Introduction
Et stort problem med å implementere nyttige terapi for behandling av nervesystemet lidelser er i utviklingen av effektive metoder som hindrer ytterligere degenerasjon og også legge til rette for gjenvinning av funksjon. En innovativ strategi er genetisk å bygge stamceller ex vivo, for produksjon av nervecellene faktorer, før deres transplantasjon. Denne kombinasjonen av cellebasert terapi, kombinert med en type genterapi, tilveiebringer en effektiv metode for behandling av sykdom eller skade-indusert neuronal død i nervesystemet.
Neurotrofe faktorer er avgjørende for vekst og overlevelse av utviklings nevroner samt vedlikehold og plastisitet av modne nevroner. En rekke studier har vist betydelige roller neurotrofe faktorer i å fremme innledende vekst og differensiering av nevroner i det sentrale og perifere nervesystemet (CNS og PNS), og de kan også stimulere regenerering in vitro og i enNimal modeller av nerveskade en. Hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF) blir høyt uttrykt i CNS, og spiller en viktig rolle i regulering av neural utvikling, synaptisk plastisitet og reparasjon 2. Glial cellelinje-avledet neurotrofisk faktor (GDNF) fremmer overlevelse av mange typer av nerveceller, inkludert dopaminerge og motorneurons 3. Således er en viktig strategi for nevral reparasjon for å gi eksogene kilder neurotrofiske faktorer til de skadede eller syke deler av nervesystemet.
Multipotent benmarg-avledede stamceller (MSC) holder et stort potensial for levering av terapeutiske proteiner for å behandle den skadede eller syke nervesystemet. Transplantasjon av MSC har vakt betydelig oppmerksomhet i arbeidet med å utvikle pasient kompatible cellebasert terapi, siden de har en rekke fordeler, inkludert, 1) relativ letthet av isolasjon og vedlikehold, 2) multipotential kapasitet, 3) lite etiske hensyn, 4) Evne til å overleve og migrere etter transplantasjon og 5) potensial for autolog transplantasjon 4,5. Lovende resultater er blitt rapportert ved bruk av naive og genetisk konstruerte MSC i dyremodeller for en rekke forskjellige nevrodegenerative tilstander, inkludert ryggmargsskader 6,7, hjerneslag 8,9, myelin-mangel 10, og retinal degenerasjon 11-13. Kobling celletransplantasjon med levering av neurotrofe faktorer fra genetisk modifiserte stamceller er en roman og viktig nevrale reparasjonsstrategi.
Et vesentlig skritt i utviklingen av cellebaserte terapeutiske faktor leveringssystemer er å bestemme normal helse av de modifiserte cellene. Som sådan, rektor Hensikten med denne studien var å evaluere generelle vekstparametre ved genmodifisert voksne stamceller. En viktig tilnærming for å vurdere raskt flere celleparametere er å ansette cellular bildebasert høy gjennom silingogg (HTS), ofte referert til som høyt innhold screening (HCS) prosedyrer 14. Denne teknologien gjør det mulig for automatisert bildeopptak og analyse og denne tilnærmingen er spesielt godt egnet for stamcelleforskningssøknader. I dette prosjektet har vi utviklet en profileringsplattform som gjør det mulig for den raske karakterisering og optimalisering av cellesubstrat preferanser og cellulære funksjoner med genmanipulerte adulte stamceller ansette en HCS system.
Protocol
1. Forbehandling for 96-brønners plater
- Lage et kart av 96-brønns plate som beskriver de ulike underlag og celletyper som skal undersøkes (figur 1).
- Oppnå stamløsninger av forskjellige substrater [poly-L-lysin, fibronektin, kollagen type I, laminin og collagen IV-entactin-laminin (ECL)], en 96-brønners plate for flere brønner og forberede en arbeidsstasjonen i en steril cellekultur hette.
- Forbered individuelle substrater ved å fortynne lager i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) til en endelig konsentrasjon på 5 ug / ml (denne konsentrasjon ble tidligere bestemt basert på et substrat konsentrasjonsavhengig assay for vekst og proliferasjon av celler). Bland ved hjelp av en virvel før du heller i en steril reservoaret.
- Tilsett 100 ul av substratoppløsning i hver brønn i henhold til den 96-brønns kart (figur 1) (et 12- eller 8-kanals mikropipette er praktisk for micropipetting inn i en 96-brønns plate). Forsegle lokket til den 96-brønns plate ved hjelp av en strimmel av Parafilm og lagre over natt ved 4 ° C.
2. Celleutplating og Time-lapse Imaging
MERK: Mus MSC ble isolert fra benmargen av voksne C57BL / 6 mus og vedlikeholdes som en tilhenger cellelinje. MSC ble smittet ved hjelp lentiviral vektorer til ingeniør dem å skille hjerne-nevrotrop factor (BDNF, menneskelig cDNA) og gliacelle-nevrotrop faktor (GDNF; menneskelig cDNA) ved hjelp lentiviral vektor sin koding BDNF (LV-BDNF, CMV-BDNF-IRES -GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), og grønt fluorescerende protein (GFP, LV-GFP, CMV-GFP).
MERK: Kulturmedier for mus mesenchymale stamceller (MSC) er Iscoves modifiserte Dulbeccos medium inneholdende 10% hybridom-kvalifisert føtalt bovint serum, 10% hesteserum, 2 mM L-glutamin, og 10 000 U / ml penicillin, 10 mg / ml streptomycin . De fem forskjellige typer mus MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSentre og BDNF / GDNF-GFP-MSC) ble belagt på ca 30% samløpet i T75 cellekulturflasker.
- Celleutplating
- På den påfølgende dagen, fjerne underlaget løsninger ved aspirasjon og skyll hver brønn med ca 200 mikroliter sterilt PBS, to ganger. Legg cellekulturmedium (200 ul / brønn) til hver brønn etter at den endelige PBS skylling. Plasser 96-brønners plate i en cellekulturinkubator satt ved 37 ° C og 5% CO2 i likevekt.
- Mens den 96-brønns plate blir ekvilibrering i inkubatoren, høste cellene (MSC i T75-kolber bør være omtrent 70% sammenflytende på tidspunktet for høsting / plating) ved oppsamling av vekstmediet (referert til som kondisjonert medium) fra T75-kolbe og lagring i et 15 ml konisk rør under sterile betingelser (dette kondisjonerte medier blir anvendt i trinn 2.1.4 nedenfor).
- Tilsett 8 ml steril PBS til kolben og virvle og deretter pipettere av PBS og tilsett 1 ml av 0,05% trypsin og 0,01%EDTA-løsning for å løsne cellene fra dyrknings overflaten av T75-kolbe. Overvåk celle avløsning ved å se på kolben ved hjelp av en invertert mikroskop utstyrt med optikk fase kontrast.
- Når cellene er frittliggende, straks legge 8 ml av det kondisjonerte mediet (samlet i trinn 2.1.2) til kolben. Samle cellesuspensjonen og overføring til en 15 ml konisk sentrifugerør og sentrifuger i 4 minutter ved 450 xg for å pelletere cellene.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 200 ul av frisk og oppvarmet (37 ° C) cellekulturmedier.
- Bestemme antall celler i cellesuspensjonen ved å utføre en trypanblått levedyktige celletelling ved hjelp av et hemocytometer. Plate celler ved en tetthet på ca. 300 celler / brønn inn i de passende brønner av 96-brønns plate.
- Gjenta disse trinnene for hver populasjon av celler.
- Time-lapse Imaging
- Når alle de MSC har vært belagt, sted96-brønners plate i en inkubator i 2 timer for å tillate at MSC for å feste til underlaget.
- Start HCS-systemet og venter i 2 timer for at systemet skal stabilisere seg. Sett miljøkontroller til 37 ° C og koble en blandet gass-sylinder inneholdende 5% CO2 i luft i HCS-systemet miljøkammer tilførsel av en konstant luftkilde.
- Fjern 96-brønns plate fra inkubatoren etter 2 timers ekvilibreringsperiode og plassere direkte inn i cellevekstkammeret i HCS-systemet. Tillate 30 min for likevekt å gjøre rede for noen varme-relaterte utvidelse av platen og deretter starte bilde oppkjøpet og analyse programvare for å konfigurere plate innstillinger.
- Velg 20X objektiv for bildebehandling. Velg to brønner per tilstand [dvs. GFP-MSC på Fibronectin etc. (6 underlag x 5 MSC subtyper for totalt 30 forhold x 2 gjentak = 60 brønner totalt)] for å sette opp time-lapse bildebehandling. Velge to områder for bildebehandling medi hver brønn.
- Velge de riktige bølgelengder av lys for bildebehandling.
MERK: To forskjellige bølgelengder (Phase kontrast og GFP fluorescens) ble valgt for time-lapse bildebehandling. - Fokus på godt bunn ved hjelp av laser autofokus og ta testbilder for flere nettsteder og flere brønner for å finne en optimal fokusplan.
- Når fokuset er etablert, begynner å ta bilder hvert 5 min i 48 timer for alle 60 brønner (120 sider).
- Mate cellene hver 24 timer ved å fjerne den 96-brønns plate fra HCS-systemet. Fjern 75 ul av mediet fra hver brønn og tilsett 100 ul friskt medium til hver brønn (likevekt denne friske medier ved 37 ° C og 5% CO2).
- Ved slutten av tidsintervall eksperiment, fjerne 96-brønns plate fra HCS-systemet. Under sterile betingelser, samle de kondisjonerte medie-prøver fra hver brønn og overføre disse prøvene til en annen 96-brønns plate.
MERK: Disse prøvene kan brukes for ytterligere analyser ved å utføre ELISA for neurotrofiske faktorer. - Forberede 96-brønns plate med dyrkede MSC for ytterligere analyser som Ki67 celleproliferasjonsanalyse eller propidiumjodid levende / døde flekker analysen (se detaljer nedenfor).
- Time-lapse bildeanalyse utføre for celle migrasjon / celle sporing som beskrevet i punkt 5 nedenfor.
3. Ki67 celleproliferasjon og Propidium Jodid Levende / Døde Assay
- Ki67 celleproliferasjonsmetoden (Immunocytochemistry)
- Skyll cellekulturene med 0,1 M fosfat (PO 4) buffer i ett minutt to ganger. Fest kultur med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved romtemperatur. Ta av PFA og skyll brønner med PBS i syv minutter tre ganger.
- Etter den siste skylling, tilsett 100 ul blokkeringsoppløsning (fosfatbuffersaltløsning, 5% normalt esel serum, 0,4% bovint serum-albumin, og 0,2% Triton X-100) til hver brønn ennd inkuber ved romtemperatur i 1 time. Klargjør det primære antistoff, kanin-anti-Ki67, ved fortynning i blokkeringsløsning ved en arbeids forhold på 1: 200.
- Fjern blokkeringsløsning og anvende 100 ul av primær antistoffløsning til hver brønn. Dekk til 96-brønns plate og prøvene inkuberes ved 4 ° C over natten.
- På den påfølgende dagen, fjerne antistoff løsning og skyll med PBS i 7 min, tre ganger.
- Klargjør det sekundære antistoff, esel anti-kanin-Cy3 i blokkeringsløsning ved en arbeids forhold på 1: 500. Legg DAPI kjernefarge til det sekundære antistoff løsningen ved en fortynning på 1: 100. Etter fjerning av den siste skylling PBS, anvende 100 ul av det sekundære antistoff / DAPI-løsning til hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i mørke i 90 min.
- Fjern det sekundære antistoff / DAPI løsning og hver brønn skylles med PBS i 7 min, 3 ganger. Dekke 96-brønns plate og oppbevares ved 4 ° C til bildebehandling.
- Propilang Jodid Levende / Døde Assay
- Mål celledød av propidiumjodid (PI) eksklusjonsanalyse som beskrevet nedenfor.
- Klargjør propidiumjodid fargende oppløsning med en konsentrasjon på 1,5 pM i kulturmedier.
- Tilsett 100 ul 70% etanol til en brønn av MSCene i 2 min i den hensikt å drepe disse cellene. Denne vel tjener som en positiv kontroll for PI flekken. Majoriteten av MSC vil være PI-farget indikerer celledød. Fjerne etanol-løsning.
- Tilsett 100 ul av propidiumjodid flekken løsning til hver brønn og inkuber i 20 min ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator.
- Rens cellene med 0,1 M fosfatbuffer i 1 min, to ganger. Fikser cellene med 4% PFA i 0,1 M P0 4 buffer i 20 minutter ved romtemperatur. Fjern PFA og skyll med PBS tre ganger i 7 min.
- Inkuber med DAPI-løsning (01:50) fortynnet i blokkeringsløsning i 1 time ved romtemperatur. Skyll alle brønner medPBS i 7 min, 3 ganger.
- Fjern det DAPI løsning og hver brønn skylles med PBS i 7 min, 3 ganger. Dekke 96-brønns plate og oppbevares ved 4 ° C til bildebehandling.
4. Automatisert Imaging og Multiwavelength Scoring Analyse
- Legg i en 96-brønns plate (tidligere behandlet for Ki67 immunolabeling eller propidiumjodid-farget) i HCS systemet og la maskinen til stabilisering i 20 min Åpne HCS system image oppkjøpet og analyseprogramvare.
- Velge anskaffelses innstillinger for 10X objektiv ved hjelp av kameraet binning på 1 og en forsterkningsinnstilling av 2. Finn Z-planet, hvor cellene befinner seg ved å utnytte den for automatisk eksponering funksjon og beregne forskyvningen for hver bølgelengde av interesse. For denne analysen, ta bilder for DAPI (W1), Cy3 (W2), og FITC (W3). Velg maksimal intensitet nivå hvor de negative kontrollbrønner viser ingen signal for bildeopptak. Bekrefte denne innstillingen passer for positive brønner.
- Erverve plate. Ta bilder og lagre dem i bildeopptak og analyse programvare database.
- Når bildene har blitt kjøpt opp, åpne bilde innsamling og analyse offline programvare og gjennomgang plate data fra bildene ervervet ovenfor.
- Velg Multi-bølgelengde scoring analyse. Konfigurere minimums- og maksimumsintensiteten for hver bølgelengde.
MERK: DAPI deteksjon skal markere flekker rundt hver synlig kjerne. Cy3 bør gjenkjenne den positive celler med Ki67 immunoreaktivitet (IR) og bør ikke gjenkjenne IR under de negative kontroller. For Cy3 Ki67 IR, den omtrentlige minimumsbredde var 7 pm, omtrentlig maksimal bredde var 30 um, intensitet over den lokale bakgrunns var 150 grånivåer, og minimum farget område var 50 um 2. - Kjør-analyse for alle stillinger. Eksportere data for å vise i regneark.
5. Cell Tracking
- Open image acquisition og analyseprogram og klikk på "omtale Plate data [DB] ...", velge plate av interesse.
- Vise dataene som "Time vs. Well".
- Velg ett av nettstedene fra "nettsteder" seksjonen i venstreklikke på ønsket valg. Velg "Overført ..." under "Bølgelengder:". Høyreklikk på målet vel i 96-brønns plate mal og klikk på "Legge i bilder".
- Spor cellene ved å klikke på "Apps" og deretter "Track objekter".
- Bruk "Dynamic Data Exchange (DDE)" for å velge formatet for å eksportere data, for eksempel Microsoft Excel.
- Velge sporingsdata til eksport, for eksempel, medgått tid, objekt nummer, avstand, tidsintervall, hastighet, absolutt vinkel, avstand til opprinnelse, delta x og delta y.
- Tag hver celle av interesse med "Ctrl-tasten + venstreklikk" på målceller.
- Spor celler. Om nødvendig, stopp / endre uriktig sporing av celler med "Esc" -tasten og deretter justere innstillingene.
- Etter celle sporing er ferdig, lagre data med "loggdata".
Representative Results
MSC vekstparametre ble undersøkt ved å dyrke de ulike bestander av MSC på forskjellige underlag. De fem forskjellige populasjoner av MSC-subtyper (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, og BDNF / GDNF-GFP-MSC) ble sådd ut i 96-brønns vevskulturplater pre-belagt med de forskjellige substrater som illustrert i figur 1. Etter fire dagers dyrkning, ble platene fiksert og immunolabeled og / eller farget med de passende reagenser og deretter undersøkt ved hjelp av HCS-systemet og analyser som er utført med bildeopptak og analyseprogram.
Fig. 1: 96-brønns plate mal for eksperimentell design 96-brønners plater ble belagt med forskjellige substrater og brønner ble inokulert med Engineered stamceller som vist i malen. Som et eksempel, bare wells i rader BF ble anvendt i dette eksperimentet. Rader A, G og H var tomt. Forkortelser - MSC: mesenchymale stamceller; GFP-MSC: grønne fluorescerende protein-uttrykke MSC; BDNF-GFP-MSC: hjerne nevrotrop faktor-GFP-uttrykke MSC; GDNF-GFP-MSC; Glial celleavledet neurotrofisk faktor-GFP-uttrykkende MSC; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF og GDNF- GFP-uttrykke MSC; ECL: Entactin-Kollagen IV-Laminin).
Anti-Ki67 immunolabeling, etterfulgt av DAPI kontra, ble brukt til å vurdere om de ulike underlag påvirket spredning av de ulike bestander av konstruerte MSC (Figur 2A). Ekspresjon av Ki67-antigenet forekommer fortrinnsvis i løpet av en sen G, S, G2 og M fasene av cellesyklusen, og er ikke detektert i celler i hvilefasen (G 0), og derfor er nyttig som en markør for cellulær proliferasjon 15 . 4 ', 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) er en vanlig brukt nuklar og kromosom counterstain som avgir blå fluorescens ved binding til AT regioner av DNA 16. Det totale antall celler i et felt kan bestemmes ved å telle antallet av DAPI fargede kjerner. Som vist i figur 2B, selv om det var variasjon i prosenter av prolifererende MSCer, alle substrater likevel støttet betydelig celleproliferasjon for hver av MSC-subtyper.
Figur 2: Ki67-celleproliferasjonsanalyse. (A) innfusjonerte, dobbel-fluorescerende bilde av Ki67 immunolabeling (rød) og DAPI (blå) nukleær farging. Mange av MSC ble immunolabeled med Ki67-antistoff (rød). Skala bar = 50 mikrometer. (B) av søylediagram som illustrerer de prosentandeler av Ki67 immunolabeled MSC subtyper dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagenType I, laminin, eller entactin-kollagen IV-laminin (ECL) substrater for 5 dager in vitro (DIV). N = ett eksperiment. Hver søyle representerer gjennomsnitt samlede data fra åtte fotografert nettsteder fra to brønner for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Propidiumjodid (PI) farging ble anvendt for å vurdere om forskjellige substrater påvirket celleoverlevelse (figur 3). Propidiumjodid er et vanlig brukt rød-fluorescerende kjernekraft og kromosom counterstain. Propidiumjodid er membranen impermeant og generelt utelatt fra levende celler, og er således nyttig for å oppdage døde celler i en populasjon. Andelen av døde celler i en gitt tilstand kan bestemmes når den kombineres med en generell atom etikett som DAPI å identifisere alle cellene innenfor et felt. Prosentandelen av PI-positive celler var lav på alle underlag undersøkt (Figur 3). Som en positiv kontroll for PI-reagens, ble noen få brønner inneholdende MSC inkubert i 70% etanol, en tilstand kjent for å drepe de fleste celler, noe som resulterer i en høy prosentandel av PI-merkede celler som vist på figur 3B og 3C (etanol behandles positivt kontroll).
Figur 3: propidiumjodid celledød assay. (A) innfusjonerte, dobbel fluorescerende bilde for propidiumjodid (rød) og DAPI (blå) flekker. Selv om kjernene i alle levedyktige celler ble farget med DAPI (blå), ble ingen propidiumjodidfarging detektert i MSC. (B) Nesten alle MSC ble farget med propidiumjodid etter eksponering for 70% etanol. Skala barer i A og B = 100 um. (C) søylediagram som illustrerer de prosentandeler av propidiumjodid (PI) farget MSC subtypes dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagen type I, laminin eller entactin-kollagen IV-laminin (ECL) substrater for 5 dager in vitro (DIV). Etanol Kontroll: Denne tilstanden tjente som en positiv kontroll for PI farging reagens. De fleste celler utsatt for PI flekken etter etanol behandling er døde og dermed positivt farget for PI reagens. N = ett eksperiment. Hver søyle representerer gjennomsnitt samlede data fra åtte fotografert nettsteder fra to brønner for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å undersøke mulige påvirkning av forskjellige underlag på oppførselen av konstruerte MSC, ble cellemigrasjon analysert ved hjelp av time-lapse digital mikroskopi og fallende lys / miljøkammersystemet på HCS system (se Supplemental Video 1). Flere nettsteder / brønn ble time-lapse avbildesog brukes til å beregne cellemigrasjonsrater for de ulike subpopulasjoner av MSC vokser på forskjellige underlag ved hjelp av bildeopptak og analyseprogram. Generelt, som vist i figur 4C, alle subtyper av MSC viste den raskeste migrasjonsrate på de ekstracellulære matriks-belagte overflater (fibronektin, kollagen, laminin og ECL) og den tregeste på ikke-belagte polystyren-overflate.
Figur 4:. Cell sporing og migrasjon MSC spores med bildeopptak og analyseprogramvare. Overlappende bilder av overførte lys og fluorescens bilder fra (A) i starten av time-lapse bildebehandling og (B) på 29 timer senere på slutten av time-lapse bildebehandling sesjon (se Supplemental Video 1). Celle migrasjon sporene vises med den fargede lines. Skala bar.: 50 um (C) søylegraf som illustrerer gjennomsnittlig migrasjonsrater (uttrykt som um / time) for MSC subtyper dyrket på polystyren (PS), poly-L-lysin (PLL), fibronektin, kollagen type I, laminin, eller entactin-kollagen IV-laminin (ECL) substrater for to dager in vitro (DIV). N = ett eksperiment. Hver søyle representerer gjennomsnittet av minst 10 fotografert celler fra to brønner for hver tilstand. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Samlet utgjør disse resultatene gir foreløpige bevis for at disse undergruppene av genmanipulerte MSC vise lignende vekstegenskaper. Disse resultatene gir overbevisende bevis for at lentiviral mediert genetiske modifikasjoner av disse MSC indusert ingen dramatiske påvisbare skadelige effekter på vekstparametre undersøkt ved hjelp av denne screening plattform.
Supplemental Video 1. Time-lapse digital video av MSC sporing ved hjelp av bildet oppkjøpet og analyseprogram. Migrasjon banen er for to MSC [indikert som en (grønn sporing linje) og 2 (blå sporing linje)] er illustrert. Video tatt under en 29 timers periode. Bilder ble tatt hvert 5 min. Fluorescens bilder av GFP-uttrykke MSC ble brukt for time-lapse bildebehandling i utarbeidelsen av video. Kalibrering bar = 50 mikrometer. Denne type analyse er nyttige for å undersøke celle atferd, inkludert cellemigrering og celledeling.
Discussion
Voksen mesenchymale stamceller (MSC) er en attraktiv celletype for utvikling av en eksperimentell strategi kombinerer en cellulær og genavlevering basert terapi. MSC er multipotent, i stand til å differensiere i celler med mesodermal avstamning, og vise betydelig plastisitet, differensiere / transdifferentiating inn nevronale og gliaceller linjene med riktig induksjon paradigmer 17,18. Videre har MSC blitt transplantert og vist seg effektive i prekliniske studier for en rekke lidelser, inkludert tilstander nevrodegenerative 19. Den terapeutiske effekt av MSCer er velkjent på grunn av deres fordelaktige anti-proliferative, anti-inflammatorisk og anti-apoptotiske aktivitet 20. MSC er også kjent for å produsere og skille ut ulike neurotrofe og vekstfaktorer, som trolig bidrar til nervecellene kvaliteter forbundet med naive MSC etter transplantasjonen på områder av skade eller sykdom 21. Importantly kan MSCer bli genetisk modifisert for vedvarende levering av neurotrofiske faktorer for kombinerte cellulære og genterapi-baserte applikasjoner og er blitt anvendt i en rekke dyremodeller av skade eller sykdom i CNS 11,19,22.
I utviklingen av en kombinert celle og genterapi baserte strategien, er det viktig at helsen til cellene er nøye vurderes før deres omfattende anvendelse for in vitro, og spesielt in vivo-anvendelser. Som et bevis på konseptet, undersøkte vi flere bestander av konstruerte og kontroll MSC linjer for å studere konsekvensene av de genetiske modifikasjoner på celle helse og fitness ved hjelp av et høyt innhold screening (HCS) tilnærming. Generelt refererer HCS til cellulær bildebasert high throughput screening 14. Dette screening tilnærmingen tillater en kvantitativ vurdering av cellulære fenotyper på flere nivåer av romlig (celle til subcellulær) og tidsmessige (millisekunder til dager) resolution tvers av ulike eksperimentelle forhold. Ved hjelp av denne tilnærmingen vi vist mulige forskjeller i underlaget preferanse på følgende parametre: celle spredning, uttrykk av grønt fluorescerende protein (GFP), celledød, og cellemotilitet / migrasjon. Forsøk ble utformet i 96-brønners cellekulturplate format. Innenfor en enkelt plate vi rutinemessig undersøkt mulige substrat relaterte forskjeller med hensyn til hver parameter for de ulike MSC populasjoner av lentivirale-transduced celler og sammenlignet de konstruerte MSC med den opprinnelige, ikke-transduserte MSC. Dette ga et middel til direkte sammenligne resultatene for de ulike MSC subtyper med et batteri av in vitro som celleproliferasjon bruker Ki67 immunolabeling, live / dead celleviabilitet analysen bruker propidiumjodidfarging, og celle atferd ved å utføre time-lapse digital bildebehandling . Som en forlengelse av dette HCS man kan også utføre ELISAer på klimaanlegg medie prøver samlet inn fra individ walen til kvantitativt bestemme sekresjon av neurotrofe faktorer. Kondisjonert media fra forskjellige MSC-undertyper kan også benyttes i in vitro bioanalyser for å bestemme biologisk aktivitet av utskilt faktorer 11,23. Denne type av HCS-plattformen kan også anvendes for in vitro-målinger av neurittutvekst fra primære nevronale kulturer og neurale stamcellelinjene 24. Samlet våre resultater viste at subpopulasjoner av de genmodifiserte MSC vises lignende atferd i forhold til de ikke-modifiserte MSC. Innflytelsen av forskjellige dyrkningsunderlag på cellevekst og cellevandring ble ikke dramatisk forskjellig mellom MSC-subtyper, så vel som kulturunderlag. Som sådan har de ekstracellulære matriks-substrater testet ikke synes å spille en kritisk rolle ved modulering av disse deler av cellen oppførsel for disse forskjellige konstruerte MSC.
Denne studien viser bruken av en HCS-system for å analysere different aspekter ved celle atferd. Imidlertid er det ikke uvanlig å støte på begrensninger som er forbundet med bildeanalyse. Noen ganger, mens analysere fluorescens bilder, var det litt vanskelig å finne den riktige terskelverdi over som immunolabeled eller fargede celler vil bli regnet som positivt merket / farget. Således, for å minimere subjektive forspenning, bestemmelse av terskelverdier var avhengig av en sammenligning med kontroller (negative kontroller for fluorescensavbildning ble utført parallelt under hele behandlingen ved utelatelse av de primære eller sekundære antistoffer). En annen begrensning ble påtruffet under analysen av celle migrasjon ved hjelp tids lapse digital bildebehandling. I noen tilfeller, bildebehandlingsprogrammer var ikke i stand til å skille mellom tilfeldig Brownske bevegelser av en celle versus en celle faktisk migrerer bare en svært kort avstand. Ytterligere begrensninger var tydelig i situasjoner der analyse programvare var ikke i stand til å skille tilstedeværelsen av multiple celler i umiddelbar nærhet til en annen. For å overvinne denne begrensningen som kreves manuell valget av celler i analysen i stedet for et fullt automatisert analyse. Cell plette tetthet kan også resultere i forvrenger celle migrasjon av data mellom populasjoner av celler som viser større preferanse til å vokse i klumper sammenlignet med celler som vokser i isolasjon fra hverandre. Disse typer av forskjellene er delvis sannsynlig en refleksjon av celle-substrat versus celle-celle preferanser.
Bruke en HCS system for å hente bilder og utføre dataanalyse gir en effektiv og rask måte å vurdere flere celleparametere. I tillegg ble time-lapse digitale videoer for 30 ulike forhold (6 underlag og fem forskjellige MSC subtyper) rutinemessig overtatt for perioder fra timer til dager (48 timer) mens du bruker miljøkammeret. Denne informasjonen ble senere brukt til å beregne og bestemme forskjeller i cellemigrasjonsrater på tvers av ulike cellelinjer på ulike ECMmolekyler.
I denne rapporten har vi fremhevet gjennomføringen av et høyt innhold screening plattform for å vurdere celle helse og funksjon. Denne type analyse er nyttige for å utvikle rasjonelle strategier for utforming av celletyper, så vel som polymere substrater for å lette rettet cellevekst og neural regenerering. Dette er et viktig skritt på veien mot bruk av stamcellebaserte levering av terapeutiske faktorer før omfattende in vivo prekliniske studier med celletransplantasjon strategier.
Disclosures
Publiserings avgifter for denne videoen artikkelen ble støttet av Molecular Devices, LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates | Greiner Bio One | 655090 | 96 well plates selected for use in ImageXpress |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A9647 | |
| Rabbit anti-Ki67 antibody | Abcam (Cambridge, MA) | Ab16667 | 1:200 dilution |
| Collagen type I | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | C7661 | Collagen from rat tail |
| DAPI | Invitrogen (Carlsbad, CA) | D3571 | |
| Donkey anti-Rabbit Cy3 | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 711-165-152 | 1:500 dilution |
| ECL(Entactin-Collagen-Laminin) | Millipore/Chemicon (Temecula, CA) | 08-110 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone (Logan, UT) | SH30071.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| Ethanol | Chemistry Store (Ames, IA) | 12003510 | 100%, 200 proof |
| Fibronectin | Fisher Scientific (Hampton, NH) | CB-40008 | |
| Iscove’s Modified Dulbeccos Medium (IMDM) | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P285 | For PO4 buffer |
| K2HPO4 | Fisher Scientific (Hampton, NH) | P288 | For PO4 buffer |
| L-Glutamine | Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY) | 25030-081 | |
| Laminine (mouse) | Trevigen (Gaithersburg, MD) | 3400-010-01 | |
| Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice | Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA) | Isolated from bone marrow | |
| Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF) | These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation) | ||
| Normal donkey serum (NDS) | Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA) | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific (Hampton, NH) | O4042 | 4% PFA in 0.1 M PO4 buffer |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P0781 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4417 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | P4707 | |
| Propidium iodide (PI) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | P1304MP | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | X100 | |
| Trypsin 0.05% (EDTA 1x) | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 25300-054 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Invitrogen (Carlsbad, CA) | 12440–046 | |
| Hybridoma-qualified FBS | Hyclone (Logan, UT) | SH30396.03 | |
| Equine serum | Hyclone (Logan, UT) | SH3007403 | |
| ImageXpress Micro | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | ImageXpress micro | High content screening system |
| MetaXpress 4.0 | Molecular devices (Sunnyvale, CA) | MetaXpress 4.0 | Image acquisition and analysis software |
References
- Thoenen, H., Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nature neuroscience. 5 Suppl, 1046-1050 (2002).
- Park, H., Poo, M. M. Neurotrophin regulation of neural circuit development and function. Nature reviews. 14, 7-23 (2013).
- Lin, L. F., Doherty, D. H., Lile, J. D., Bektesh, S., Collins, F. GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science (New York, N.Y.). 260, 1130-1132 (1993).
- Azizi, S. A., Stokes, D., Augelli, B. J., DiGirolamo, C., Prockop, D. J. Engraftment and migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats--similarities to astrocyte grafts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3908-3913 (1998).
- Prockop, D. J., Gregory, C. A., Spees, J. L. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 Suppl 1, 11917-11923 (2003).
- Akiyama, Y., Radtke, C., Honmou, O., Kocsis, J. D. Remyelination of the spinal cord following intravenous delivery of bone marrow cells. Glia. 39, 229-236 (2002).
- Hofstetter, C. P., et al. Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2199-2204 (2002).
- Chopp, M., Li, Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet neurology. 1, 92-100 (2002).
- Li, L., et al. Transplantation of marrow stromal cells restores cerebral blood flow and reduces cerebral atrophy in rats with traumatic brain injury: in vivo MRI study. Journal of neurotrauma. 28, 535-545 (2011).
- Jin, H. K., Carter, J. E., Huntley, G. W., Schuchman, E. H. Intracerebral transplantation of mesenchymal stem cells into acid sphingomyelinase-deficient mice delays the onset of neurological abnormalities and extends their life span. The Journal of clinical investigation. 109, 1183-1191 (2002).
- Harper, M. M., et al. Transplantation of BDNF-secreting mesenchymal stem cells provides neuroprotection in chronically hypertensive rat eyes. Investigative ophthalmology & visual science. 52, 4506-4515 (2011).
- Arnhold, S., et al. Adenovirally transduced bone marrow stromal cells differentiate into pigment epithelial cells and induce rescue effects in RCS rats. Investigative ophthalmology & visual science. 47, 4121-4129 (2006).
- Inoue, Y., et al. Subretinal transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells delays retinal degeneration in the RCS rat model of retinal degeneration. Experimental eye research. 85, 234-241 (2007).
- Xia, X., Wong, S. T. Concise review: a high-content screening approach to stem cell research and drug discovery. Stem cells (Dayton, Ohio). 30, 1800-1807 (2012).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of cellular physiology. 182, 311-322 (2000).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & histochemistry : official publication of the Biological Stain Commission. 70, 220-233 (1995).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 41-49 (2002).
- Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. Journal of Neuroscience Research. 61, 364-370 (2000).
- Huang, B., Tabata, Y., Gao, J. Q. Mesenchymal stem cells as therapeutic agents and potential targeted gene delivery vehicle for brain diseases. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 162, 464-473 (2012).
- Uccelli, A., Benvenuto, F., Laroni, A., Giunti, D. Neuroprotective features of mesenchymal stem cells. Best Pract Res Clin Haematol. 24, 59-64 (2011).
- Forostyak, S., Jendelova, P., Sykova, E. The role of mesenchymal stromal cells in spinal cord injury, regenerative medicine and possible clinical applications. Biochimie. 95, 2257-2270 (2013).
- Shi, D., et al. The effect of lentivirus-mediated TH and GDNF genetic engineering mesenchymal stem cells on Parkinson's disease rat model. Neurological sciences : official journal of the Italian Neurological Society and of the Italian Society of Clinical Neurophysiology. 32, 41-51 (2011).
- Harper, M. M., et al. Brain-derived neurotrophic factor released from engineered mesenchymal stem cells attenuates glutamate- and hydrogen peroxide-mediated death of staurosporine-differentiated RGC-5 cells. Experimental eye research. 89, 538-548 (2009).
- Harrill, J. A., Freudenrich, T. M., Machacek, D. W., Stice, S. L., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in human embryonic stem cell-derived hN2 cells using automated high-content image analysis. Neurotoxicology. 31, 277-290 (2010).
