Introduction
En viktig fråga med att genomföra användbara terapier för behandling av störningar i nervsystemet är i att utveckla effektiva metoder som förhindrar ytterligare degeneration och även underlättar återhämtning av funktionen. En innovativ strategi är att genetiskt tillverka stamceller ex vivo, för produktion av neuroprotektiva faktorer, innan deras transplantation. Denna kombination av cellbaserad terapi, i kombination med en typ av genterapi, ger en kraftfull metod för behandling av sjukdom eller skada-inducerad nervcellsdöd i nervsystemet.
Neurotrofa faktorer är avgörande för tillväxt och överlevnad i utvecklings nervceller samt underhåll och plasticitet av mogna nervceller. Ett antal studier har visat signifikanta roller neurotrofiska faktorer för att främja initial tillväxt och differentiering av nervceller i det centrala och perifera nervsystemet (CNS och PNS) och de kan också stimulera förnyelse in vitro och in enNimal modeller av nervskada 1. BDNF (BDNF) uttrycks starkt i CNS och spelar en viktig roll i regleringen av neural utveckling, synaptisk plasticitet och reparation 2. Gliacellinje neurotrofisk faktor (GDNF) främjar överlevnaden av många typer av nervceller, inklusive dopaminerga och motorneurons 3. Således är en viktig strategi för neural reparation för att ge exogena källor av neurotropa faktorer till de skadade eller sjuka områden i nervsystemet.
Multibenmärgsderiverade mesenkymala stamceller (MSC) håller stor potential för leverans av terapeutiska proteiner för att behandla den skadade eller sjuka nervsystemet. Transplantation av MSC har rönt stor uppmärksamhet i arbetet med att utveckla patientens kompatibla cellbaserade terapier, eftersom de har ett antal fördelar, inklusive, 1) relativt lätt isolering och underhåll, 2) multipotentiell kapacitet, 3) små etiska betänkligheter, 4) Förmåga att överleva och migrera efter transplantation och 5) potential för autolog transplantation 4,5. Lovande resultat har rapporterats vid användning av naiva och genetiskt modifierade MSCs i djurmodeller för ett antal olika neurodegenerativa tillstånd, inklusive ryggmärgsskada 6,7, stroke 8,9, myelinbrist 10, och retinal degeneration 11-13. Koppling celltransplantation med leverans av neurotrofiska faktorer från genetiskt manipulerade stamceller är en ny och viktig neural reparationsstrategi.
Ett viktigt steg i utvecklingen av cellbaserade terapeutisk faktor leveranssystem är att bestämma den normala hälsa förändrade cellerna. Som sådan, det huvudsakliga syftet med denna studie var att utvärdera generella tillväxtparametrar av genetiskt modifierade vuxna stamceller. En viktig metod för att snabbt bedöma flera cellparametrar är att anställa cellulär bildbaserade hög genom screening (HTS), ofta kallad hög halt screening (HCS) förfaranden 14. Denna teknik gör automatiserad bild förvärv och analys och detta tillvägagångssätt är särskilt väl lämpad för stamcellsforskningsansökningar. I det här projektet har vi utvecklat en profilering plattform som möjliggör snabb karaktärisering och optimering av cellsubstrat preferenser och cellulära funktioner med genetiskt manipulerade adulta stamceller anställa en HCS-system.
Protocol
1. Substrat Förberedelse för 96-hålsplattor
- Skapa en karta över det 96-brunnar som beskriver de olika substrat och celltyper som skall undersökas (Figur 1).
- Skaffa stamlösningar av olika substrat [poly-L-lysin, fibronektin, kollagen typ I, laminin, och entaktin-kollagen IV-laminin (ECL)], en 96-brunnars flerkällsplatta och förbereda en arbetsstation i en steril cellkultur huva.
- Förbered individuella substrat genom att späda lager i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutkoncentration av 5 | ig / ml (denna koncentration tidigare fastställts baserat på en substratkoncentrationsberoende analys för tillväxt och proliferation av celler). Blanda med hjälp av en virvel innan du häller i en steril behållare.
- Lägg 100 pl av substratlösning till varje brunn i enlighet med den 96-brunnars karta (fig 1) (en 12- eller 8-kanals mikropipett är bekvämt för micropipetting in i en 96-brunnars platta). Täta locket till 96-brunnsplattan med användning av en remsa av Parafilm och förvara över natten vid 4 ° C.
2. Cell Plating och Time-lapse Imaging
OBS: Mus MSCs isolerades från benmärg hos vuxna C57BL / 6-möss och bibehållas som en vidhäftande cellinje. MSCs infekterades med hjälp lentivirusvektorer till ingenjör dem att utsöndra BDNF (BDNF, humana cDNA) och gliacell neurotrofisk faktor (GDNF, humant cDNA) med hjälp lentivirusvektor s kodning BDNF (LV-BDNF, CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), och grönt fluorescerande protein (GFP, LV-GFP; CMV-GFP).
OBS: Odlingsmedier för mus mesenkymala stamceller (MSCs) är Iscoves modifierade Dulbeccos medium innehållande 10% hybridom kvalificerade fetalt bovinserum, 10% hästserum, 2 mM L-glutamin, och 10000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin . De fem olika typer av mus MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSCS och BDNF / GDNF-GFP-MSC: er) ströks ut med cirka 30% konfluens i T75-cellodlingsflaskor.
- Cell Plating
- Följande dag, avlägsna substratlösningarna genom aspiration och skölj varje brunn med ca 200 | il av steril PBS, två gånger. Lägg cellodlingsmedier (200 | il / brunn) till varje brunn efter den slutliga PBS sköljningen. Placera 96-brunnar i en cellkultur inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO2 för ekvilibrering.
- Medan 96-brunnars platta ekvilibrering i inkubatorn, skörda cellerna (MSCs i T75-kolvar bör vara ungefär 70% sammanflytande vid tiden för skörd / beläggning) genom uppsamling av tillväxtmedia (hänvisad till som konditionerat medium) från T75-flaska och lagring i ett 15 ml koniskt rör under sterila betingelser (detta konditionerade media kommer att användas i steg 2.1.4 nedan).
- Lägg 8 ml steril PBS till kolven och snurra försiktigt och sedan pipett bort PBS och tillsätt 1 ml 0,05% trypsin och 0,01%EDTA-lösning för att lösgöra cellerna från odlingsytan av T75-flaska. Övervaka cell lossnar genom att titta på flaskan med ett inverterat mikroskop utrustat med fas kontrast optik.
- När cellerna har lossnat, omedelbart till 8 ml av det konditionerade mediet (som uppsamlats i steg 2.1.2) till kolven. Samla cellsuspensionen och överför till en 15 ml koniskt centrifugrör och centrifugera under 4 min vid 450 xg för att pelletera cellerna.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 200 | il färskt och värmdes (37 ° C) cellodlingsmedia.
- Bestäm antalet celler i cellsuspensionen genom att utföra en trypanblått viabla celltal med användning av en hemocytometer. Plate cellerna vid en densitet av ca 300 celler / brunn i lämpliga brunnar i 96-brunnars platta.
- Upprepa dessa steg för varje population av celler.
- Time-lapse Imaging
- När alla MSC har pläterade, platsden 96-brunnar i en inkubator under 2 h för att låta MSCs att fästa till substratet.
- Starta HCS-systemet och vänta 2 h för att systemet skall uppnå jämvikt. Ställ miljöstyrenheten till 37 ° C och anslut en blandad gas cylinder innehållande 5% CO2 i luft till HCS-systemet miljökammaren tillföra en konstant luftkälla.
- Avlägsna 96-brunnar från inkubatorn efter 2 h jämviktsperioden och placera direkt in i celltillväxtkammaren i HCS-systemet. Låt 30 min för jämvikt med hänsyn till eventuellt värmerelaterade utbyggnad av plattan och sedan starta programmet bild förvärv och analys för att konfigurera plattinställningarna.
- Välj 20X objektiv för avbildning. Välj två brunnar per tillstånd [dvs GFP-MSCs på fibronektin etc. (6 substrat x 5 MSC subtyper för totalt 30 förhållanden x 2 replikat = 60 brunnar totalt)] för att ställa in time-lapse avbildning. Välj två platser för avbildning medi varje brunn.
- Välj rätt ljusvåglängder för avbildning.
OBS: Två olika våglängder (Fas kontrast och GFP fluorescens) valdes ut för time-lapse avbildning. - Fokus på brunnens botten med hjälp av laser autofokus och ta testbilder för flera webbplatser och flera brunnar för att hitta en optimerad fokalplan.
- När fokus har fastställts, börja ta bilder var 5 min under 48 timmar för alla 60 brunnar (120 platser).
- Mata cellerna varje 24 h genom att avlägsna 96-brunnar från HCS-systemet. Avlägsna 75 pl av media från varje brunn och tillsätt 100 | il färskt medium till varje brunn (ekvilibrera detta färskt medium vid 37 ° C och 5% CO2).
- Vid slutet av den tidsförlopp experiment avlägsna 96-brunnar från HCS-systemet. Under sterila betingelser, samla det konditionerade mediet prover från varje brunn och överföra dessa prover till en annan 96-brunnars platta.
OBS: Dessa prover kan användas för ytterligare analysär genom att utföra ELISA för neurotrofiska faktorer. - Förbered 96-brunnar med odlade MSCs för ytterligare analyser såsom Ki67 cellprolifereringsanalys eller propidiumjodid levande / döda färgning analys (se detaljer nedan).
- Utför tidsförlopp bildanalys för cellmigration / cell tracking som beskrivs i avsnitt 5 nedan.
3. Ki67 celltillväxt och propidiumjodid Live / Dead analys
- Ki67 cellprolifereringsanalys (Immuncytokemi)
- Skölj cellkulturerna med 0,1 M fosfat (PO 4) buffert för en minut två gånger. Fäst kultur med 4% paraformaldehyd (PFA) under 20 min vid rumstemperatur. Ta bort PFA och skölj brunnarna med PBS i sju minuter tre gånger.
- Efter den slutliga sköljningen, tillsätt 100 | il blockeringslösning (fosfatbuffrad koksaltlösning, 5% normalt åsna serum, 0,4% bovint albuminserum, och 0,2% Triton X-100) till varje brunn ennd inkubera vid rumstemperatur under 1 h. Förbered den primära antikroppen, kanin-anti-Ki67, genom utspädning i blockeringslösning vid en arbetsförhållande av 1: 200.
- Ta bort blockeraren lösningen och tillämpa 100 pl av den primära antikroppen lösningen till varje brunn. Täck 96-brunnars platta och inkubera proverna vid 4 ° C över natten.
- Följande dag, avlägsna antikropplösningen och skölj med PBS under 7 min, 3 gånger.
- Förbered sekundär antikropp, åsne-anti-kanin-Cy3 i blockeringslösning vid en arbetsförhållande av 1: 500. Lägg DAPI nukleär färgning till den sekundära antikroppslösningen vid en utspädning av 1: 100. Efter avlägsnandet av den sista PBS-sköljn, applicera 100 | il av den sekundära antikroppen / DAPI-lösning till varje brunn. Inkubera vid rumstemperatur i mörker under 90 minuter.
- Ta bort sekundär antikropp / DAPI lösningen och skölj varje brunn med PBS i 7 min, 3 gånger. Täck 96-brunnars platta och förvara vid 4 ° C tills avbildning.
- PropiDIUM Jodid Live / Dead analys
- Mät celldöd genom propidiumjodid (PI) uteslutningsanalys såsom beskrivs nedan.
- Förbered propidiumjodid fläcken lösning vid en koncentration av 1,5 | iM i odlingsmedia.
- Lägg 100 pl av 70% etanol till en brunn på MSCs för 2 min med avsikt att döda dessa celler. Denna väl tjänar som en positiv kontroll för PI fläcken. Majoriteten av MSCs blir Pl-färgade indikerar celldöd. Avlägsna etanollösningen.
- Lägg 100 | il propidiumjodid färglösning till varje brunn och inkubera under 20 minuter vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
- Skölj cellerna med 0,1 M fosfatbuffert under 1 min, två gånger. Fixera cellerna med 4% PFA i 0,1 M P0 4-buffert under 20 min vid rumstemperatur. Ta bort PFA och skölj med PBS tre gånger under 7 min.
- Inkubera med DAPI-lösning (01:50) utspätt i blockeringslösning under 1 timme vid rumstemperatur. Skölj alla brunnar medPBS under 7 min, 3 gånger.
- Ta ut DAPI lösningen och skölj varje brunn med PBS i 7 min, 3 gånger. Täck 96-brunnars platta och förvara vid 4 ° C tills avbildning.
4. Automatiserad Imaging och multivåglängder Scoring Analys
- Ladda en 96-brunnar (tidigare behandlats för Ki67 immunomärkning eller propidiumjodid-färgade) i HCS-systemet och låt plattan till jämvikt i 20 min Öppna HCS systemet bild förvärv och analysprogram.
- Välj förvärvs inställningarna för 10X objektiv använder kameran binning på 1 och en vinst inställning av 2. Hitta Z-plan i vilket cellerna är bosatta genom att använda automatisk exponering funktionen och beräkna förskjutningen för varje våglängd av intresse. För denna analys, ta bilder för DAPI (W1), Cy3 (W2), och FITC (W3). Välj den högsta intensitetsnivå där de negativa kontrollbrunnarna visar ingen signal för bildtagning. Bekräfta inställningen är lämplig för postiva brunnar.
- Skaffa plattan. Fånga bilder och lagra dem i bilden förvärvet och analysprogram databas.
- När bilderna har förvärvats, öppen bild förvärv och analys offline programvara och översyn plattdata från bilderna förvärvat ovan.
- Välj Multi-våglängds scoring analys. Konfigurera de minimala och maximala intensiteter för varje våglängd.
OBS: DAPI detektering bör markera färgning runt varje synlig kärna. Cy3 bör upptäcka de positiva celler med Ki67 immunreaktivitet (IR) och bör inte detektera IR enligt de negativa kontrollerna. För Cy3 Ki67 IR, den ungefärliga minsta bredd var 7 pm, ungefärlig maximal bredd var 30 pm, intensiteten ovanför den lokala bakgrunden var 150 gråtoner, och den minsta färgade området var 50 pm 2. - Kör analys för alla positioner. Exportera data till visa i kalkylblad.
5. Cellspårning
- Öppna bild FÖRVÄRVn och analysprogrammet och klicka på "Review Plate Data [DB] ...", välja plattan av intresse.
- Visa uppgifter för "Time vs Well".
- Välj en av platserna från "platser" avsnittet av vänsterklicka på önskat val. Välj "Överförd ..." under "våglängder:". Högerklicka på målet väl i 96-brunnar mall och klicka på "Läs in bilder".
- Spåra cellerna genom att klicka på "Apps" och sedan "Track objekt".
- Använd "Dynamic Data Exchange (DDE)" för att välja format att exportera data, t.ex. Microsoft Excel.
- Välj spårningsdata till export, t.ex. förfluten tid, objektnummer, avstånd, tidsintervallet, hastighet, absolut vinkel, avstånd till ursprunget, delta x och delta y.
- Tagga varje cell av intresse med "Ctrl-tangenten + vänster klicka" på målceller.
- Spår celler. Om det behövs, stoppa / ändra felaktig spårning av celler med "Esc" -tangenten och sedan justera inställningarna.
- Efter spårning cell är klar, spara data med "Log Data".
Representative Results
MSC tillväxtparametrar undersöktes genom odling av olika populationer av MSCs på olika substrat. De fem olika populationer av MSC subtyper (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, och BDNF / GDNF-GFP-MSC) ströks ut på 96-brunnars vävnadsodlingsplattor i förväg belagda med de olika substrat som visas i figur 1. Efter fyra dagar av odling, plattorna fixerades och immunolabeled och / eller färgade med lämpliga reagens och sedan undersökts med HCS-systemet och analyserna i samband med bild och analys programvara.
Figur 1:. 96-brunnar mall för experimentell design 96-brunnars plattor belades med olika substrat och brunnar såddes med konstruerade stamceller såsom visas i mallen. Som ett exempel, endast wells i rader BF användes i detta experiment. Rader A, G och H lämnades tomma. Förkortningar - MSC: mesenkymala stamceller; GFP-MSC: grönt fluorescerande protein-uttryck MSCs; BDNF-GFP-MSC: hjärna neurotrofisk faktor-GFP-uttryck MSCs; GDNF-GFP-MSC: er; Gliacell neurotrofisk faktor-GFP-uttryck MSCs; BDNF / GDNF-GFP-MSC: er; BDNF och GDNF- GFP-uttryck MSCs; ECL: entaktin-Collagen IV-laminin).
Anti-Ki67 immunomärkning, följt av DAPI motfärgning, användes för att utvärdera om de olika substrat påverkade spridningen av de olika populationer av tekniska MSCs (Figur 2A). Uttryck av Ki67-antigen sker företrädesvis under sena G 1, S, G 2 och M faser av cellcykeln, och är inte detekteras i celler i vilofas (G 0), och därför är användbar som en cellulär markör för proliferation 15 . 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) är en vanligt förekommande nutydlig och kromosom motfärg som avger blå fluorescens vid bindning till AT regioner av DNA 16. Det totala antalet celler i ett fält kan bestämmas genom att räkna antalet DAPI färgade kärnor. Såsom illustreras i figur 2B, även om det fanns variationer i procentandelarna av prolifererande MSCs, stödde alla substrat ändå avsevärda cellproliferation för varje MSC-subtyper.
Figur 2: Ki67 cellprolifereringsanalys. (A) Sammanslagen dubbel fluorescerande bild av Ki67 immunomärkning (röd) och DAPI (blå) nukleär färgning. Många av MSCs ades immunolabeled med Ki67-antikropp (röd). Skalstreck = 50 | im. (B) Stapeldiagram som visar procentandelen av Ki67 immunolabeled MSC subtyper odlas på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagentyp I, laminin eller entaktin-kollagen IV-laminin (ECL) substrat för 5 dagar in vitro (DIV). N = ett experiment. Varje stapel representerar genomsnitt poolade data från åtta avbildade webbplatser från 2 brunnar för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Propidiumjodid (PI) färgning användes för att utvärdera huruvida olika substrat påverkade cellöverlevnad (fig 3). Propidiumjodid är ett vanligt använt röda fluorescerande kärnkraft och kromosom motfärg. Propidiumjodid är membran impermeant och allmänt uteslutna från levande celler, och därmed är användbar för att upptäcka döda celler i en population. Andelen döda celler inom ett givet tillstånd kan bestämmas när de kombineras med en allmän nukleär märkning såsom DAPI att identifiera alla celler inom ett fält. Procentandelen PI-positiva celler var lågt på alla underlag som undersöktes (Figur 3). Som en positiv kontroll för PI-reagens, var några brunnar innehåller MSCs inkuberas i 70% etanol, ett tillstånd som kallas för att döda de flesta celler, vilket resulterar i en hög procentandel av PI-märkta celler som visas i figur 3B och 3C (etanol behandlad positivt kontroll).
Figur 3: Propidiumjodid celldöd analys. (A) Sammanslagen, dubbelt fluorescerande bild för propidiumjodid (röd) och DAPI (blå) färgning. Fastän kärnorna i alla de viabla celler färgades med DAPI (blå), ingen propidiumjodidfärgning detekteras i MSC. (B) Praktiskt taget alla MSC färgades med propidiumjodid efter exponering för 70% etanol. Skalstrecken i A och B = 100 ^ m. (C) Stapeldiagram som visar procentandelarna av propidiumjodid (PI) färgas MSC subtyps odlas på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagen typ I, laminin eller entaktin-kollagen IV-laminin (ECL) substrat för 5 dagar in vitro (DIV). Etanol Kontroll: Detta tillstånd tjänade som en positiv kontroll för PI färgning reagens. De flesta celler som utsatts för PI fläcken efter etanolbehandling är döda och därmed positivt färgas för PI reagens. N = ett experiment. Varje stapel representerar genomsnitt poolade data från åtta avbildade webbplatser från 2 brunnar för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
För att undersöka den möjliga inverkan av olika substrat på beteendet hos manipulerade MSC, var cell migration analyserade med hjälp av tidsförlopp digital mikroskopi och fallande ljus / miljökammarsystem på HCS-systemet (se Supple Video 1). Flera platser / väl var tidsförlopp avbildasoch används för att beräkna cellmigrationsgrader för olika subpopulationer av MSC växer på olika substrat med användning av bilden förvärvet och analys programvara. I allmänhet, såsom visas i fig 4C, alla subtyper av MSCs visade den snabbaste migreringshastigheten på de extracellulära matrisbelagda ytor (fibronektin, kollagen, laminin och ECL) och den långsammaste på icke belagda polystyrenytor.
Figur 4:. Cell spårning och migration MSC spåras med bildtagning och analysprogram. Overlayeds bilder av genomlysning och fluorescens bilder från (A) i början av tidsförlopp imaging och (B) vid 29 timmar senare i slutet av tidsförlopp avbildning session (se Supple Video 1). Cellmigrations spår indikeras med färgade lines. Skalstreck:. 50 ^ m (C) Stapeldiagram som visar de genomsnittliga vandringshastigheter (uttryckt som | im / h) för MSC subtyper odlas på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagen typ I, laminin, eller entaktin-kollagen IV-laminin (ECL) substrat för 2 dagar in vitro (DIV). N = ett experiment. Varje stapel representerar medelvärdet av minst 10 avbildade celler från 2 brunnar för varje tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Sammantaget ger dessa resultat ger preliminära bevis för att dessa delpopulationer av genetiskt modifierade MSCs visar liknande tillväxtegenskaper. Dessa resultat ger övertygande bevis för att lentiviral medierad genetiska modifieringar av dessa MSC inducerade inga dramatiska detekterbara skadliga effekter på tillväxtparametrar undersökta använda denna screening plattform.
Kompletterande Video 1. Time-lapse digital video MSC spårning med hjälp av bild och analys programvara. Den migreringsväg är två MSC [indikerade som 1 (grön spårning linje) och 2 (blå spårning linje)] illustreras. Video Tillfånga en 29 timmarsperiod. Bilder fångades var 5 min. Fluorescens bilder av GFP-uttryck MSCs användes för time-lapse avbildning förbereda videon. Kalibrerings bar = 50 pm. Denna typ av analys är användbar för att undersöka cell beteenden, inklusive cellmigration och celldelning.
Discussion
Vuxna mesenkymala stamceller (MSC) är en attraktiv celltyp för utveckling av en experimentell strategi som kombinerar en cellulär och genavgivning baserad terapi. MSC är multi, förmåga att differentiera till celler av mesodermal härstamning, och visa stor plasticitet, differentiering / transdifferentiating i neuronala och gliaceller härstamningar med lämplig induktionsparadigm 17,18. Dessutom har MSC transplanterats och visat sig effektiv i prekliniska studier för ett antal sjukdomar, inklusive neurodegenerativa tillstånd 19. Den terapeutiska effekten av MSC är välkänt på grund av deras välgörande anti-proliferativa, antiinflammatoriska och anti apoptotiska aktiviteter 20. MSC är också kända för att producera och utsöndra olika neurotrofa och tillväxtfaktorer, vilket sannolikt bidrar till de nervskyddande egenskaper som förknippas med naiva MSCs efter transplantation vid ställen för skada eller sjukdom 21. Importantly, kan MSC vara genetiskt modifierad för förlängd leverans av neurotrofa faktorer för kombinerade cellulära och genterapibaserade applikationer och har använts i ett antal djurmodeller av skada eller sjukdom till CNS 11,19,22.
Vid utvecklingen av en kombinerad cellulär och genterapi baserad strategi, är det viktigt att noggrant bedöms hälsan av cellerna före deras omfattande användning för in vitro och speciellt in vivo applikationer. Som ett proof of concept, undersökte vi flera populationer av konstruerade och kontroll MSC linjer för att studera konsekvenserna av de genetiska modifieringar på cell hälsa och fitness med hjälp av en hög halt screening (HCS) tillvägagångssätt. I allmänhet hänvisar HCS till cellulär bildbaserade högkapacitetsscreening 14. Denna screening medger en kvantitativ bedömning av cellulära fenotyper på flera nivåer av rumsliga (cell till subcellulär) och temporala (millisekunder till dagar) resolution över olika experimentella betingelser. Med hjälp av denna metod som vi åt eventuella skillnader i substratpreferens på följande parametrar: cell spridning, uttryck av grönt fluorescerande protein (GFP), celldöd och cellrörlighet / migration. Experiment utformades i 96-brunnars cellodlingsplatta format. Inom en enda skylt som vi rutinmässigt undersökt möjliga substrat relaterade skillnader med avseende på varje parameter för de olika MSC populationer av lentivirala-omvandlade celler och jämförde de tekniska MSCs med den ursprungliga, icke-omvandlade MSC. Detta gav en möjlighet att direkt jämföra resultaten för de olika MSC subtyper med ett batteri av in vitro-analyser såsom celltillväxt med hjälp Ki67 immunomärkning, levande / döda cellviabiliteten analys med hjälp propidiumjodidfärgning och cellens beteende genom att utföra tidsförlopp digital bildbehandling . Som en förlängning av detta HCS kan man också utföra ELISA på rade medie prover som tagits från individ walnar att kvantitativt bestämma utsöndringen av neurotrofiska faktorer. Konditionerat medium från olika MSC subtyper kan även användas i in vitro bioanalyser för att bestämma biologisk aktivitet av utsöndrade faktorer 11,23. Denna typ av HCS-plattformen kan också användas för in vitro-mätningar av neuritutväxt från primära neuronala kulturer och neurala stamcellslinjer 24. Sammantaget visade våra resultat att subpopulationer av de genetiskt modifierade MSCs visade liknande beteenden i förhållande till de icke-modifierade MSCs. Inverkan av olika kultursubstrat på celltillväxt och cellmigration var inte dramatiskt annorlunda mellan MSC subtyper, såväl som odlingssubstrat. Som sådan hade de extracellulära matrixsubstrat testade inte tycks spela en avgörande roll för att modulera dessa aspekter av cellens beteende för dessa olika Engineered MSC.
Denna studie demonstrerar användningen av en HCS-system för analys different aspekter av cellbeteende. Det är dock inte ovanligt att stöta på begränsningar förknippade med bildanalys. Ibland samtidigt analysera fluorescens bilder, det var lite svårt att bestämma rätt tröskelvärde över vilket immunolabeled eller färgade celler skulle räknas som positivt märkta / färgas. Således, för att minimera subjektiva fördomar, fastställandet av tröskelvärden var beroende av en jämförelse med kontroller (negativa kontroller för fluorescens avbildning utfördes parallellt under all behandling av utelämnandet av de primära eller sekundära antikroppar). En annan begränsning påträffades under analysen av cellmigration använder tids lapse digital bildbehandling. I vissa fall, det bildprogram inte kunde skilja mellan slumpmässig Brownsk rörelse av en cell kontra en cell faktiskt migrera bara en mycket kort sträcka. Ytterligare begränsningar var tydliga i situationer där analysprogram kunde inte urskilja förekomsten av multiple celler i mycket nära anslutning till en annan. För att övervinna denna begränsning krävs val manuell cell under analysen snarare än en helt automatiserad analys. Cell plätering densitet kan också resultera i skeva datacell migration mellan populationer av celler som uppvisar högre preferens för att växa i klumpar kontra celler som växer i isolerade från varandra. Dessa typer av skillnader är delvis sannolikt en återspegling av cellsubstrat kontra cell-cell preferenser.
Använda en HCS system för att få bilder och utföra analys av data är ett effektivt och snabbt sätt att bedöma flera cellparametrar. Dessutom har time-lapse digital video i 30 olika förhållanden (6 substrat och 5 olika MSC subtyper) rutinmässigt förvärvats under perioder från timmar till dagar (48 timmar) när du använder miljökammaren. Dessa data användes därefter för att beräkna och bestämma skillnader i cellmigrationshastigheter över olika cellinjer på olika ECMmolekyler.
I denna rapport har vi lyft fram genomförandet av en hög halt screening plattform för att bedöma cell hälsa och funktion. Denna typ av analys är användbart för att utveckla rationella strategier för att designa celltyper, såväl som polymersubstrat för att underlätta riktad celltillväxt och neural regenerering. Detta är ett viktigt steg mot tillämpning av stamcellsbaserad leverans av terapeutiska faktorer före omfattande in vivo prekliniska studier med celltransplantationsstrategier.
Disclosures
Publicerings avgifter för denna video artikeln stöddes av Molecular Devices, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1x) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
References
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
- Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
- Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
- Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
- Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
- Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
- Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
- Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
- Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
- Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
- Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
- Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
- Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
- Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
- Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
- Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
- Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).
