissiva temperaturen hämmar mRNA-syntes. Därefter sönderfallet av preexisting mRNA övervakades vid olika tidpunkter efter transkription har inhiberats. Försvinnandet av den redan existerande mRNA övervakas genom att extrahera RNA från jästcellerna vid olika tidpunkter efter transkription har stängts av. De tidpunkter vid vilka jästcellerna skördas är förutbestämda av ett pilotexperiment, och beror på utskrifterna och systemet utreds. Snabbare tidpunkter används för kortlivat transkript, medan längre tidpunkter används för längre levde transkript. Efteråt avklingningen av mRNA övervakas av antingen Northern blot-analys, kvantitativ PCR eller RNAseq.
Mätning av mRNA halveringstider med hjälp av en temperature känslig allel av RNA-polymeras II har sina fördelar. För det första är denna teknik enkelt och rakt framåt. För det andra, när jäststammen förvärvas eller alstras i laboratoriet halveringstid mätningar mRNA kan bestämmas på olika tillväxtbetingelser; för fastställande av miljöpåverkan på mRNA förfall. För det tredje kan mRNA dämpfaktorer övervakas genomet hela. Användning av andra tekniker transkription hämning har också fördelar och begränsningar. Till exempel, användning av en inducerbar promotor kräver subkloning för att generera ett mRNA som är under kontroll av den reglerade promotorn. Thiolutin är inte lätt tillgänglig och är dyrt när det finns. Dessutom thiolutin verkningsmekanism inte helt klarlagd, och det har rapporterats att påverka andra cellulära processer inklusive hämma mRNA förfall 7. Alternativt, 1,10-fenantrolin, är mer lättillgänglig. Dessutom är samtliga av de tekniker som används för att inhibera transkription kan PERTURB cellulär funktion och kan påverka olika mRNA i olika sätt. En utredare måste bestämma den lämpligaste metoden att använda i sina experimentella förhållanden för att uppnå de mest tillförlitliga resultat. För att avgöra vilken metod som är mest lämplig för deras tillämpning, behöver en forskare att identifiera avskrifter och funktion hos de proteiner som kodas av transkripten utreds. De mest tillförlitliga mätningar mRNA dämpfaktor är de som bestäms med hjälp av flera tekniker och visar samma dämpfaktor. Ingen enskild teknik är alltid det bästa, och den mest lämpliga tekniken beror på den specifika situationen.
Talrika studier i S. cerevisiae har mätt mRNA dämpfaktorer i olika förhållanden och genetisk bakgrund. Villkoren att mRNA avklingningshastigheter mäts i beroende av det specifika experimentet som undersöks. Mätning mRNA dämpfaktorer i olika cellulära miljöer avgör huruvida villkoren ärundersökta företrädesvis påverkar dämpfaktorer specifika mRNA. Dämpfaktorer mRNA kan också variera beroende på jäststammen som används. Till exempel kan mRNA-avklingningshastigheter bestämmas i vildtyp jästceller och jästceller med en icke fungerande nonsens-medierad mRNA-nedbrytning (NMD) vägen. Denna mRNA nedbrytningsvägen finns i alla eukaryota organismer som har undersökts hittills och det utlöser nedbrytning av mRNA som i förtid avsluta translation 8. NMD ursprungligen identifierades som en väg som degraderar mRNA med prematura termineringskodoner eller nonsenscodoner, men är nu erkänd som en väg som också reglerar uttrycket av icke-nonsens som innehåller naturliga mRNA. mRNA som är målen i vägen bryts snabbt ned i jästceller med en funktionell NMD vägen och stabiliseras i jästceller med en icke fungerande NMD väg. Således halveringstiderna för mRNA som är direkta mål för denna väg är kortare i vildtyp jäst cells jämfört med jästceller med en icke fungerande NMD väg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillväxt av jästceller
- Välj lämpliga jäststammar som ska utnyttjas för avklingningshastigheten mätningarna mRNA. Att hämma transkription använder temperaturkänsliga allelen av RNA-polymeras II, använd jäststammar som hyser rpb1-1 mutationen 1. Skaffa denna jäststam från ett laboratorium som redan har en, eller generera det i laboratoriet med hjälp av standardmetoder om en specifik genetisk bakgrund krävs 9.
- Använd steril teknik och förbereda jäst media med standardprocedurer 10. Om det krävs inget val, förbereda multimedia såsom YPD. Alternativt förbereda selektiv medier om jästcellerna är transformerade med plasmider och val krävs. Autoklavera media.
- Väx jästcellerna vid 28 ° C, vilket är den tillåtna temperaturen för denna jäststam. Gör detta i två steg:
- För den första O / N, odla jästcellerna i 5 ml tillväxtmedium till mättnad.
- Ställ in den andra O / N vid slutet av den andra dagen. För den andra O / N, ympa olika mängder av jästceller som från den första O / N i 100 till 150 ml av tillväxtmedium (som sträcker sig från 100 | il till 1 ml, 2 ml eller mer, beroende på när jästcellerna behöver vara skördas följande dag). Gör detta steg för att säkerställa att en av kulturerna är vid det korrekta OD 600 följande dag.
2. Skörda jästcellema
- Förbered dig på att skörda jästcellerna. Tidpunkten för detta steg är avgörande; märka alla nödvändiga rören och samla all nödvändig utrustning och material på ett ställe. Värm ett vattenbad till 39 ° C och förvärma två 15 ml provrör av tillväxtmedia vid 28 ° C och vid 60 ° C.
OBS: 15 ml tillväxtmedievolymen kan varieras beroende på antalet tidpunkter cellerna skall skördas. - Skörda jästcellerna när de når en OD 600 av 0,4 till 0,7. Överfer cellerna till 4-6 sterila 50 ml skruvlock flaskor. Centrifugera vid 7500 x g i en höghastighetscentrifug under 5 min vid RT.
- Kasta bort supernatanten och suspendera pellets i de 15 ml tillväxtmedier som jämvikt vid 28 ° C. Pool jästcellerna i en steril 250 ml kolv och jämvikt dem för ~ 5 min vid 28 ° C tillväxttemperatur.
- Efter jästcellerna har inställts på jämvikt vid tillväxttemperaturen, omedelbart lägga till de 15 ml av tillväxtmediet i jämvikt vid 60 ° C för att höja temperaturen till 39 ° C (den icke-permissiv temperatur) och omedelbart placera kolven i 39 ° C vattenbad . Se till att odlingsmediet förblir i 39 ° C vattenbad under de återstående cellavverknings åtgärder för att säkerställa att transkription är avstängd.
- Skörda cellerna vid olika tidpunkter efter att placera kolven i 39 ° C vattenbad. För första gången punkten, skörda cellerna omedelbart efter placering kolven vid 39 & #176; C. Skörda en 3 ml alikvot och distribuera 3 ml i två, 1,5 ml mikrorör. Pellets cellerna för 10 sekunder i en minicentrifug eller picofuge med snabb inbromsning och häll ut supernatanten.
- Omedelbart frysa pelleten i ett torris / etanol-bad eller i flytande kväve. Utse den första tidpunkten cellerna skördas vid som nolltidspunkten.
- Experimentellt bestämma tidpunkter cellerna skördas vid därefter genom ett pilotexperiment, beroende på mRNA av intresse. Normalt skörd jästceller vid följande tidpunkter: 0, 3, 6, 9, 12, 18, 25 och 35 minuter (Figur 2B). Om mRNA halveringstiden inte kan fastställas med hjälp av de ovan nämnda tidpunkter, justera dessa tidpunkter. Till exempel för mRNA med förväntade korta halveringstider, använda kortare tider punkter, (dvs, 0, 1, 2, 3, 4, 6, 9, 12 och 18 min) och för mRNA med förväntade långa halveringstider, förlänga tidpunkterna.
- Efter det att cellerna är hektarrvested, lagra dem i en -80 ° C frys tills RNA-extraktion utförs.
3. Extrahera RNA från jästcellerna
- För RNA-extraktion delen av protokollet, använd RNas fria tekniker för att förhindra nedbrytning av RNA genom RNaser. Förbered RNas gratis lösningar, glas och plastartiklar som ska användas vid extraktion av RNA.
- Extrahera RNA från jästcellerna enligt standardprotokoll. Normalt använder den varma fenolmetoden 12. Alternativt använder kit som kan användas för att extrahera RNA från jästceller.
- Bestäm mängden och renheten av RNA, normalt genom mätning av absorbansen vid A 260 och A 280 av 2 | il av RNA med hjälp av en Nanodrop. Bestäm koncentrationen av RNA från A 260. Baserat på koncentrationen, späd RNA till en ug / ul med hjälp av DEPC-behandlat vatten.
OBS: Förhållandet av A 260 / A 280 ger information om than renhet av RNA. En RNA-provet är rent om A 260 / A 280-förhållandet är 2,0 ± 0,1.
4. Northern blot-analys
OBS: Använd norra blottar att kvantifiera mRNA nivåer och få information om storleken på utskrifter. Dessutom använder nordliga blottar att upptäcka mRNA som ger flera isoformer av samma mRNA.
- Förbered en 1,0% -ig-formaldehydgel. Kör lika mängder av RNA-prov på agarosformaldehydgel genom elektrofores enligt standardprotokoll 12. Kör en RNA-stege vid sidan av RNA-prover och använda den för att bestämma storleken på RNA som upptäcks på den norra blot. Innan överföring RNA separerades på agarosformaldehydgel till ett membran, skär banan med RNA stege från gelén och visualisera med användning etidiumbromid.
OBS: Alternativt kan hela gelén färgades med etidiumbromid före överföringen av RNA. - ENfter RNA-prover har migrerat till ett lämpligt avstånd på gelén, överföra RNA till ett membran med hjälp RNas fria tekniker. Använd en av flera tillgängliga protokoll för att överföra RNA till membran 12-13. För att överföra RNA till ett membran, klippa membranet till ungefär samma storlek som gelén. Överför RNA enligt standardprotokoll 12.
- UV-tvär länka RNA till membranet med användning av en UV-tvärbindare enligt tillverkarens instruktioner. Alternativt baka membranet i en ugn inställd på 80 ° C under 1 h. Förvara membranet vid -20 ° C i en plastpåse på obestämd tid tills det hybridiseras till specifika prober.
OBS: Den torra membran kan också lagras vid RT mellan filterpapper.
5. Hybridisera Probes komplement till RNA av intresse för Membrane
OBS: Ett sätt att upptäcka mRNA på membranet är att hybridisera 32 P märkta DNA-sonder. VARNING: Researchers arbetar med 32 P behöver använda skyddande förfaranden för att förhindra kontaminering. Följ institutionella riktlinjer för användning av radioaktiva material.
- Förbered DNA-proben genom att märka 25-50 ng av det DNA som skall hybridiseras till membranet enligt standardprotokoll 12. Generera DNA-fragmentet genom PCR eller plasmid matsmältningen. Bestäm den specifika aktiviteten av DNA-sonden genom att räkna ett pl av den radiomärkta DNA-sonden efter de ej inkorporerade nukleotiderna avlägsnas 12.
- Värm förhybridisering / hybridiseringsbuffert vid 42 ° C. Använd ~ 10 ml av förhybridisering / hybridiseringsbuffert per 100 cm 2 av membranet 12.
- Hybridisera 1 - 5 x 10 6 cpm av radioaktivt märkt DNA-prob per ml hybridiseringsbuffert till membran O / N i en hybridiseringsugn att detektera mRNA av intresse 12. Kontrollera att hybridiseringsugn rotation under hybridiseringen är i en riktning somgör att hela membranet kan exponeras för hybridiseringslösningen, för att säkerställa korrekt hybridisering.
- Tvätta membranet två gånger vid RT under 15 min med 50 ml av 2x SSPE och en gång vid 65 ° C med 50 ml av 2x SSPE / 2% SDS under 15 min 12. Slå in membranet i plastfolie för att säkerställa att den inte torkar ut eller förorena fosforskärmen.
- Med hjälp av en Geiger-räknare, uppskatta intensiteten av radioaktiviteten på membranet.
OBS: Denna uppskattning säkerställer att membranet utsätts för Phosphor skärmen för lämplig tid. Använd längre exponeringstider för membran med låga mängder radioaktivitet. - För norra blöts, använd en laddningskontroll för att bekräfta att lika mängder RNA lastas på varje plats. För att göra detta, strippa membranet och reprobe det med ett RNA som inte påverkas av processen som undersöks. Skala membranet genom att placera den i ett glas fack som innehåller 200 ml kokande stripplösning (0,1% SDS / 0,01 XSSC) för 2 min. Häll ut stripplösningen och upprepa proceduren fem gånger 12.
Anmärkning. Ett exempel på en RNA användas som lastkontroll är SCR1 SCR1 är ett RNA-polymeras III-transkript som är stabil och riklig SCR1 RNA överflöd bör inte förändras signifikant under korta perioder av RNA-polymeras II hämning..
6. Kvantifiera RNA som är bunden till membranet
OBS: För att kvantifiera mängden radioaktivitet på membranet, utsätta membranet till en Phosphor skärm. Efter lämplig exponeringstid, skanna Phosphor skärmen med hjälp av en fosfor.
- Skanna Phosphor skärmen med instruktionerna från tillverkaren av fosfor.
- Kvantifiera mRNA vid varje tidpunkt. Kvantifiera mRNA nivåer med Imagequant programvara eller relaterad programvara. Normalisera mRNA vid varje tidpunkt till laddningskontroll. Om SCR1 användes som laddningskontroll, normalisera halveringstid northerns till SCR1.
- Halveringstiden av mRNA beräknas genom att dividera mängden mRNA som återstår vid varje tidpunkt genom mängden mRNA närvarande vid tidpunkten 0 (den initiala tidspunkten). Plotta procent mRNA återstående kontra tid på en semilogaritmisk tomt (figur 2C). Beräkna mRNA halveringstider med följande ekvation:
t 1/2 = -0,693 / k (negativ 0,693) - k är lutningen för den bäst anpassade linjen och t 1/2 är mRNA halveringstid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förmågan av detta protokoll att noggrant mäta mRNA dämpfaktorer beror på hämning av transkriptionen, skörd av jästceller vid lämpliga tidpunkter, och utnyttjande av RNas fria tekniker samtidigt utvinna RNA och norra blotting. Sondering för två kontroll mRNA kända för att vara instabila och stabila, respektive, ger förtroende för att experimentet fungerade. Till exempel kan detta åstadkommas genom probning med en prob som detekterar både CYH2 pre-mRNA och mRNA. Figur 2B visar försvinnandet av CYH2 pre-mRNA i vildtyp och NMD mutanta jäststammar vid olika tidpunkter efter transkription hämning . Den CYH2 pre-mRNA bryts ned snabbare i jästceller med en funktionell NMD väg (UPF1) i förhållande till jästceller med en icke fungerande NMD väg (upf1).
40fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Metod flödesschema. Mätning av mRNA dämpfaktor flödesschema
Figur 2. mRNA halveringstid av CYH2 -pre-mRNA och mRNA. (A) Schematisk representation av CYH2 pre-mRNA och CYH2-mRNA. CYH2 pre-mRNA är ineffektivt skarvas och transporteras till cytoplasman där den bryts ned av NMD reaktionsväg. Den CYH2 mRNA inte bryts ned av NMD vägen eftersom det saknar intron innehåller förtida stoppkodonet (PTC). (B) Halveringstid norra blottar av RNA som extraherats från vildtypen (UPF1) och NMD muterade stammar (upf1). De tidpunkter efter transcription hämning listas ovanför Northern blöts. Blottarna sonderades med radioaktivt märkt CYH2-DNA. (C) Ett diagram över% CYH2 pre-mRNA återstående mot tid i vildtyp (UPF1) och NMD mutanta stammar (upf1). Detta diagram visar att den CYH2 pre-mRNA bryts ned i en snabbare takt i vildtyp (UPF1) än i NMD mutanta jäststammar (upf1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hämning av mRNA-syntes och övervakning mRNA omsättning i avsaknad av ny syntes är en metod som ofta används för att mäta mRNA dämpfaktorer. I S. cerevisiae, är mätning av mRNA avklingningshastigheter genom att hämma transkription med användning av temperaturkänsliga allel av RNA-polymeras II ett av de mest använda metoderna. Denna metod hämmar specifikt RNA-polymeras II. De mest kritiska stegen för bestämning av mRNA-avklingningshastigheter som använder denna teknik är: 1) Före skörd av jästceller, se till att transkription har stängts av genom att upprätthålla kulturen vid 39 ° C; 2) Under RNA extraktion och RNA gelelektrofores stegen i protokollet säkerställa att RNas fria tekniker används; 3) Använd en kontroll RNA för normalisering för att se till att lika mängder av RNA laddades och att de experimentella behandlingar fungerar som förväntat; 4) Upprepa mätningarna mRNA avklingningshastighet minst tre gånger för att säkerställa reproducerbarhet end mätnoggrannheten halveringstiden.
rpb1-1 jäststammar normalt överförs till 37 ° C för att hämma transkription. Vi har emellertid funnit att vid 37 ° C inhibering av transkription sker ~ 3 min efter temperaturförändringen. Vid 39 ° C transkriptions hämning är omedelbar 4, 11. Emellertid är användningen av denna teknik för att bestämma mRNA-avklingningshastigheter har vissa begränsningar. Den primära begränsningen är att en speciell jäststam krävs. Som tidigare nämnts, kan denna jäststam antingen erhållas från andra laboratorier eller alstras i laboratoriet om en specifik jäst genetisk bakgrund krävs. När jäststammen erhålles, är denna teknik enkelt och rakt framåt. En andra begränsning är att metoden medför exponera jästcellerna för värmechock för att hämma transkription. Värme stress kan påverka cellulära processer inklusive dämpfaktor på särskilda mRNA. Exempelvis avklingningshastigheten av dessa mRNA that kodar för proteiner som är involverade i stress kan påverkas. Slutligen kan användningen av en jäststam med en mutation i RNA-polymeras II att resultera i produktion av alternativa transkript som beter sig annorlunda än de normala transkripten.
Som diskuterats i inledn är andra tekniker utnyttjas för att mäta mRNA dämpfaktorer i S. cerevisiae. Detta inkluderar hämning av transkriptionen använda kemikalier såsom thiolutin och 1-10-fenantrolin. Dessa tekniker är fördelaktiga genom att de kan göras med någon jäststam och mRNA dämpfaktorer kan också bestämmas genomet hela eller för enskilda endogena transkript. Dessutom kan mRNA dämpfaktor mätningar göras på olika fysiologiska förhållanden. Användbarheten av dessa läkemedel är begränsad av det faktum att de också kan påverka cellulära processer och påverka dämpfaktorer mRNA differentiellt. Dessutom är inte lätt tillgänglig och när tillgänglig thiolutinär dyrt.
Efter behärska denna teknik kommer att kunna bestämma mRNA dämpfaktorer enskilda mRNA eller genomet hela. Dessutom kan mRNA dämpfaktorer mätas på olika fysiologiska förhållanden att undersöka om olika förhållanden påverkar mRNA dämpfaktorer differentiellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High Speed Centrifuge | Eppendorf | 22628169 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Genescreen Plus membrane | PerkinElmer | 50-905-0169 | |
| Hybridization Oven | Fisher Scientific | 95-0030-01 | |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000 | |
| Phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | 28-9564-78 | |
| Typhoon phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | 29004080 | |
| UV cross-linker | GE Healthcare Life Sciences | 80-6222-31 | Alternatively the membrane can be baked in an oven set to 80° for 1 hour |
| NorthernMax prehybridization/hybridization buffer | Life Technologies | AM8677 | |
| Yeast strains harboring the rpb1-1 mutation | Yeast strains can be obtained from a laboratory or created with a specific background |
References
- Nonet, M., Scafe, C., Sexton, J., Young, R. Eukaryotic RNA polymerase conditional mutant that rapidly ceases mRNA synthesis. Mol. Cell. Biol. 7, 1602-1616 (1987).
- Santiago, T. C., Purvis, I. J., Bethany, A. J., Brown, A. J. The relationship between mRNA stability and length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 14 (21), 8347-8360 (1986).
- Jimenez, A., Tipper, D. J., Davies, J. Mode of action of thiolutin, an inhibitor of macromolecular synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Antimicrob Agents Chemother. 3 (6), 729-738 Forthcoming.
- Herrick, D., Parker, R., Jacobson, A. Identification and Comparison of stable and unstable mRNAs in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 10 (5), 2269-2284 Forthcoming.
- Grigull, J., Mnaimneh, S., Pootoolal, J., Robinson, M. D., Hughes, T. R. Genome-wide Analysis of mRNA Stability Using Transcription Inhibitors and Microarrays Reveals Postranscriptional Control of Ribosome Biogenesis Factors. Mol Cell Biol. 24 (12), 5534-5547 (2004).
- Tani, H., Akimitsu, N. Genome-wide technology for determining RNA stability in mammalian cells. RNA Biology. 9 (10), 1233-1238 (2012).
- Pelechano, V., Perez-Ortin, J. E. The transcriptional inhibitor thiolutin blocks mRNA degradation in yeast. Yeast. 25, 85-92 (2008).
- Kervestin, S., Jacobson, A. NMD: a multifaceted response to premature translational termination. Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 700-712 (2012).
- Kolodziej, P. A., Woychik, N., Liao, S. M., Young, R. A. RNA Polymerase II subunit composition, stoichiometry and phosphorylation. Mol Cell Biol. 10 (5), 1270-1275 (1990).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley and Sons, Inc.. (1998).
- Kebaara, B. W., Nazarenus, T., Taylor, R., Atkin, A. L. Genetic background affects relative nonsense mRNA accumulation in wild-type and upf mutant yeast strains Current Genetics). 43, 171-177 (2003).
- Kebaara, B. W., Baker, K. E., Patefield, K. D., Atkin, A. L. Analysis of Nonsense-Mediated mRNA Decay in Saccharomyces cerevisiae. Current Protocols in Cell Biology. 27 (27.3), 27.3.1-27.3.39 (2012).
- Hu, W., Coller, J. Methods for measuring mRNA Decay Rate in Saccharomycescerevisiae. Methods in Enzymology. 530, 137-155 (2013).
