Summary
Os níveis de proteína em células e tecidos são muitas vezes fortemente regulada pelo equilíbrio da produção de proteínas e de apuramento. Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), a cinética de apuramento de proteínas pode ser medida experimentalmente in vivo.
Abstract
A estabilidade da proteína influencia muitos aspectos da biologia, e medir a cinética limpeza de proteínas pode fornecer importantes insights sobre sistemas biológicos. Em experiências FDAP, o apuramento das proteínas nos organismos vivos podem ser medidos. Uma proteína de interesse é marcado com uma proteína fluorescente photoconvertible, expressa in vivo e photoconverted, e a diminuição do sinal photoconverted ao longo do tempo é monitorizada. Os dados são então equipado com um modelo de depuração adequada para determinar a meia-vida da proteína. Importante, a cinética de depuração de populações de proteína em diferentes compartimentos do organismo pode ser examinado separadamente aplicando máscaras compartimentais. Esta abordagem tem sido utilizada para determinar os intra- e extracelulares meias-vidas de proteínas de sinalização segregadas durante o desenvolvimento do peixe-zebra. Aqui, descrevemos um protocolo para experimentos FDAP em embriões de peixe-zebra. Deve ser possível usar FDAP para determinar a cinética de depuração dequalquer proteína de qualquer organismo taggable opticamente acessíveis.
Introduction
Os níveis de proteínas em células e organismos são determinados através das suas taxas de produção e de depuração. Proteína de semi-vida pode variar de minutos a dias 1-4. Em muitos sistemas biológicos, a estabilização ou limpeza de proteínas-chave tem efeitos importantes sobre a atividade celular. Modulação da estabilidade da proteína intracelular é necessário para a progressão do ciclo celular 5,6, sinalização de desenvolvimento 7-9, apoptose 10, e a função normal e manutenção de neurónios 11,12. A estabilidade da proteína extracelular afecta a distribuição e disponibilidade de proteínas segregadas, tais como morfogénios 13,14, dentro de um tecido.
Ao longo das últimas décadas, a estabilidade da proteína foi avaliado principalmente em cultura de células usando radioativo pulso de rotulagem ou experiências de perseguição cicloheximida 15. Nesses experimentos pulse-chase, as células são transitoriamente ou expostos a um "pulso" de amino radioativoprecursores de ácidos que são incorporados em proteínas sintetizadas de novo, ou eles são expostos a ciclo-heximida, a qual inibe a síntese proteica. As células em cultura são então recolhidos em diferentes pontos de tempo, e, ou imunoprecipitação seguido por autorradiografia (em experiências de pulse-chase radioactivos) ou imunodetecção (em experiências de cicloheximida) é utilizada para quantificar a depuração de proteína ao longo do tempo.
Ensaios de estabilidade proteína convencionais têm várias deficiências. Primeiro, as proteínas nestes ensaios frequentemente não são expressos nos seus ambientes endógenos, mas sim em cultura de tecidos e por vezes em células a partir de espécies diferentes. Para proteínas cuja estabilidade é dependente do contexto, esta abordagem é problemática. Em segundo lugar, não é possível seguir a depuração de proteínas em células individuais ou organismos ao longo do tempo, e os dados obtidos nestes ensaios reflecte uma média de diferentes populações de células em diferentes pontos de tempo. Como as células individuais podem ter começadocom diferentes quantidades de proteína, pode ter retomado o marcador radioactivo ou cycloheximide em momentos diferentes, ou podem ter diferentes cinética de depuração, tais dados agregados pode ser enganador. Finalmente, no caso das experiências de perseguição cicloheximida, adição do inibidor da síntese de proteína pode ter efeitos fisiológicos não desejadas que podem alterar a estabilidade da proteína 16-18 artificialmente. Estas deficiências podem ser evitadas através do uso de fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP), uma técnica que utiliza proteínas photoconvertible para medir folga proteína dinamicamente nos organismos vivos 19-25 (ver discussão para limitações da técnica FDAP).
Photoconvertible proteínas são proteínas fluorescentes cuja excitação e emissão propriedades mudam após exposição a determinados comprimentos de onda de luz 26. Uma variante comumente usado é Dendra2, uma proteína photoconvertible "verde-to-vermelho", que tem inicialmente excitação de emissão e propriedades semelhantes às proteínas fluorescentes verdes, mas após a exposição à radiação UV luz- "fotoconversão" -sua excitação / emissão de propriedades tornam-se semelhantes às das proteínas fluorescentes vermelhas 23,27. Importante, nova proteína produzida após fotoconversão não têm as mesmas propriedades de excitação / emissão como a proteína photoconverted, permitindo a dissociação da produção de depuração e em cima fotoconversão e observação de apenas um conjunto de proteínas photoconverted. Marcação de proteínas de interesse com proteínas photoconvertible, portanto, fornece uma maneira conveniente de pulso de rótulo proteínas intactas, organismos vivos opticamente acessíveis.
Em ensaios FDAP (Figura 1A), uma proteína de interesse é marcado com uma proteína photoconvertible e expressa num organismo vivo (Figura 1B). A proteína de fusão é photoconverted, e a diminuição do sinal de photoconverted ao longo do tempo é monitorizado por fluorescenmicroscopia ce (Figura 1C). Os dados são então montados com um modelo apropriado para determinar a meia-vida da proteína de fusão (Figura 1D).
O ensaio aqui descrito FDAP foi desenhado para determinar as semividas extracelulares de proteínas de sinalização segregadas em embriões de peixe-zebra durante a embriogénese precoce 19. No entanto, esta abordagem pode ser adaptada para qualquer organismo modelo transparente que tolera imagens ao vivo, e pode ser utilizado para monitorar a depuração de qualquer proteína intracelular ou extracelular taggable. As variações da técnica aqui descrita não tem sido realizada em células em cultura e 20,23 Drosophila 22 e 21 embriões de ratinho.
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Protocol
1. Gerando um Photoconvertible construção de fusão e injetando dechorionated embriões Zebrafish
- Gerar uma construção funcional contendo a proteína de interesse fundida com uma proteína photoconvertible verde-a-vermelho (ver discussão), em seguida, utilizar a transcrição in vitro para gerar ARNm que codifica tapado a proteína de fusão como em Muller et al., 2012 19.
- Use pronase para remover os córions de cerca de 30 embriões de peixe zebra na fase de uma célula. Alternativamente, dechorionate manualmente embriões usando uma pinça 28.
Nota: Os embriões devem ser dechorionated para imagens subseqüente. Se desejado, os embriões podem ser injectados através do córion dechorionated e depois, imediatamente antes da imagiologia.- Faça uma solução 5 mg / ml estoque de pronase de Streptomyces griseus em meio embrião de peixe-zebra padrão de 19. Rocha suavemente a solução à TA durante 10 min para permitir a protease para dissolver. Alíquota de 2 ml em tubos de microcentrífuga e congelamento a -20 ° C.
- Transferência de embriões nos estágios de uma célula para um vidro 5 cm de diâmetro ou revestidos por placa de Petri de plástico de agarose contendo ~ 8 mL de meio de embrião. Adicionar 2 ml de solução de estoque descongelado pronase para o prato e incubar à temperatura ambiente durante 5 a 10 min.
- Evite expor embriões para o ar ou plástico, como o contato com qualquer um fará com que embriões dechorionated à ruptura. Encha um copo de vidro de 200 ml com meio embrião. Transferir os embriões para o béquer através da inclinação da placa de Petri enquanto submergindo-o no meio.
- Depois de os embriões terem assentado no fundo do copo, derramar a maior parte do meio de embrião, depois verter meio fresco embrião para o copo. A roda leve do meio de verter para o copo faz com embriões a perder seus córions enfraquecidos.
- Repita o passo 1.2.4.
- Transferir os embriões dechorionated a uma injeção prato revestido de agarose 29 usando uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta flambado. Chamejantea ponta da pipeta impede bordas irregulares a partir de embriões mutilações.
- Co-injetar o mRNA e a 3 kDa Alexa488-dextrano conjugado 29,30 (Figura 1B; veja a discussão para sugeriu mRNA e quantidades Alexa488-dextrano). Injectar directamente no centro da célula (não a gema) para assegurar uma distribuição de ARNm e corante fluorescente uma vez começa a clivagem.
Nota: O sinal Alexa488 vai ser utilizado durante a análise dos dados para gerar máscaras compartimentados de modo a distinguir entre a fluorescência intracelular e extracelular. - Transferência de embriões injectados a uma revestidos por 1-2% de agarose poço de uma placa de seis poços de plástico cheio com meio de embrião. Incubar no escuro a 28 ° C até embriões ter atingido o estágio final de esfera 31 (cerca de 5 horas após a fertilização). Verifique embriões, cada um para 2 horas sob um microscópio estereoscópico e remover todos os detritos gerados por embriões que já morreram.
2. Montagem embriões Zebrafish para Photoconversion e imagem em um microscópio invertido confocal
- Use uma lupa para identificar 1-5 embriões saudáveis, e usar uma pipeta Pasteur de vidro com uma ponta flambado para removê-los do prato.
- Suavemente ejectar os embriões para um tubo de microcentrífuga contendo ~ 1 ml de 1% derretido baixo ponto de fusão de agarose na forma de embrião 1x Danieau (ver Materiais Lista) (Figura 2A).
Nota: Agarose deve ter uma temperatura entre 40 e 42 ° C; temperaturas mais elevadas podem danificar os embriões. - Desenhar os embriões para a pipeta, juntamente com alguns agarose. Gentilmente ejetar o agarose e embriões para a tampa de vidro de um prato fundo de vidro (Figura 2B). Assegure-se que a espessura do vidro de cobertura é compatível com o objectivo no microscópio confocal.
- Re-utilizar a pipeta de vidro, se desejar. Para limpar a agarose residual para fora da pipeta e evitar o entupimento, rapidamente médio pipeta embrião cima e para baixo.Coloque um tubo de 15 ml cheio com ~ 5 ml de meio ao lado do embrião estereomicroscópio para esta finalidade.
- Use uma sonda de metal para posicionar os embriões para que o polo animal (blastoderm) enfrenta a tampa de vidro. Trabalhe rapidamente desde a agarose vai solidificar em 20-30 seg. Use a lupa para monitorar as posições dos embriões e reajustar se necessário até que a agarose endurece.
- Repita os passos 2,1-2,4 até que o número desejado de embriões tiver sido montado.
Nota: Em uma experiência típica, quatro gotas de agarose contendo quatro ou cinco embriões cada um vai caber facilmente na tampa de vidro. Cerca de 16 embriões pode ser trabalhada durante um único ensaio ideal (Figura 2C). - Quando a agarose solidificou, encha o prato com fundo de vidro com meio embrião de 1x Danieau.
3. Photoconverting e medindo a diminuição do sinal Photoconverted
Um objectivo 25X ou 40X de água ié adequado para o tamanho e índice de refracção de embriões de peixes-zebra. É melhor utilizar óleo de imersão com o mesmo índice de refracção de água em vez de água real, uma vez que a água irá evaporar-se durante o decurso da experiência de cinco horas. Assegure-se que o óleo de imersão é concebido para ser usado com um objectivo de água (não de petróleo).
- Coloque uma grande gota de óleo de imersão sobre o objetivo de garantir que a película de óleo entre o objetivo e tampa de vidro não vai quebrar como palco move-se para diferentes posições do embrião durante a geração de imagens. Firmemente colocar o prato com fundo de vidro para o palco para que o prato não vai mudar quando o estágio de movimentos. Se possível, utilizar uma fase aquecida a 28 ° C, a temperatura óptima para o desenvolvimento do peixe-zebra.
- Definir a posição de cada embrião no pacote de software do microscópio confocal. Ajuste o z-depth para cada embrião, e tentar alvejar a menos no mesmo plano em cada embrião.
Nota: Cerca de 30 mm a partir do pólo animal é um good profundidade desde a esta profundidade da camada envolvente do embrião pode ser evitada, a área de imagem é maximizada, e dispersão de luz é mínima. Uma fatia óptico único, com uma espessura de 3,3 mm ~ fornece dados suficientes; não há necessidade de adquirir uma pilha de z (ver item 5). - Recolhe dois sinais ao longo do experimento: o sinal "verde" do Alexa488-dextrano conjugado-que irá ser utilizado durante a análise de dados para isolar extracelular e intracelular de fluorescência e o sinal "vermelho" a partir da proteína de fusão após o que é photoconverted.
- Excitar Alexa488 usando um laser de 488 nm e a fluorescência emitida a recolher entre ~ 500 e 540 nm. Nota: Depois de fotoconversão, muitos verde-to-vermelho proteínas photoconvertible (eg, Dendra2) pode ser animado com um laser de 543 nm e emitem fluorescência entre ~ 550 e 650 nm. Ajuste conforme necessário, com base na proteína photoconvertible usado.
- Adquirir "pré-fotoconversão"Imagens, e configurar o software do microscópio confocal a imagem cada uma das posições previamente definidos (a partir do passo 3.2), com as condições de imagem apropriados a cada 10 ou 20 minutos para um curso de tempo de cinco horas (ver seção 5 e Discussão).
- Para photoconvert a proteína de fusão, mudar para uma objectiva 10X e expor os grupos de embriões a luz UV proveniente de uma lâmpada de arco de mercúrio com um filtro de ~ 300-400 nm de excitação com a intensidade de 100% durante 2 minutos. Mudar o foco ao longo do eixo z para promover fotoconversão uniforme (ver item 5). Certifique-se que o óleo de imersão não escorrer para a objetiva de 10x durante fotoconversão.
Nota: O deslocamento do foco durante fotoconversão pode ser automatizada, a fim de evitar a variabilidade entre os experimentadores. - Volte para o objectivo 25X ou 40X imediatamente após fotoconversão. Certifique-se de que as posições previamente definidos a partir do passo 3.2 ainda são precisos. Se o prato deslocado durante photoconversion, re-definir as posições dos embriões.
- Inicie o programa criado no passo 3.4 e permitir imaging para continuar por 5 horas. Registar o tempo decorrido entre o início e fotoconversão de formação de imagens para cada embrião.
- Verifique ocasionalmente no experimento. Monitorar o nível de meio de Danieau e adicionar mais, se necessário. Reinicie o software se estagnou.
- A fim de determinar os valores da fluorescência de fundo que serão utilizadas durante a análise dos dados para estimar a assíntota de um modelo exponencial decrescente, incluem alguns embriões que foram injectados com Alexa488-dextrano, mas não ARNm no experimento. Para determinar o ruído do instrumento, a qual também irá ser utilizado durante a análise de dados subsequente, adquirir uma imagem na ausência de uma amostra.
4. Analisando os dados usando PyFDAP
- Inspecione visualmente o tempo de conjuntos de dados de curso de cada embrião. Descartar conjuntos de dados a partir de embriões que morreram durante imaging, que mudou significativamente, que têm níveis muito baixos de sinal photoconverted, ou que contêm regiões de células que se parecem incomum e pararam de se mover e dividindo (típico de embriões feridos ou doentes).
Nota: Ocasionalmente, bolhas no óleo de imersão ou outros artefatos aparece em uma ou duas imagens em um conjunto de dados de outra forma utilizável. Anote todas as imagens que contêm artefatos; eles serão descartados mais tarde, e os restantes pontos de tempo de tal conjunto de dados ainda podem ser analisados. - Use a PyFDAP pacote de software baseado em Python para analisar os dados FDAP. PyFDAP calcula meias-vidas por determinação da intensidade média de fluorescência vermelha intracelular e extracelular em cada imagem e ajuste dos dados com uma função exponencialmente decrescente 56 (Figura 3).
- Baixe PyFDAP (veja Lista de Materiais).
- Uso PyFDAP para separar sinal intracelular e extracelular photoconverted (Figura 3A, B). NósÊ O sinal Alexa488, que é estritamente intracelular, para criar uma máscara de intracelular. Aplique esta máscara para a imagem do canal vermelho correspondente para evitar pixels intracelulares de ser considerado para o cálculo da intensidade média extracelular. Para medir a intensidade intracelular média, inverter a máscara.
- Em PyFDAP, exibir as imagens mascarados gerados na etapa 4.2.2. Inspecione visualmente essas imagens e descartar conjuntos de dados em que as máscaras não distinguir com precisão intracelular do espaço extracelular (este deve ser rara, note que as membranas celulares estão incluídas nas imagens em que o espaço extracelular tem sido mascarado, mas eles poderiam ser removidos através da alteração do limiar algoritmo ou através da introdução de uma máscara de membrana (por exemplo, utilizando uma membrana-PCP)). Também descartar quaisquer imagens individuais contendo artefatos (por exemplo, bolhas no óleo de imersão) identificados na etapa 4.1.
- Use PyFDAP para calcular médias intensidades de fluorescência intra e extracelulares para each imagem. PyFDAP calcula estas médias pela soma das intensidades de pixels que caem fora da máscara e dividindo pelo número total de pixels somados.
- Coloque os dados de fluorescência (Figura 3C), com a seguinte função exponencial:
onde t é o tempo de pós-fotoconversão, c (t) é a intensidade de um dado valor de t, c 0 é a intensidade em t = 0, k é a constante de velocidade de eliminação, e y é 0 a assíntota que se aproxima a função como fluorescência diminui (Figura 1D). y 0 pode ser restringida com base nas medições em 19 passo 3.8. - Use PyFDAP para calcular a proteína extracelular e intracelular de semi-vida (τ) a partir das constantes de velocidade de depuração (k) utilizando a seguinte relação:
5. Experimentos controlo para avaliar Fotodegradação, inadvertida Fotoconversão e Fotoconversão Uniformidade
- Avaliando fotodegradação
Nota: A fotodegradação pode causar uma diminuição na intensidade de fluorescência artefacto que reflecte as propriedades de branqueamento de proteína fluorescente para além da eliminação da proteína de interesse.- Para avaliar a possível fotodegradação, execute uma série de experimentos FDAP com intervalos de 10 min entre imagem e um segundo conjunto, com 20 minutos de intervalo entre as imagens (Figura 4). Analisar os dados de ambos os conjuntos de experimentos usando PyFDAP conforme descrito na Seção 4.
- Compare as meias-vidas dos experimentos de 10 e 20 min de intervalo. Meia-vida de 20 min de intervalo experimentos indicam fotodegradação significativa. Se as semividas de ambas as experiências são idênticos, fotobleaching não é uma preocupação significativa.
- Alternativamente, avaliar a fotodegradação através da aquisição de uma série de ~ 30 imagens imediatamente após fotoconversão. Uma diminuição significativa na intensidade de fluorescência indica fotodegradação significativa.
- Se fotodegradação é detectado, usar o poder do laser inferior, diminuir o tempo de criação de imagens, ou considerar o uso de uma proteína photoconvertible mais fotoestável 32.
- Avaliando fotoconversão inadvertida.
Nota: pode ser Dendra2 photoconverted usando iluminação de 488 nm 27. Quando excitante Alexa488 com o laser de 488 nm, tal como descrito no passo 3.3.1, fotoconversão inadvertido e, por conseguinte, um aumento artefactual na semi-vida aparente da proteína de interesse é possível. No entanto, nós e os outros 33 descobriram que 488 nm iluminação é um método ineficiente de fotoconversão em embriões de peixe-zebra.- Use a experiência de controlo descrito na etapa 5.1.1 para detectar fotoconversão inadvertida. Compare as meias-vidas dos experimentos de 10 e 20 min de intervalo. Shorter meias-vidas de 20 min de intervalo experimentos indicam fotoconversão inadvertida significativo. Se as meias-vidas de ambas as experiências são idênticos, fotoconversão inadvertida não é uma preocupação significativa.
- Se fotoconversão inadvertida for detectado, use uma menor potência do laser de 488 nm e os tempos de imagem mais curtos para evitar inadvertidamente photoconverting Dendra2.
- Avaliando uniformidade fotoconversão.
Nota: Se fotoconversão está inclinado para o polo animal do embrião, a diminuição na fluorescência será influenciada pela difusão da proteína ou do movimento das células em planos mais profundas (Figura 5A).- Para determinar se fotoconversão é uniforme, expressar uma proteína secretada photoconvertible (para as experiências com as proteínas de fusão extracelulares) ou uma proteína citoplasmática photoconvertible (para as experiências com as proteínas de fusão intracelulares). Photoconvert como de costume, tgalinha adquirir uma pilha z engloba a maior parte da blastoderme a cada 20 min durante 80 min.
- Se fotoconversão é tendencioso em direção ao pólo animal, a intensidade de fluorescência em planos mais profundos irá aumentar ao longo do tempo devido à difusão ou movimento celular (Figura 5B). Se não uniforme fotoconversão é detectado, o foco mais profundo nos embriões durante fotoconversão.
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Representative Results
FDAP tem sido usado para determinar a meia-vida de proteínas de sinalização extracelular em embriões de peixe-zebra 19. Uma destas proteínas, estrabismo, induz a expressão de genes durante o desenvolvimento embrionário mesendodermal 34. Estrabismo-Dendra2 activa a expressão de genes mesendodermal em níveis semelhantes aos estrabismo não marcado, como demonstrado por qRT-PCR e hibridização in situ em 19 ensaios. Os embriões foram co-injectados com Alexa488-dextrano e ARNm que codifica estrabismo-Dendra2 e submetido ao ensaio FDAP. A diminuição da intensidade de sinal photoconverted extracelular ao longo do tempo é evidente (Figura 4A). Perfis de intensidade extracelulares a partir de 23 embriões foram gerados utilizando PyFDAP. Os dados resultantes foram montados em PyFDAP com um modelo de cinética de depuração de primeira ordem e uma taxa de eliminação constante k média de 1,00 x 10 -4 / s, o que corresponde a um τ meia-vida média de 116 min, foi determinada. Perfil de intensidade semelhantes e taxa de depuração constantes foram obtidos quando os intervalos entre as imagens eram 10 ou 20 min, sugerindo que a fotodegradação ou inadvertida fotoconversão não contribuíram de forma significativa para as alterações de intensidade (Figura 4B).
Figura 1. Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP) visão geral. (A) de fluxo de trabalho de um experimento FDAP. (B) A injecção de ARNm e um corante fluorescente num embrião do peixe-zebra na fase de uma célula. A proteína é produzida a partir do ARNm como o embrião desenvolve ao longo de cerca de 5 horas antes da imagiologia. O corante rótulos células (círculos verdes). (C) A proteína de fusão é photoconverted utilizando um pulso de UV, e a diminuição da intensidade do sinal ao longo do tempo photoconverted é monitorizada. (D) Os dados são equipados com uma diminuição exponencial função para obter constantes de velocidade de depuração (k) e meia-vida (τ). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Montagem embriões de peixes-zebra para experiências FDAP. (A) (embriões de peixe-zebra blastoderme = branco, preto = gema) são transferidos a partir do meio de embriões (azul) em agarose fundida (amarelo). (B) Os embriões e agarose são colocados na tampa de vidro de um prato fundo de vidro. Os embriões são então posicionados manualmente para que o polo animal enfrenta a tampa de vidro. Um corte transversal de um prato de fundo de vidro é mostrada. (C) Visão esquemática de um prato fundo de vidro com várias gotas de agarose contendo quatro embriões cada (vista olhando para o prato)."target =" _ w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A análise de dados usando PyFDAP. (A) PyFDAP utiliza o algoritmo de limiar Otsu 35 para gerar máscaras intra e extracelulares a partir do sinal intracelular Alexa488 (verde). (B) do sinal Photoconverted (vermelho) a partir de um embrião expressando uma proteína de fusão segregada Dendra2 (Squint-Dendra2 19). Média de intensidades de fluorescência extra e intracelulares foram calculadas usando as máscaras mostrado em (A). O espaço exterior do embrião foi excluído estes cálculos, descartando pixels fora do círculo amarelo. (C) PyFDAP tela exibindo dados de intensidade extracelulares de um experimento FDAP (cir pretoCiclos), equipado com uma função exponencial decrescente (linha tracejada vermelha). A meia-vida extracelular é indicado pela seta vermelha. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Os resultados representativos FDAP. (A) Um embrião representante expressar secretado Estrabismo-Dendra2 pouco antes fotoconversão (extrema esquerda) e 27, 87 e 287 min pós-fotoconversão. (B) Para controlar a fotodegradação e fotoconversão inadvertida (ver seção 5), foram realizados experimentos com 10 ou 20 minutos de intervalo (dados de Müller et al., 2012 19). Em PyFDAP, perfis de intensidade extracelulares foram gerados, equipado com funções exponencialmente decrescente, e normalizada por subtracting o y 0 valor equipada de cada ponto de dados e dividindo pelo equipada c 0 valor. Os dados da 10 minutos (preto, n = 11) e 20 min (azul, n = 12) Intervalo de experiências eram então a média, respectivamente. As barras de erro indicam o desvio padrão. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Avaliação uniformidade fotoconversão. (A) fotoconversão não-uniforme de uma proteína extracelular pode levar a uma semi-vida curta resulta erroneamente proteína photoconverted se difunde para aviões mais profundas ao longo do tempo. (B) Para determinar se fotoconversão é uniforme, uma pilha de z que cobre a maior parte do blastoderm é adquirido em vários pontos do tempo pós-photoconversde iões. A intensidade da fluorescência vai aumentar em planos mais profundos ao longo do tempo se fotoconversão foi não-uniforme (note que a dispersão da luz faz com planos mais profundos para aparecer mais escuro do que planos mais elevados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O sucesso de uma experiência FDAP baseia-se na geração de uma proteína de fusão photoconvertible funcional. Marcação de uma proteína pode afectar a sua actividade biológica e / ou propriedades biofísicas, incluindo a sua localização, a solubilidade, a estabilidade e 36-41. Ser preparados para testar a actividade de várias construções de fusão diferentes, a fim de encontrar um que seja activo. Verificou-se que a mudança da posição da proteína photoconvertible em relação à proteína de interesse ou utilizando ligantes mais longos (por exemplo, utilizando a sequência de aminoácidos LGDPPVAT 19) pode aumentar a actividade da proteína de fusão. No caso de proteínas de sinalização, a actividade da proteína de fusão pode ser determinada testando a sua capacidade para induzir a expressão de genes alvo 19. qRT-PCR ou hibridação in situ fornecem boas leituras de expressão do gene alvo 19. Note-se que o protocolo aqui descrito destina-se a determinar a estabilidade de proteínasno embrião do peixe-zebra e precoce iria requerer modificação para avaliar a estabilidade da proteína em outros contextos.
A proteína photoconvertible verde-a-vermelho Dendra2 27 tem sido usado com sucesso em experiências de peixe-zebra FDAP 19 (Figura 4), mas estão disponíveis outras opções 26,42. Para evitar potenciais artefactos devido a agregação da proteína de fusão, escolher uma proteína monomérica photoconvertible. Photoactivatible proteínas também podem ser utilizadas em FDAP ensaia 20-22,26.
Antes de efectuar um experimento FDAP, vários aspectos do protocolo necessita de ser optimizada. Injetar diferentes quantidades de mRNA para determinar o valor mais baixo que fornece sinal utilizável após fotoconversão; ~ 50 pg mRNA é um montante de partida boa. A fim de gerar máscaras compartimentados significativas (Figura 3), o sinal Alexa488 deve ser suficientemente brilhante paracompetir contra o sinal da proteína de fusão não photoconverted que é constantemente produzido a partir do ARNm injectado; injectar entre 0,2 e 4 ng de Alexa488-dextrano para encontrar a quantidade óptima de corante fluorescente. Encontre as condições ideais de imagem pós-conversão e usar as mesmas condições para todos os experimentos com um determinado construto. Use o bom imagens quantitativas pratica 43, e escolha uma faixa dinâmica adequada para evitar pixels saturados no canal vermelho. Determinar o intervalo de imagiologia adequado para cada proteína de fusão. Proteínas com meias-vidas muito curtas podem exigir uma imagem mais frequente ao longo de um período de tempo total mais curto. Estabelecer a técnica fotoconversão ideal com base no organismo e proteína photoconvertible utilizado. Nós descrevemos um método fotoconversão robusta usando uma lâmpada de arco de mercúrio na etapa 3.5, mas também pode ser Dendra2 photoconverted com um laser 405 33 ou 488 nm 27.
Um limitation deste protocolo FDAP é que a sobre-expressão da proteína de interesse é necessária. A sobre-expressão pode afectar a estabilidade da proteína, por exemplo, através da expressão anormal de outros genes que modificam a cinética de depuração da proteína 14,44. Se a proteína de interesse é uma molécula de sinalização, considerar a realização de experiências na presença de um inibidor da sinalização para determinar se o bloqueio da expressão de genes alvo afecta a estabilidade da proteína. No futuro, pode ser possível gerar os embriões transgénicos que expressam as fusões photoconvertible sob o controlo de elementos de expressão endógenos 45-50. Se embriões transgênicos produzem sinal suficiente, experimentos FDAP em um contexto não superexpressão são concebíveis, talvez usando microscopia de luz folhas de observar diminuição de fluorescência em todo o embrião 51.
Possíveis aplicações práticas FDAP incluem investigando o tha mecanismost regular a estabilidade da proteína, examinando os efeitos de diferentes perturbações (por exemplo, expressão de proteases putativos) ou modificações de proteínas (por exemplo, fosforilação), para a estabilidade. Por exemplo, os factores que controlam a estabilidade extracelular de estrabismo são presentemente desconhecidos. Muitos sinais de desenvolvimento secretadas são internalizados pelas células 52-55, o que poderia contribuir para o apuramento do estrabismo e outros ligantes do espaço extracelular. FDAP experimentos em que se encontra bloqueada internalização pode fornecer informações sobre os mecanismos de controle de apuramento proteína extracelular.
Em contraste com os ensaios convencionais para medir a estabilidade da proteína 15, FDAP oferece uma alternativa à base de microscopia no qual o espaço de proteínas pode ser monitorizado ao longo do tempo dentro dos organismos vivos. Métodos semelhantes têm sido utilizados para monitorizar depuração de proteínas em embriões de peixe-zebra que outros sistemas modelo 20-23. Este protocolo FDAP tem o potencial de ser adaptado para determinar a meia-vida de qualquer proteína taggable em sistemas biológicos, onde imagens ao vivo é viável.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Jeffrey Farrell, James Gagnon, e Jennifer Bergmann para comentários sobre o manuscrito. KWR foi apoiado pelo Programa de Bolsas de Pós-Graduação National Science Foundation Research durante o desenvolvimento do ensaio FDAP. Este trabalho foi financiado por doações do NIH para AFS e por doações da Fundação Alemã de Pesquisa (Emmy Noether Programa), a Sociedade Max Planck, e do Programa Human Frontier Science (Prémio Carreira de Desenvolvimento) para PM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) | Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems. | ||
| mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit | Life Technologies | AM1340 | To generate capped mRNA for injection into embryos |
| Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa | Life Technologies | D34682 | Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks |
| 6-well plastic dish | BD Falcon | Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting | |
| Embryo medium | 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3 | ||
| Protease from Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage |
| 5 cm diameter glass Petri dish | For embryo dechorionation | ||
| 200 ml glass beaker | For embryo dechorionation | ||
| Microinjection apparatus | For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage | ||
| Stereomicroscope | For injecting and mounting embryos | ||
| 1x Danieau's medium | Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2 | ||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-100 | For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use |
| Glass Pasteur pipette | Kimble Chase (via Fisher) | 63A53WT | For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos |
| Metal probe | For positioning embryos during mounting | ||
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5 |
| 15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium | BD Falcon | For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette | |
| Inverted laser scanning confocal microscope | A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required | ||
| Heated stage | To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment | ||
| Confocal software capable of time-lapse imaging | Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals | ||
| 25X or 40X water objective | Objective for imaging | ||
| 10X air objective | Objective for photoconversion | ||
| Immersion oil | Immersion oil with the same refractive index as water |
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