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न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियाँ के लिए चिकित्सीय कारक की डिलिवरी के लिए इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं की उच्च throughput लक्षण वर्णन

Published: January 4, 2015 doi: 10.3791/52242
Automatic Translation
1, 1,3, 2,3, 2, 2, 1, 2,3
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University, 2Department of Genetics, Development and Cell Biology, Iowa State University, 3Biology Program, Iowa State University

Introduction

तंत्रिका तंत्र संबंधी विकार के उपचार के लिए उपयोगी उपचारों को लागू करने के साथ एक प्रमुख मुद्दा आगे अध: पतन को रोकने के लिए और भी समारोह की वसूली की सुविधा है कि प्रभावी तरीकों को विकसित करने में है। एक अभिनव रणनीति पहले उनके प्रत्यारोपण के लिए न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों के उत्पादन के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर स्टेम कोशिकाओं पूर्व vivo के लिए है। जीन थेरेपी का एक प्रकार के साथ युग्मित सेल आधारित चिकित्सा के इस संयोजन, तंत्रिका तंत्र में बीमारी या चोट प्रेरित neuronal मौत के उपचार के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करता है।

Neurotrophic कारकों परिपक्व न्यूरॉन्स के विकास और विकासशील न्यूरॉन्स के अस्तित्व के साथ ही रखरखाव और plasticity के लिए आवश्यक हैं। अध्ययन का एक नंबर मध्य और परिधीय तंत्रिका तंत्र में न्यूरॉन्स (सीएनएस और पीएन) के प्रारंभिक विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने में neurotrophic कारकों की महत्वपूर्ण भूमिका का प्रदर्शन किया है और वे भी इन विट्रो में और एक में पुनर्जनन को प्रोत्साहित कर सकते हैंतंत्रिका चोट एक की निर्मल मॉडल। मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) अत्यधिक सीएनएस में व्यक्त किया और तंत्रिका विकास, अन्तर्ग्रथनी plasticity और मरम्मत 2 को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। Glial सेल लाइन व्युत्पन्न neurotrophic कारक (GDNF) डोपामिनर्जिक और motorneurons 3 सहित न्यूरॉन्स के कई प्रकार के अस्तित्व को बढ़ावा देता है। इस प्रकार, तंत्रिका की मरम्मत के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति के तंत्रिका तंत्र के घायल या रोगग्रस्त क्षेत्रों के लिए neurotrophic कारकों की बहिर्जात स्रोतों प्रदान करना है।

Multipotent अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) क्षतिग्रस्त या रोगग्रस्त तंत्रिका तंत्र के इलाज के लिए चिकित्सकीय प्रोटीन की डिलीवरी के लिए महान क्षमता पकड़। वे, 2) multipotential क्षमता, 3) थोड़ा नैतिक चिंताओं, 4 अलगाव और रखरखाव का 1) रिश्तेदार आसानी सहित लाभ के एक नंबर है के बाद से MSCs की ट्रांसप्लांटेशन रोगी संगत सेल आधारित चिकित्सा के विकास के प्रयासों में काफी ध्यान आकर्षित किया है) और जीवित रहने के ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण 4,5 के लिए प्रत्यारोपण और 5) संभावित निम्नलिखित विस्थापित करने की क्षमता। आशाजनक परिणाम रीढ़ की हड्डी में चोट 6,7, स्ट्रोक 8,9, माइलिन कमी 10, और रेटिना अध: पतन 11-13 सहित विभिन्न neurodegenerative शर्तों के एक नंबर के लिए पशु मॉडल में भोले और अनुवांशिक इंजीनियर MSCs के उपयोग के साथ सूचित किया गया है। अनुवांशिक इंजीनियर स्टेम सेल से neurotrophic कारकों के वितरण के साथ कोशिका प्रत्यारोपण युग्मन एक उपन्यास और महत्वपूर्ण तंत्रिका मरम्मत की रणनीति है।

सेल आधारित चिकित्सीय कारक वितरण प्रणाली विकसित करने में एक आवश्यक कदम इंजीनियर कोशिकाओं के सामान्य स्वास्थ्य का निर्धारण करने के लिए है। जैसे, इस अध्ययन के प्रमुख उद्देश्य अनुवांशिक इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं की सामान्य वृद्धि मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। तेजी से कई सेल मानकों का आकलन करने के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण सेलुलर छवि आधारित उच्च के माध्यम से screenin को रोजगार के लिए हैजी (एचटीएस), अक्सर के रूप में उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) प्रक्रियाओं 14 के लिए भेजा। यह तकनीक स्वचालित छवि अधिग्रहण और विश्लेषण की अनुमति देता है और इस दृष्टिकोण स्टेम सेल अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है। इस परियोजना में हम अनुवांशिक इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं को एक HCS के सिस्टम को रोजगार के साथ सेल सब्सट्रेट वरीयताओं को और सेलुलर कार्यों के तेजी से लक्षण वर्णन और अनुकूलन के लिए अनुमति देता है कि एक रूपरेखा प्लेटफार्म विकसित की है।

Protocol

96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए 1. सब्सट्रेट तैयारी

  1. विभिन्न substrates और सेल प्रकार की रूपरेखा 96 अच्छी तरह से थाली का एक नक्शा बनाने के लिए (चित्रा 1) की जांच की जाए।
  2. विभिन्न substrates [पाली एल Lysine, फ़ाइब्रोनेक्टिन, मैं laminin, और entactin-कोलेजन चतुर्थ-laminin (ईसीएल) कोलेजन प्रकार], एक 96 अच्छी तरह से multiwell थाली और एक बाँझ सेल संस्कृति में एक काम स्टेशन तैयार करने का जायजा समाधान प्राप्त हुड।
  3. (इस एकाग्रता पहले से कोशिकाओं के विकास और प्रसार के लिए एक सब्सट्रेट एकाग्रता पर निर्भर परख के आधार पर निर्धारित किया गया था) 5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में शेयर गिराए द्वारा व्यक्तिगत substrates के तैयार करें। एक बाँझ जलाशय में गिरने से पहले एक भंवर का उपयोग कर मिलाएं।
  4. 96 अच्छी तरह से नक्शा (चित्रा 1) के अनुसार प्रत्येक कुएं में सब्सट्रेट समाधान के 100 μl जोड़ें (एक 12- या 8 चैनल micropipette का एक 96 अच्छी तरह से थाली में micropipetting के लिए सुविधाजनक है)। Parafilm का एक पट्टी का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से थाली करने के ढक्कन सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात दुकान।

2. सेल चढ़ाना और समय चूक इमेजिंग

नोट: माउस MSCs वयस्क C57BL / 6 चूहों की अस्थि मज्जा से अलग और एक पक्षपाती सेल लाइन के रूप में बनाए रखा गया। Lentiviral वेक्टर के कूट BDNF (एल.वी.-BDNF का उपयोग कर, और glial सेल व्युत्पन्न neurotrophic कारक (मानव सीडीएनए GDNF); MSCs मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (मानव सीडीएनए BDNF) स्रावित करने के लिए उन्हें करने के लिए इंजीनियर lentiviral वैक्टर का उपयोग कर संक्रमित थे सीएमवी-BDNF-IRES -GFP), GDNF (एल.वी.-GDNF; सीएमवी-GDNF-IRES GFP), और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP, एल.वी.-GFP; सीएमवी GFP)।
नोट: माउस mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के लिए संस्कृति मीडिया (MSCS) 10 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 10% हाइब्रिडोमा योग्य भ्रूण गोजातीय सीरम, 10% घोड़े सीरम, 2 मिमी एल glutamine, और 10,000 यू / एमएल पेनिसिलिन, जिसमें Iscove संशोधित है Dulbecco माध्यम है । माउस MSCs (MSCS, GFP MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-एम के पांच अलग-अलग प्रकारअनुसूचित जातियों और BDNF / GDNF-GFP-MSCS) T75 सेल संस्कृति बोतल में के बारे में 30% संगम पर चढ़ाया गया।

  1. सेल चढ़ाना
    1. दो बार, अगले दिन पर, आकांक्षा से सब्सट्रेट समाधान निकालें और बाँझ पीबीएस के लगभग 200 μl के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला। अंतिम पीबीएस कुल्ला करने के बाद प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया (200 μl / अच्छी तरह से) जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% संतुलन के लिए सीओ 2 पर सेट एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 96 अच्छी तरह से थाली रखें।
    2. 96 अच्छी तरह से थाली इनक्यूबेटर में equilibrating जाता है, कोशिकाओं फसल विकास मीडिया को इकट्ठा करके (T75 बोतल में MSCs कटाई / चढ़ाना के समय में लगभग 70% मिला हुआ होना चाहिए) T75 कुप्पी से (के रूप में वातानुकूलित मीडिया के लिए कहा गया है) और बाँझ शर्तों के तहत एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में भंडारण (इस वातानुकूलित मीडिया से नीचे कदम 2.1.4 में इस्तेमाल किया जाएगा)।
    3. कुप्पी बाँझ पीबीएस के 8 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से चक्कर आने और फिर पीबीएस बंद पिपेट और 0.05% trypsin के 1 मिलीलीटर और 0.01% जोड़नेEDTA समाधान T75 कुप्पी की संस्कृति सतह से कोशिकाओं को अलग करने के लिए। चरण विपरीत प्रकाशिकी के साथ सुसज्जित एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कुप्पी को देखने के द्वारा सेल टुकड़ी मॉनिटर।
    4. कोशिकाओं को अलग कर दिया है, तुरंत कुप्पी (कदम 2.1.2 में एकत्र) वातानुकूलित मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ने। सेल निलंबन लीजिए और गोली कोशिकाओं के लिए 450 XG पर 4 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र के लिए स्थानांतरण।
    5. सतह पर तैरनेवाला निकालें और ताजा के 200 μl में सेल गोली resuspend और (37 डिग्री सेल्सियस) सेल संस्कृति मीडिया गरम।
    6. एक hemocytometer का उपयोग एक trypan नीले व्यवहार्य सेल गिनती प्रदर्शन से सेल निलंबन में कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करते हैं। लगभग 300 कोशिकाओं के घनत्व / कुएं में 96 अच्छी तरह से थाली के उचित कुओं में कोशिकाओं थाली।
    7. कोशिकाओं में से प्रत्येक की आबादी के लिए इन चरणों को दोहराएँ।
  2. समय चूक इमेजिंग
    1. MSCs के सभी चढ़ाया जाने के बाद, जगह2 घंटे के लिए एक मशीन में 96 अच्छी तरह से थाली MSCs सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए।
    2. HCS के प्रणाली शुरू और सिस्टम संतुलित करने के लिए दो घंटे के लिए प्रतीक्षा करें। 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पर्यावरण नियंत्रक सेट और एक निरंतर हवा स्रोत की आपूर्ति HCS प्रणाली पर्यावरण कक्ष के लिए हवा में 5% सीओ 2 से युक्त एक मिश्रित गैस सिलेंडर कनेक्ट।
    3. 2 घंटा संतुलन अवधि के बाद इनक्यूबेटर से 96 अच्छी तरह से थाली निकालें और HCS प्रणाली की कोशिकाओं की वृद्धि के चेंबर में सीधे जगह है। संतुलन प्लेट के किसी भी गर्मी से संबंधित विस्तार के लिए खाते हैं और फिर थाली सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करने के लिए छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर शुरू करने के लिए 30 मिनट की अनुमति दें।
    4. इमेजिंग के लिए 20X उद्देश्य का चयन करें। [यानी, आदि फ़ाइब्रोनेक्टिन पर GFP-MSCs (एक्स 2 प्रतिकृति 30 शर्तों = कुल 60 कुओं की कुल के लिए 6 substrates के एक्स 5 एमएससी उपप्रकार)] समय चूक इमेजिंग की स्थापना के लिए शर्त के अनुसार दो कुओं का चयन करें। साथ इमेजिंग के लिए दो साइटों चुनेंअच्छी तरह से प्रत्येक में।
    5. इमेजिंग के लिए सही प्रकाश तरंग दैर्ध्य चुनें।
      नोट: दो अलग अलग तरंग दैर्ध्य (चरण विपरीत और GFP प्रतिदीप्ति) समय चूक इमेजिंग के लिए चयन किया गया था।
    6. लेजर ऑटोफोकस का उपयोग कर अच्छी तरह तल पर ध्यान केंद्रित करने और एक अनुकूलित फोकल हवाई जहाज़ को खोजने के लिए कई साइटों और कई कुओं के लिए परीक्षण छवियों ले।
    7. फोकस स्थापित किया गया है, सभी 60 कुओं (120 साइटों) के लिए 48 घंटे के लिए छवियों को हर 5 मिनट पर कब्जा करने लगते हैं।
    8. HCS के सिस्टम से 96 अच्छी तरह से थाली को हटाने के द्वारा कोशिकाओं को हर 24 घंटा फ़ीड। प्रत्येक से मीडिया के 75 μl अच्छी तरह से निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए नए सिरे से मीडिया के 100 μl जोड़ने (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ पर इस ताजा मीडिया संतुलित करना 2)।
    9. समय चूक प्रयोग के अंत में, HCS के सिस्टम से 96 अच्छी तरह से थाली हटा दें। बाँझ शर्तों के तहत, अच्छी तरह से प्रत्येक से वातानुकूलित मीडिया नमूने एकत्र और एक अन्य 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए इन नमूनों हस्तांतरण।
      नोट: ये नमूने आगे analys के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैneurotrophic कारकों के लिए एलिसा प्रदर्शन कर रहा है।
    10. ऐसे Ki67 सेल प्रसार परख या propidium आयोडाइड लाइव / मृत धुंधला परख (विवरण नीचे देखें) के रूप में अतिरिक्त assays के लिए सुसंस्कृत MSCs के साथ 96 अच्छी तरह से थाली तैयार है।
    11. नीचे खंड 5 में वर्णित के रूप में सेल प्रवास / सेल ट्रैकिंग के लिए समय चूक इमेजिंग विश्लेषण करते हैं।

3. Ki67 सेल प्रसार और propidium आयोडाइड लाइव / मृत परख

  1. Ki67 सेल प्रसार परख (Immunocytochemistry)
    1. 0.1 एम फॉस्फेट (पीओ 4) एक मिनट के लिए दो बार के लिए बफर के साथ सेल संस्कृतियों कुल्ला। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ संस्कृति को ठीक करें। पीएफए ​​निकालें और सात मिनट में तीन बार के लिए पीबीएस के साथ कुओं कुल्ला।
    2. अंतिम कुल्ला करने के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से एक के लिए अवरोधक समाधान के 100 μl (फॉस्फेट बफर खारा, 5% सामान्य गधा सीरम, 0.4% गोजातीय एल्बुमिन सीरम, और 0.2% ट्राइटन X-100) जोड़नेएन डी 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 200: 1 के एक काम के अनुपात में अवरोधक समाधान में गिराए द्वारा प्राथमिक एंटीबॉडी, खरगोश विरोधी Ki67, तैयार करें।
    3. अवरोधक समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl लागू होते हैं। 96 अच्छी तरह से थाली कवर और रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
    4. अगले दिन, एंटीबॉडी समाधान निकालें और 7 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के साथ कुल्ला।
    5. माध्यमिक एंटीबॉडी तैयार करें, गधा विरोधी खरगोश Cy3 एक के एक काम के अनुपात में अवरुद्ध समाधान में: 500। 100: 1 के एक कमजोर पड़ने पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान करने के लिए DAPI के परमाणु दाग ​​जोड़ें। पिछले पीबीएस कुल्ला के हटाने के बाद, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी / DAPI के समाधान के 100 μl लागू होते हैं। 90 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी / DAPI के समाधान निकालें और 7 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला। इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली और दुकान को कवर किया।
  2. Propidium आयोडाइड लाइव / मृत परख
    1. नीचे के रूप में वर्णित propidium आयोडाइड (पीआई) अपवर्जन परख द्वारा कोशिका मृत्यु उपाय।
    2. संस्कृति मीडिया में 1.5 माइक्रोन की एकाग्रता में propidium आयोडाइड दाग समाधान तैयार है।
    3. उन कोशिकाओं को मारने के इरादे से 2 मिनट के लिए MSCs की एक अच्छी तरह से करने के लिए 70% इथेनॉल के 100 μl जोड़ें। यह अच्छी तरह से गड़बड़ी दाग ​​के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। MSCs के बहुमत गड़बड़ी से सना हुआ कोशिका मृत्यु का संकेत होगा। इथेनॉल समाधान निकालें।
    4. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए propidium आयोडाइड दाग समाधान के 100 μl जोड़ें और एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. 1 मिनट, 2 बार के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर के साथ कोशिकाओं कुल्ला। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.1 एम P0 के चार बफर में 4% पीएफए ​​के साथ कोशिकाओं को ठीक करें। सात मिनट के लिए तीन बार पीएफए ​​निकालें और पीबीएस के साथ कुल्ला।
    6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरोधक समाधान में पतला DAPI के समाधान (01:50) के साथ सेते हैं। साथ सभी कुओं कुल्ला7 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस।
    7. DAPI के समाधान निकालें और 7 मिनट, 3 बार के लिए पीबीएस के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला। इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 96 अच्छी तरह से थाली और दुकान को कवर किया।

4. स्वचालित इमेजिंग और Multiwavelength स्कोरिंग विश्लेषण

  1. एक 96 अच्छी तरह से थाली लोड HCS के सिस्टम में (पहले Ki67 immunolabeling या propidium आयोडाइड दाग के लिए प्रसंस्कृत) और 20 मिनट HCS के सिस्टम छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर ओपन के लिए थाली संतुलित करने की अनुमति देते हैं।
  2. कोशिकाओं ऑटो एक्सपोजर समारोह का उपयोग करके रहते हैं और ब्याज की प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए ऑफसेट की गणना जिसमें जेड विमान को खोजने के 1 पर binning कैमरा और 2 का एक लाभ सेटिंग का उपयोग 10X उद्देश्य के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स चुनें। इस विश्लेषण के लिए, DAPI (W1), Cy3 (डब्ल्यू 2), और FITC (W3) के लिए छवियों पर कब्जा। नकारात्मक नियंत्रण कुओं छवि अधिग्रहण के लिए कोई संकेत दिखा जिस पर अधिकतम तीव्रता के स्तर चुनें। इस सेटिंग की पुष्टि स्थिति के लिए उपयुक्त हैitive कुओं।
  3. थाली मोल। छवियों को पकड़ने और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के डेटाबेस में उन्हें दुकान।
  4. छवियों का अधिग्रहण किया गया है एक बार, छवियों से खुला छवि अधिग्रहण और विश्लेषण ऑफ़लाइन सॉफ्टवेयर और समीक्षा थाली डेटा से ऊपर का अधिग्रहण किया।
  5. बहु तरंगदैर्ध्य स्कोरिंग विश्लेषण का चयन करें। प्रत्येक तरंग दैर्ध्य के लिए न्यूनतम और अधिकतम तीव्रता विन्यस्त करें।
    नोट: DAPI का पता लगाने के लिए प्रत्येक दिखाई दे नाभिक के चारों ओर धुंधला निशान चाहिए। Cy3 Ki67 immunoreactivity (आईआर) के साथ सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाने चाहिए और नकारात्मक नियंत्रण के तहत आईआर का पता नहीं करना चाहिए। Cy3 Ki67 आईआर के लिए, अनुमानित न्यूनतम चौड़ाई लगभग अधिकतम चौड़ाई 30 माइक्रोन था, 7 माइक्रोन था, स्थानीय पृष्ठभूमि से ऊपर तीव्रता 150 ग्रे स्तर था, और न्यूनतम दाग क्षेत्र 50 माइक्रोन 2 था।
  6. सभी पदों के लिए भागो विश्लेषण। स्प्रेडशीट में देखने के लिए डेटा निर्यात करें।

5. सेल ट्रैकिंग

  1. ओपन छवि acquisition और विश्लेषण कार्यक्रम पर क्लिक करें और "समीक्षा प्लेट डाटा [डीबी] ...", ब्याज की थाली का चयन।
  2. "ठीक है बनाम टाइम" के रूप में डेटा देखें।
  3. वांछित चयन पर छोड़ दिया क्लिक करके "साइट" अनुभाग से साइटों में से एक को चुनें। चुनें तहत ... "संचारित" "तरंग दैर्ध्य:"। राइट 96 अच्छी तरह से थाली टेम्पलेट में अच्छी तरह से लक्ष्य पर क्लिक करें और "लोड छवियाँ" पर क्लिक करें।
  4. "क्षुधा" और फिर "ट्रैक वस्तुएँ" पर क्लिक करके कोशिकाओं को ट्रैक करें।
  5. का प्रयोग करें "डायनेमिक डेटा एक्सचेंज (डीडीई)" जैसे डेटा, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल निर्यात करने के लिए प्रारूप का चयन करने के लिए।
  6. मूल, डेल्टा एक्स और डेल्टा y के लिए जैसे निर्यात, बीता समय, वस्तु संख्या, दूरी, समय अंतराल, वेग, निरपेक्ष कोण, दूरी के आँकड़ों पर नज़र रखने के लिए चुनें।
  7. लक्ष्य कोशिकाओं पर "Ctrl कुंजी + वाम क्लिक करें" के साथ ब्याज की प्रत्येक कोशिका टैग करें।
  8. ट्रैक कोशिकाओं। यदि आवश्यक हो, / बंद करो "ईएससी" कुंजी के साथ कोशिकाओं के अनुचित ट्रैकिंग बदलने के लिए और फिर सेटिंग्स समायोजित करें।
  9. सेल ट्रैकिंग पूरा हो गया है के बाद, "लॉग डेटा" के साथ डेटा को बचाने के।

Representative Results

एमएससी विकास मापदंडों अलग substrates पर MSCs के विभिन्न आबादी संवर्धन द्वारा जांच की गई। एमएससी उपप्रकार (MSCS, GFP MSCs, BDNF-GFP-MSCs, GDNF-GFP-MSCs, और BDNF / GDNF-GFP-MSCS) के पाँच अलग अलग आबादी 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें अलग से पूर्व लेपित में चढ़ाया गया चित्रा 1 में सचित्र के रूप में substrates। संवर्धन के चार दिनों के बाद, प्लेटें तय की और immunolabeled और / या उचित अभिकर्मकों के साथ दाग और फिर HCS के सिस्टम का उपयोग कर जांच की और छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के साथ आयोजित विश्लेषण किया गया।

चित्रा 1
चित्रा 1:। टेम्पलेट के रूप में दिखाया प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए 96 अच्छी तरह से थाली टेम्पलेट 96 अच्छी तरह प्लेटें विभिन्न substrates और कुओं के साथ लेपित रहे थे इंजीनियर स्टेम कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त थे। एक उदाहरण के रूप में, केवल wel केपंक्तियों बीएफ में LS इस प्रयोग में इस्तेमाल किया गया। पंक्तियाँ ए, जी और एच खाली छोड़ दिया गया। लघुरूप - MSCs: mesenchymal स्टेम सेल; GFP-MSCs: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त MSCs; BDNF-GFP-MSCs: मस्तिष्क neurotrophic कारक-GFP- व्यक्त MSCs ली गई; GDNF-GFP-MSCs; Glial neurotrophic कारक-GFP- व्यक्त MSCs सेल व्युत्पन्न; BDNF / GDNF-GFP-MSCs; BDNF और GDNF- GFP- व्यक्त MSCs; ईसीएल: Entactin-कोलेजन चतुर्थ-Laminin)।

DAPI के counterstaining द्वारा पीछा विरोधी Ki67 immunolabeling, विभिन्न substrates इंजीनियर MSCs (2A चित्रा) के विभिन्न आबादी के प्रसार को प्रभावित किया है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Ki67 प्रतिजन की अभिव्यक्ति सेल चक्र के जी 1, एस, जी 2 देर और एम चरणों के दौरान अधिमान्यतया होता है, और आराम चरण में कोशिकाओं (जी 0) में पता नहीं है, और इसलिए प्रसार 15 के लिए एक सेलुलर मार्कर के रूप में उपयोगी है । '4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) आमतौर पर इस्तेमाल किया नू हैडीएनए 16 के क्षेत्रों में करने के लिए बाध्य करने पर नीले रंग प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है कि स्पष्ट और गुणसूत्र counterstain। एक क्षेत्र में कोशिकाओं की कुल संख्या DAPI के दाग नाभिक की संख्या की गणना के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। चित्रा 2B में सचित्र के रूप में भिन्नता proliferating MSCs के प्रतिशत में वहां गया था, हालांकि, सभी substrates फिर भी एमएससी उपप्रकार से प्रत्येक के लिए काफी सेल प्रसार का समर्थन किया।

चित्रा 2
चित्रा 2: Ki67 सेल प्रसार परख। (ए) के विलय, Ki67 immunolabeling (लाल) और DAPI (नीला) परमाणु धुंधला की डबल फ्लोरोसेंट छवि। MSCs की कई Ki67 एंटीबॉडी (लाल) के साथ immunolabeled थे। स्केल बार = 50 माइक्रोन। Polystyrene (पीएस) पर हो एमएससी उपप्रकार immunolabeled Ki67 के प्रतिशत, पाली एल Lysine (पीएलएल) illustrating (बी) के बार ग्राफ, फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजनइन विट्रो (DIV) में 5 दिनों के लिए मैं, laminin, या entactin-कोलेजन चतुर्थ-laminin (ईसीएल) के substrates टाइप करें। एन एक प्रयोग =। हर बार हर हालत के लिए दो कुओं से 8 imaged साइटों से जमा डेटा का औसत प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Propidium आयोडाइड (पीआई) धुंधला विभिन्न substrates सेल अस्तित्व (चित्रा 3) को प्रभावित किया है कि क्या मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Propidium आयोडाइड आमतौर पर इस्तेमाल किया लाल फ्लोरोसेंट परमाणु और गुणसूत्र counterstain है। Propidium आयोडाइड झिल्ली impermeant है और आम तौर पर व्यवहार्य कोशिकाओं से बाहर रखा गया है, और इस तरह एक जनसंख्या में मृत कोशिकाओं का पता लगाने के लिए उपयोगी है। एक क्षेत्र के भीतर सभी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस तरह के DAPI के रूप में एक सामान्य परमाणु लेबल के साथ संयुक्त जब किसी स्थिति के भीतर मृत कोशिकाओं का अनुपात निर्धारित किया जा सकता है। पीआई पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत की जांच की सभी substrates पर कम था (चित्रा 3)। पीआई अभिकर्मक के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, MSCs युक्त कुछ कुओं, 70% इथेनॉल में चित्रा 3B और 3C में सचित्र के रूप में गड़बड़ी लेबल की कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत है, जिसके परिणामस्वरूप अधिकांश कोशिकाओं को मारने के लिए जाना जाता हालत incubated रहे थे (इथेनॉल सकारात्मक व्यवहार किया नियंत्रण)।

चित्रा 3
चित्रा 3: propidium आयोडाइड कोशिका मृत्यु परख। (ए) के विलय, propidium आयोडाइड (लाल) और DAPI (नीला) धुंधला के लिए डबल फ्लोरोसेंट छवि। व्यवहार्य कोशिकाओं के सभी के नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे थे हालांकि, कोई propidium आयोडाइड धुंधला MSCs। (बी) के लगभग सभी MSCs 70% इथेनॉल के लिए जोखिम निम्नलिखित propidium आयोडाइड के साथ दाग थे में पाया गया था। एक में स्केल सलाखों और बी = 100 माइक्रोन। Propidium आयोडाइड (पीआई) का प्रतिशत illustrating (सी) बार ग्राफ दाग एमएससी उपप्रकारpolystyrene (पीएस), पाली एल Lysine (पीएलएल), फ़ाइब्रोनेक्टिन, इन विट्रो (DIV) में 5 दिनों के लिए कोलेजन प्रकार मैं, laminin, या entactin-कोलेजन चतुर्थ-laminin (ईसीएल) substrates पर हो गई है। इथेनॉल नियंत्रण: इस हालत पीआई धुंधला अभिकर्मक के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य किया। पीआई दाग निम्नलिखित इथेनॉल उपचार के अधीन सबसे कोशिकाओं मर चुका है और इस प्रकार सकारात्मक पीआई अभिकर्मक के लिए दाग रहे हैं। एन एक प्रयोग =। हर बार हर हालत के लिए दो कुओं से 8 imaged साइटों से जमा डेटा का औसत प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

, सेल प्रवास समय चूक डिजिटल माइक्रोस्कोपी और HCS के सिस्टम पर प्रेषित प्रकाश / पर्यावरण कक्ष प्रणाली का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था इंजीनियर MSCs के व्यवहार पर विभिन्न substrates के संभावित प्रभाव की जांच करने के लिए (पूरक 1 वीडियो देखें)। एकाधिक साइटों / अच्छी तरह समय व्यतीत imaged किया गयाऔर छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम का उपयोग कर विभिन्न substrates पर बढ़ती MSCs के विभिन्न उप-जनसंख्या के लिए सेल प्रवास दरों की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्रा 4C में दिखाया गया के रूप में सामान्य में, MSCs के सभी उपप्रकार बाह्य मैट्रिक्स में लिपटे सतहों (fibronectin, मज्जा, laminin और ईसीएल) और गैर-लेपित polystyrene के सतहों पर धीमी पर सबसे तेजी से माइग्रेशन दर दिखाया।

चित्रा 4
चित्रा 4:। सेल ट्रैकिंग और प्रवास MSCs छवि अधिग्रहण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ नज़र रखी। 29 घंटा बाद में समय चूक इमेजिंग सत्र के अंत में कम समय चूक इमेजिंग और (बी) (ए) शुरू से ही प्रेषित प्रकाश और प्रतिदीप्ति छवियों के overlayed छवियों (पूरक 1 वीडियो देखें)। सेल प्रवास पटरियों रंगीन ली द्वारा संकेत कर रहे हैंNES। स्केल बार:। 50 माइक्रोन (सी) बार ग्राफ औसत प्रवास दरों illustrating (माइक्रोन / घंटा के रूप में व्यक्त) एमएससी उपप्रकार के लिए (पी एस) Polystyrene पर हो, पाली एल Lysine (पीएलएल), फ़ाइब्रोनेक्टिन, कोलेजन प्रकार मैं, laminin, इन विट्रो (DIV) में दो दिनों के लिए या entactin-कोलेजन चतुर्थ-laminin (ईसीएल) के substrates। एन एक प्रयोग =। हर बार हर हालत के लिए दो कुओं से कम से कम 10 imaged कोशिकाओं के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

साथ में ले ली, इन परिणामों अनुवांशिक इंजीनियर MSCs के इन उप-जनसंख्या समान विकास गुणों को प्रदर्शित कि प्रारंभिक सबूत प्रदान करते हैं। इन परिणामों के lentiviral इस स्क्रीनिंग के मंच का उपयोग कर जांच की वृद्धि मानकों पर कोई नाटकीय पहचाने जाने हानिकारक प्रभाव प्रेरित इन MSCs की आनुवंशिक संशोधनों मध्यस्थता मजबूर सबूत है कि प्रदान करते हैं।

पूरक 1 वीडियो समय चूक डिजिटल वीडियो। प्रवास पथ दो MSCs के लिए है [1 (हरी ट्रैकिंग लाइन) और 2 (ब्लू ट्रैकिंग लाइन) के रूप में संकेत] सचित्र हैं। वीडियो एक 29 घंटा अवधि के दौरान कब्जा कर लिया। छवियाँ हर 5 मिनट पर कब्जा कर लिया गया था। GFP- व्यक्त MSCs के प्रतिदीप्ति छवियों वीडियो तैयार करने में समय चूक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था। कैलिब्रेशन बार 50 माइक्रोन =। विश्लेषण के इस प्रकार के सेल प्रवास और कोशिका विभाजन सहित सेल के व्यवहार की जांच के लिए उपयोगी है।

Discussion

वयस्क mesenchymal स्टेम सेल (MSCS) एक सेलुलर और जीन डिलीवरी आधारित चिकित्सा के संयोजन एक प्रयोगात्मक रणनीति के विकास के लिए एक आकर्षक सेल प्रकार के होते हैं। MSCs 17,18 लद / फर्क उपयुक्त प्रेरण के साथ neuronal और glial प्रजातियों में transdifferentiating, mesodermal वंश की कोशिकाओं में फर्क करने में सक्षम multipotent हैं, और काफी plasticity के प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, MSCs प्रत्यारोपित और neurodegenerative शर्तों 19 सहित विकारों के एक नंबर, के लिए पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन में प्रभावी सिद्ध किया गया है। MSCs की चिकित्सीय प्रभावकारिता अच्छी तरह से उनके लिए फायदेमंद विरोधी प्रफलन, विरोधी भड़काऊ और विरोधी apoptotic गतिविधियों में 20 की वजह से जाना जाता है। MSCs की संभावना भी चोट या बीमारी से 21 की साइटों पर प्रत्यारोपण निम्नलिखित भोले MSCs के साथ जुड़े न्यूरोप्रोटेक्टिव गुणों के लिए योगदान देता है, जो विभिन्न neurotrophic और वृद्धि कारकों, उत्पादन और स्रावित करने के लिए जाना जाता है। जन्मदिनrtantly, MSCs आनुवंशिक रूप से संयुक्त सेलुलर और जीन थेरेपी आधारित अनुप्रयोगों के लिए neurotrophic कारकों की निरंतर वितरण के लिए संशोधित किया जा सकता है और सीएनएस 11,19,22 को चोट या बीमारी के पशु मॉडल की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है।

एक संयुक्त सेलुलर और जीन थेरेपी आधारित रणनीति विकसित करने में, यह कोशिकाओं के स्वास्थ्य को ध्यान से इन विट्रो के लिए उनके व्यापक उपयोग करने से पहले, और विशेष रूप से विवो अनुप्रयोगों में मूल्यांकन किया है कि महत्वपूर्ण है। अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (HCS) दृष्टिकोण का उपयोग सेल स्वास्थ्य और फिटनेस पर आनुवंशिक संशोधनों के परिणामों का अध्ययन करने के क्रम में इंजीनियर और नियंत्रण एमएससी लाइनों के कई आबादियों की जांच की। सामान्य में, HCS के सेलुलर छवि आधारित उच्च throughput प्रदर्शन 14 को दर्शाता है। इस स्क्रीनिंग दृष्टिकोण स्थानिक के कई स्तरों (दिनों के लिए मिसे) (subcellular के लिए सेल) और लौकिक रेस में सेलुलर phenotypes की एक मात्रात्मक आकलन परमिटविभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों भर olution। सेल प्रसार, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFP), कोशिका मृत्यु, और सेल गतिशीलता / माइग्रेशन: हम निम्नलिखित मानकों पर सब्सट्रेट वरीयता में संभव मतभेद पहुँचा इस दृष्टिकोण का उपयोग करना। प्रयोगों से 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली प्रारूप में डिजाइन किए गए थे। एक ही थाली के भीतर हम नियमित तौर पर lentiviral-transduced कोशिकाओं के विभिन्न एमएससी आबादी के लिए प्रत्येक पैरामीटर के लिए सम्मान के साथ संभव सब्सट्रेट संबंधी मतभेद की जांच की और मूल के साथ इंजीनियर MSCs, गैर transduced MSCs की तुलना में। यह सीधे समय चूक डिजिटल इमेजिंग प्रदर्शन से एक propidium आयोडाइड धुंधला का उपयोग Ki67 immunolabeling, जी / मृत सेल व्यवहार्यता परख का उपयोग इस तरह के सेल प्रसार के रूप में इन विट्रो assays के बैटरी, और सेल व्यवहार के साथ अलग एमएससी उपप्रकार के लिए परिणामों की तुलना करने के लिए एक साधन प्रदान की । एक भी व्यक्ति w से एकत्र वातानुकूलित मीडिया नमूनों पर ELISAs प्रदर्शन कर सकते हैं इस HCS का एक विस्तार के रूप मेंएल मात्रात्मक neurotrophic कारकों का स्राव निर्धारित करने के लिए। अलग एमएससी उपप्रकार से वातानुकूलित मीडिया भी secreted कारकों 11,23 के जैविक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो bioassays में इस्तेमाल किया जा सकता है। HCS के मंच से इस प्रकार का भी प्राथमिक neuronal संस्कृतियों और तंत्रिका स्टेम सेल लाइनों 24 से neurite परिणाम की इन विट्रो मापन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुल मिलाकर, हमारे परिणाम आनुवंशिक रूप से संशोधित MSCs की उप-जनसंख्या गैर संशोधित MSCs की तुलना में समान व्यवहार प्रदर्शित कि प्रदर्शन किया। सेल के विकास और सेल प्रवास पर विविध संस्कृति substrates के प्रभाव नाटकीय रूप से एमएससी उपप्रकार के बीच अलग है, साथ ही संस्कृति substrates नहीं था। जैसे, परीक्षण किया बाह्य मैट्रिक्स substrates के इन विभिन्न इंजीनियर MSCs के लिए सेल व्यवहार के इन पहलुओं नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रकट नहीं किया था।

इस अध्ययन एडवेंचर्स विश्लेषण करने के लिए एक HCS प्रणाली के उपयोग को दर्शाता हैसेल व्यवहार की टी पहलुओं। हालांकि, यह छवि विश्लेषण के साथ जुड़े सीमाओं मुठभेड़ करने के लिए असामान्य नहीं है। प्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण करते हुए इस अवसर पर, यह immunolabeled या दाग कोशिकाओं के रूप में सकारात्मक दाग / लेबल किया गिना जाएगा जो ऊपर सही दहलीज मूल्य निर्धारित करने के लिए कुछ हद तक मुश्किल था। इस प्रकार, व्यक्तिपरक पूर्वाग्रह को कम से कम करने के लिए, दहलीज मूल्यों के निर्धारण नियंत्रण के साथ एक तुलना (प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए नकारात्मक नियंत्रण प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी की चूक से सभी प्रसंस्करण के दौरान समानांतर में किए गए थे) पर निर्भर था। एक और सीमा समय व्यतीत हो जाने के डिजिटल इमेजिंग का उपयोग सेल प्रवास के विश्लेषण के दौरान सामना करना पड़ा था। कुछ मामलों में, इमेजिंग सॉफ्टवेयर वास्तव में केवल एक बहुत ही कम दूरी पलायन एक सेल बनाम एक सेल के यादृच्छिक ब्राउनियन गति के बीच अंतर करने में सक्षम नहीं था। विश्लेषण सॉफ्टवेयर multip की उपस्थिति भेद करने में सक्षम नहीं था, जहां अतिरिक्त सीमाओं स्थितियों में स्पष्ट किया गयाएक-दूसरे के बहुत करीब निकटता में Le कोशिकाओं। विश्लेषण के बजाय एक पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण के दौरान इस सीमा आवश्यक मार्गदर्शन सेल चयन पर काबू पाने के लिए। सेल चढ़ाना घनत्व भी एक दूसरे से अलगाव में बढ़ने कोशिकाओं है कि बनाम clumps में विकसित करने के लिए अधिक से अधिक वरीयता प्रदर्शित कि कोशिकाओं की आबादी के बीच सेल प्रवास डेटा skewing में परिणाम कर सकते हैं। मतभेद के इन प्रकार के भाग जाने की संभावना सेल सेल वरीयताओं बनाम सेल सब्सट्रेट का एक प्रतिबिंब में हैं।

छवियों को प्राप्त और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए एक HCS के सिस्टम का प्रयोग एक कुशल और तेजी से मतलब है कई सेल मानकों का आकलन करने के लिए प्रदान करता है। इसके अलावा, 30 अलग अलग परिस्थितियों (6 substrates और 5 अलग अलग एमएससी उपप्रकार) के लिए समय चूक डिजिटल वीडियो नियमित तौर पर पर्यावरण कक्ष का उपयोग करते समय घंटे से दिन (48 घंटे) को लेकर अवधि के लिए हासिल किया गया। इस डाटा को बाद में अलग ईसीएम पर विभिन्न सेल लाइनों के पार सेल प्रवास की दरों में अंतर की गणना करने और निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाअणुओं।

इस रिपोर्ट में हम सेल स्वास्थ्य और समारोह का आकलन करने के लिए एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग मंच के कार्यान्वयन पर प्रकाश डाला है। विश्लेषण के इस प्रकार निर्देशित सेल के विकास और तंत्रिका पुनर्जनन को सुविधाजनक बनाने के लिए सेल-प्रकार, साथ ही बहुलक substrates के डिजाइन करने के लिए तर्कसंगत रणनीति विकसित करने के लिए उपयोगी है। इस कोशिका प्रत्यारोपण रणनीतियों का उपयोग विवो पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन में पूर्व व्यापक करने के लिए उपचारात्मक कारकों में से स्टेम सेल आधारित वितरण के आवेदन करने की दिशा में एक आवश्यक कदम है।

Disclosures

इस वीडियो लेख के लिए प्रकाशन फीस आण्विक उपकरण, LLC द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96 well plates Greiner Bio One 655090 96 well plates selected for use in ImageXpress
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) A9647
Rabbit anti-Ki67 antibody Abcam (Cambridge, MA) Ab16667 1:200 dilution
Collagen type I Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) C7661 Collagen from rat tail
DAPI Invitrogen (Carlsbad, CA) D3571
Donkey anti-Rabbit Cy3 Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  711-165-152 1:500 dilution
ECL(Entactin-Collagen-Laminin) Millipore/Chemicon (Temecula, CA) 08-110
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone (Logan, UT) SH30071.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
Ethanol Chemistry Store (Ames, IA) 12003510 100%, 200 proof
Fibronectin Fisher Scientific (Hampton, NH) CB-40008
Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
KH2PO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P285 For PO4 buffer
K2HPO4 Fisher Scientific (Hampton, NH) P288 For PO4 buffer
L-Glutamine Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) 25030-081
Laminine (mouse) Trevigen (Gaithersburg, MD) 3400-010-01
Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) Isolated from bone marrow
Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)
Normal donkey serum (NDS) Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)  017-000-121
Paraformaldehyde (PFA) Fisher Scientific (Hampton, NH) O4042 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P0781
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4417
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) P4707
Propidium iodide (PI) Invitrogen (Carlsbad, CA) P1304MP
Triton X-100 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) X100
Trypsin 0.05% (EDTA 1x) Invitrogen (Carlsbad, CA) 25300-054
Iscove's Modified Dulbecco's Medium Invitrogen (Carlsbad, CA) 12440–046
Hybridoma-qualified FBS Hyclone (Logan, UT) SH30396.03
Equine serum Hyclone (Logan, UT) SH3007403
ImageXpress Micro Molecular devices (Sunnyvale, CA) ImageXpress micro High content screening system
MetaXpress 4.0 Molecular devices (Sunnyvale, CA) MetaXpress 4.0 Image acquisition and analysis software

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References

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न्यूरोप्रोटेक्टिव रणनीतियाँ के लिए चिकित्सीय कारक की डिलिवरी के लिए इंजीनियर वयस्क स्टेम कोशिकाओं की उच्च throughput लक्षण वर्णन
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Sharma, A. D., Brodskiy, P. A.,… More

Sharma, A. D., Brodskiy, P. A., Petersen, E. M., Dagdeviren, M., Ye, E. A., Mallapragada, S. K., Sakaguchi, D. High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies. J. Vis. Exp. (95), e52242, doi:10.3791/52242 (2015).

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