Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Published: January 28, 2015 doi: 10.3791/52266
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, 2Systems Biology of Development Group, Friedrich Miescher Laboratory of the Max Planck Society

Summary

Уровни белка в клетках и тканях часто жестко регулируется баланс производства белка и оформления. С помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP), зазор кинетика белков может быть измерена экспериментально в естественных условиях.

Abstract

Стабильность белка влияет на многие аспекты биологии и измерения зазора кинетики белков может обеспечить важную информацию в биологических системах. В FDAP экспериментов, очистка белков внутри живых организмов могут быть измерены. Интересующий белок помечен photoconvertible флуоресцентного белка, выраженного в естественных условиях и photoconverted и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется. Затем данные снабжены соответствующей модели зазора определения белка полураспада. Важно отметить, что оформление кинетика населения белка в различных отсеках организма могут быть рассмотрены отдельно, применяя на отсеки маски. Этот подход был использован для определения внутри- и внеклеточного полураспада секретируемых белков сигнализации во данио развития. Здесь мы опишем протокол для FDAP экспериментов у эмбрионов данио рерио. Должна быть возможность использовать FDAP определить зазор кинетикилюбой taggable белка в любой оптически доступной организма.

Introduction

Уровни белков в клетках и организмах определяется их темпов производства и оформления. Белковые полураспада может составлять от нескольких минут до нескольких дней 1-4. Во многих биологических системах, стабилизация или оформление ключевых белков имеет важные последствия для клеточной активности. Модуляция внутриклеточного стабильности белка требуется для прогрессии клеточного цикла 5,6, Сигнализация развития 7-9 апоптоза 10, и нормальной функции и содержание нейронов 11,12. Внеклеточный стабильность белков влияет на распределение и наличие секретируемых белков, таких как морфогенов 13,14, внутри ткани.

За последние несколько десятилетий, стабильность белков в основном были оценены в культуре клеток с помощью радиоактивных пульс-мечение или циклогексимид эксперименты погони 15. В таких импульсов-чейз экспериментов клетки либо временно воздействию "импульс" радиоактивного аминопредшественники кислот, которые включены во вновь синтезированных белков, или они подвергаются циклогексимидом, который ингибирует синтез белка. Культивируемые клетки затем собирают в различные моменты времени, и либо иммунопреципитации с последующим авторадиографии (в экспериментах радиоактивных импульса-чейз) или Вестерн-блоттинга (в циклогексимид экспериментов) используется для количественной оценки зазор белка с течением времени.

Обычные анализы стабильности белка имеют ряд недостатков. Во-первых, белки в этих анализах часто не выраженные в их эндогенных среде, а в культуре ткани, а иногда и в клетках из различных видов. Для белков, стабильность зависит от контекста, этот подход является проблематичным. Во-вторых, это не возможно, чтобы следовать зазор белка в отдельных клеток или организмов с течением времени, и данные из этих тестов отражает среднее число различных популяций клеток в различные моменты времени. Так как отдельные клетки, возможно, началис различным количеством белка, возможно, взяли на себя радиоактивную метку или циклогексимид в разное время, или могут иметь различные оформления кинетики, такие совокупные данные могут вводить в заблуждение. Наконец, в случае циклогексимид экспериментов Chase, добавление ингибитора синтеза белка может иметь нежелательные физиологические эффекты, которые могут искусственно изменяют стабильность белка 16-18. Эти недостатки можно избежать с помощью флуоресценции упадок после фотопреобразования (FDAP), техника, которая использует photoconvertible белки для измерения зазора белка динамически в живых организмах 19-25 (см Обсуждение на ограничения метода FDAP).

Photoconvertible белки флуоресцентные белки, возбуждения и эмиссии свойства изменяются после воздействия определенных длин волн света 26. Одной из наиболее распространенных вариант Dendra2, "зеленый к красный" photoconvertible белок, который изначально имеет эксЦитирование и выбросов свойствами, аналогичными свойствам зеленого флуоресцентного белка, но после воздействия УФ-СВЕТА "фотопреобразования" -its возбуждение / эмиссионные свойства становятся аналогичными красных флуоресцентных белков 23,27. Важно отметить, что новый белок, вырабатываемый после фотопреобразования не будет иметь те же свойства возбуждения / испускания как photoconverted белка, что позволяет развязку производства и оформления на фотопреобразования и наблюдать только в бассейне photoconverted белка. Маркировка белки, представляющие интерес с photoconvertible белков, таким образом, обеспечивает удобный способ широтно-метки белков в неповрежденных, оптически доступных живых организмов.

В FDAP анализа (рис 1а) интерес белок помечен photoconvertible белка и выразил в живом организме (рис 1б). Слитый белок photoconverted, и уменьшение photoconverted сигнала с течением времени контролируется fluorescenCE микроскопии (рис 1С). Затем данные снабжены соответствующей модели, чтобы определить период полураспада слитого белка (фиг 1D).

FDAP анализа, описанного здесь был разработан, чтобы определить, внеклеточные полураспада, выделяемых сигнальных белков у эмбрионов данио рерио во время раннего эмбриогенеза 19. Тем не менее, этот подход может быть приспособлен к любому прозрачного модельного организма, что терпит живого изображения, и могут быть использованы для мониторинга зазора любой taggable внутриклеточного или внеклеточного белка. Вариации методике, описанной здесь, были выполнены в культивируемых клетках дрозофилы 20,23 и 22, и 21 мышей эмбрионы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Создание Photoconvertible слитой конструкции и инъекционных Dechorionated эмбрионов данио рерио

  1. Генерирование функциональную конструкцию, содержащую белок, представляющий интерес, слитого с зеленой к красным photoconvertible белка (см обсуждения), затем с помощью транскрипции в пробирке для генерации ограничен мРНК, кодирующей слитый белок, как и в Мюллер и др., 2012 19.
  2. Использование проназу, чтобы удалить хорионов от примерно 30 эмбрионов данио рерио на стадии одной клетки. Кроме того, вручную dechorionate эмбрионов с помощью щипцов 28.
    Примечание: Эмбрионы должны быть dechorionated для последующего визуализации. При желании, эмбрионы могут быть введены через хориона и dechorionated позже, непосредственно перед визуализации.
    1. Сделайте 5 мг / мл маточного раствора проназой из Streptomyces пзеиз в стандартном данио эмбриона среды 19. Rock раствор осторожно при КТ в течение 10 мин, чтобы позволить протеазы, чтобы растворить. Алиготе 2 мл в микроцентрифужных пробирках и заморозить при температуре -20 ° С.
    2. Двухступенчатой ​​раздаточной одноклеточный эмбрион на стакан диаметром 5 см или агарозном-пластика с покрытием, чашки Петри, содержащей ~ 8 мл эмбриона среды. Добавить 2 мл талой проназа маточного раствора на блюдо и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 до 10 мин.
    3. Избегайте попадания эмбрионов с воздухом или пластика, как контакт либо с вызовет dechorionated эмбрионы к разрыву. Заполните стеклянный стакан 200 мл с эмбриона среды. Передача эмбрионов в стакан, наклоняя чашку Петри в то время погружения его в среде.
    4. После эмбрионы осели на дно химического стакана, вылить большую часть эмбриона среды, а затем заливают свежей среды эмбриона в стакан. Мягкий закрученного среды, поступающих в стакане вызывает эмбрионы потерять свои ослабленные хорионов.
    5. Повторите шаг 1.2.4.
  3. Передача dechorionated эмбрионов в агарозном покрытием впрыска блюдо 29 с помощью стеклянной пипетки Пастера с обожженные наконечником. Пылающийпипетки предотвращает неровные края от повреждения эмбрионов.
  4. Co-инъекции мРНК и 3 кДа Alexa488-декстран 29,30 (рисунок 1b, см Обсуждение на предложенной мРНК и Alexa488-декстрана количеств). Внедрить прямо в центр клетки (не желтка), чтобы обеспечить равномерное распределение мРНК и флуоресцентный краситель раз расщепление начинается.
    Примечание: Сигнал Alexa488 будет использоваться во время анализа данных, чтобы сформировать на отсеки маски для того, чтобы различать внутриклеточную и внеклеточную флуоресценции.
  5. Передача вводили эмбрионы 1-2% агарозном покрытием лунку шесть хорошо пластиковую чашку, наполненную эмбриона среды. Инкубируют в темноте при 28 ° С до тех пор, эмбрионы не достигла поздней стадии сферы 31 (примерно 5 часов после оплодотворения). Проверьте эмбрионов каждый на 2 ч под стереомикроскопом и удаления мусора, порожденную эмбрионов, которые умерли.

2. Монтаж данио рерио эмбрионов для Photoconversion и изображений на перевернутом конфокальной микроскопии

  1. Используйте стереомикроскопа для выявления 4:59 здоровые эмбрионы, а также использовать стекло пипетки Пастера с обожженные Совет, чтобы удалить их из чашки.
  2. Осторожно извлечь эмбрионов в микроцентрифужных трубки, содержащей ~ 1 мл расплавленного 1% легкоплавкой агарозе в среде эмбриона 1x Danieau (см Материалы список) (фиг.2А).
    Примечание: в агарозном должны иметь температуру от 40 до 42 ° C; Повышение температуры может привести к повреждению эмбрионов.
  3. Нарисуйте эмбрионов обратно в пипетку наряду с некоторыми агарозы. Аккуратно извлеките агарозы и эмбрионов на крышке стакана со стеклянным дном блюдо (рис 2б). Убедитесь, что толщина покровного стекла совместима с целью по конфокальной микроскопии.
    1. При желании Повторное использование стеклянной пипетки. Для очистки остаточного агарозы из пипетки и предотвратить засорение, быстро пипетки эмбриона среды вверх и вниз.Поместите 15 мл пробирку, заполненную ~ 5 мл среды эмбриона рядом с стереомикроскопа для этой цели.
  4. Используйте металлический зонд в положение эмбрионов, так что животное полюс (бластодерма) сталкивается покровного стекла. Работают быстро, поскольку агарозном затвердевает в 20-30 сек. Используйте стереомикроскопа для мониторинга позиций эмбрионов и корректировать по мере необходимости, пока агарозном затвердевает.
  5. Повторите шаги 2.1-2.4, пока желаемое количество эмбрионов не был установлен.
    Примечание: В типичном эксперименте, четыре агарозные капли, содержащие четыре или пять эмбрионов каждый легко поместится на покровного стекла. Около 16 эмбрионы могут быть отображены в течение одного идеального эксперимента (фиг.2с).
  6. Когда агарозном укрепил, заполните со стеклянным дном блюдо с эмбриона среды 1x Danieau-х годов.

3. Photoconverting и измерения уменьшение Photoconverted сигнала

25X или 40X воды цель яS соответствуют размеру и преломления эмбрионов данио рерио. Лучше всего использовать погружной масло с таким же показателем преломления, как вода, а не фактического воды, так как вода испаряется в течение пяти часов эксперимента. Убедитесь, что погружение масло предназначено для использования с водой (не маслом) цели.

  1. Место большой каплю иммерсионного масла на цели для того, чтобы масляная пленка между объективом и покровным стеклом не сломается на стадии перемещается в различных положениях эмбрионов в течение визуализации. Надежно устанавливайте со стеклянным дном блюдо на сцене, так что блюдо не будет смещаться, когда сценические ходы. Если возможно, используйте подогревом этап при 28 ° С, оптимальная температура для рыбок данио развития.
  2. Определить позицию каждого эмбриона в пакет программного обеспечения конфокальной микроскопии в. Отрегулируйте Z-глубину для каждого эмбриона, и попытаться целевой примерно в той же плоскости в каждом эмбриона.
    Примечание: Около 30 мкм от животных полюса Перейтиглубина OD, так как при этой глубине обволакивающий слой зародыша можно избежать, область изображения развернуто, и рассеяние света минимальна. Один оптический срез толщиной ~ 3,3 мкм обеспечивает достаточную данных; нет необходимости приобретать Z-стек (см раздел 5).
  3. Соберите два сигнала во время эксперимента: «зеленый» сигнал от Alexa488-декстран-который будет использоваться во время анализа данных, чтобы изолировать внеклеточный и внутриклеточный флуоресценции и "красный" сигнал от слитого белка после его photoconverted.
    1. Excite Alexa488 использованием 488 нм лазер, и собрать излучаемую флуоресценции между ~ 500 и 540 нм. Примечание: После фотопреобразования, много зеленых к красным photoconvertible белки (например, Dendra2) может быть возбужден 543 нм лазера и излучают свечение между ~ 550 и 650 нм. Регулировка по мере необходимости на основе photoconvertible белком, используемым.
  4. Приобретать "до фотопреобразования"Изображения, а также настроить программное обеспечение конфокальной микроскопии для изображения каждого из ранее определенных позициях (на шаге 3.2) с соответствующими условий формирования каждые 10 или 20 мин для пяти-часового курса (см раздел 5 и Обсуждение).
  5. Для photoconvert слитый белок, переключиться на цели 10X и подвергать группы эмбрионов к УФ-света от дуговой ртутной лампы с фильтром ~ 300-400 нм возбуждения при 100% мощности в течение 2 мин. Сместить акцент вдоль оси содействия равномерного фотоконверсии (см раздел 5). Убедитесь, что иммерсионное масло не капает на 10x цели в ходе фотопреобразования.
    Примечание: смещение фокуса во фотопреобразования может быть автоматизирован, чтобы избежать изменчивости среди экспериментаторов.
  6. Вернитесь к цели 25X или 40X сразу после фотопреобразования. Убедитесь, что ранее определенные позиции от шага 3.2 по-прежнему точным. Если блюдо смещается во время photoconversion, повторно определить позиции эмбрионов.
    1. Запустите программу, созданную на шаге 3.4 и позволяют визуализации продолжаться в течение 5 часов. Обратите внимание на время, прошедшее между фотопреобразования и началом визуализации для каждого эмбриона.
  7. Время от времени проверяйте на опыте. Контроль за уровнем среды Danieau и добавить больше, если это необходимо. Запустите программное обеспечение, если оно в тупик.
  8. Для того чтобы определить флуоресценции значений фона, который будет использоваться во время анализа данных, чтобы оценить асимптоту экспоненциально убывающей модели, включают некоторые эмбрионы, которые были введены с Alexa488-декстрана, а не мРНК в эксперименте. Для определения шума прибора, который также будет использоваться при последующем анализе данных, получения изображения в отсутствие образца.

4. Анализируя данные с помощью PyFDAP

  1. Осмотрите времени наборов данных, конечно, от каждого эмбриона. Отменить наборов данных из эмбрионов, которые погибли во время ИМАГING, которая сняла значительно, которые имеют очень низкие уровни photoconverted сигнала, или что есть районы, в клетках, которые выглядят необычно и перестали двигаться и деления (что характерно для раненых или больных эмбрионов).
    Примечание: Иногда, пузырьки в иммерсионного масла или другие артефакты будут появляться в одном или двух изображений в противном случае используемый набор данных. Обратите внимание на любые изображения, которые содержат артефакты; они будут отброшены позже, а остальные моменты времени из такого набора данных все еще может быть проанализирована.
  2. Используйте Python на основе пакета программного обеспечения PyFDAP анализировать данные FDAP. PyFDAP рассчитывает полураспада путем определения средней внутриклеточный и внеклеточный интенсивность красной флуоресценции в каждой изображения и подгонки данных с экспоненциально убывающей функции 56 (рис 3).
    1. Скачать PyFDAP (см Список материалов).
    2. Использование PyFDAP чтобы отделить внутриклеточной и внеклеточной photoconverted сигнала (рисунок 3а, б). Наме сигнал Alexa488, который строго внутриклеточного, чтобы создать внутриклеточный маску. Применить эту маску на соответствующий изображении красного канала, чтобы предотвратить внутриклеточные пикселей из рассмотрения при расчете средней внеклеточный интенсивности. Для измерения средней внутриклеточный интенсивность, инвертировать маску.
    3. В PyFDAP, отображать в масках изображений, сформированных на этапе 4.2.2. Осмотрите эти образы и отбросить наборов данных, в которых маски точно не отличают внутриклеточных из внеклеточного пространства (это должно быть редки; обратите внимание, что клеточные мембраны включены в образах, в которых межклеточное пространство было заблокировано, но они могут быть удалены путем изменения пороговых значений Алгоритм или путем введения мембраны маски (например, с использованием мембранного CFP)). Также отказаться от любых одиночных изображений, содержащих артефактов (например, пузырьки в иммерсионного масла), выявленных на этапе 4.1.
    4. Используйте PyFDAP для вычисления средних внеклеточные и внутриклеточные интенсивности флуоресценции для ВАСч изображения. PyFDAP вычисляет эти средние путем суммирования интенсивности пикселей, которые выходят за маски и деления на общее количество пикселей суммируются.
    5. Установите данные флуоресценции (рис 3в) с экспоненциальной функции:

      где т время после фотопреобразования, С (Т) является интенсивность в заданном значении T, C 0 интенсивность при Т = 0, K является постоянной клиренс, и у 0 асимптота, что функция подходит как флуоресценции уменьшается (рис 1D). Y 0 может быть ограничена на основании измерений на этапе 3,8 19.
    6. Используйте PyFDAP для расчета внеклеточного и внутриклеточного белка полураспада (τ) из констант скорости клиренса (к) с использованием следующей зависимости:

5. Контроль Эксперименты по оценке Фотообесцвечивания, случайного фотопреобразования и фотопреобразования единства

  1. Оценка фотообесцвечивание
    Примечание: Фотообесцвечивание может привести к следов искусственной снижение интенсивности флуоресценции, отражающей отбеливающие свойства флуоресцентного белка в дополнение к оформлению интересующего белка.
    1. Для оценки возможного фотообесцвечивание, выполните один набор FDAP экспериментов с 10-минутными интервалами между изображениями и второй набор с 20-минутными интервалами между изображениями (рисунок 4). Анализ данных с обеих сериях экспериментов с использованием PyFDAP, как описано в разделе 4.
    2. Сравните полураспада от экспериментов 10 и 20 минутного интервала. Более половины жизни от 20-минутного интервала экспериментов свидетельствуют о существенном фотообесцвечивание. Если период полураспада от обоих экспериментах идентичны, фотobleaching не серьезную озабоченность.
    3. Кроме того, оценки фотообесцвечиванию путем приобретения серии ~ 30 изображений сразу после фотопреобразования. Значительное снижение интенсивности флуоресценции свидетельствует о значительном фотообесцвечивание.
    4. Если фотообесцвечивание обнаружено, использовать нижний мощности лазера, уменьшить время обработки изображений, или рассмотреть возможность использования более фотостабильных photoconvertible белок 32.
  2. Оценка случайного фотоконверсии.
    Примечание: Dendra2 может быть photoconverted использованием 488 нм освещение 27. Когда захватывающим Alexa488 с 488 нм лазером, как описано в шаге 3.3.1, случайного фотопреобразования и, следовательно, об искусственной увеличения кажущейся полураспада белка, представляющего интерес возможно. Тем не менее, мы и другие 33 обнаружили, что 488 нм подсветки является неэффективным методом фотопреобразования эмбрионов данио рерио.
    1. Используйте контрольный эксперимент, описанный в шаге 5.1.1 для обнаружения случайного фотоконверсии, Сравните полураспада от экспериментов 10 и 20 минутного интервала. Более короткие периоды полураспада от 20-минутного интервала экспериментов свидетельствуют о существенном случайного фотоконверсии. Если период полураспада от обоих экспериментах идентичны, небрежные фотопреобразования не серьезную озабоченность.
    2. Если случайное фотопреобразования обнаружено, использовать более низкую мощность лазера 488 нм и более короткое время отображения, чтобы избежать непреднамеренного photoconverting Dendra2.
  3. Оценка фотопреобразования однородности.
    Примечание: Если фотопреобразования смещен в сторону животного полюс эмбриона, уменьшение флуоресценции будет зависеть от диффузии белка или движения клеток в более глубоких плоскостей (фиг.5А).
    1. Чтобы определить, является ли фотопреобразования равномерно, выразить секретируемый photoconvertible белок (для экспериментов с внеклеточных белков слияния) или цитоплазматический photoconvertible белок (для экспериментов с внутриклеточными белками слияния). Photoconvert как обычно, ткурица приобрести Z-стек, охватывающий большую часть бластодермы каждые 20 мин в течение 80 мин.
    2. Если фотопреобразования смещается в сторону животного полюс, интенсивность флуоресценции в более глубоких самолетов будет увеличиваться с течением времени за счет диффузии или перемещения клеток (рис 5б). Если неравномерная фотопреобразования обнаружено, сосредоточиться глубже в эмбрионов во время фотопреобразования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

FDAP был использован для определения полураспада внеклеточных сигнальных белков у эмбрионов данио рерио 19. Один из этих белков, Косой, индуцирует экспрессию генов в процессе эмбриогенеза mesendodermal 34. Косой-Dendra2 активирует экспрессию генов mesendodermal на уровне аналогичных немеченого косоглазия, о чем свидетельствует Qrt-ПЦР и гибридизация анализов 19. Эмбрионы были совместно вводят Alexa488-декстран и мРНК, кодирующей косоглазия-Dendra2 и подвергают анализа FDAP. Уменьшение интенсивности внеклеточного photoconverted сигнала с течением времени, очевидно (фиг.4А). Внеклеточные профили интенсивности от 23 эмбрионов были получены с использованием PyFDAP. Полученные данные были установлены в PyFDAP с первого порядка оформления кинетики модели, и средний клиренс константа к 1,00 х 10 -4 / сек, что соответствует средней полураспада τ 116 мин, была определена. Аналогичная профиль интенсивностиS и скорости клиренса константы были получены, когда интервалы между изображениями были 10 или 20 мин, что указывает фотообесцвечивание или случайного фотопреобразования существенно не способствуют изменения интенсивности (фиг.4В).

Рисунок 1
Рисунок 1. флуоресценции упадок после фотопреобразования (FDAP) Обзор. () Workflow эксперимента FDAP. (В) Инъекции мРНК и флуоресцентный краситель в данио эмбриона на стадии одной клетки. Белок получают из мРНК в эмбрион развивается в течение примерно 5 ч до обработки изображений. Краситель этикетки клеток (зеленые кружки). (С) слитый белок photoconverted с помощью УФ-импульса, а уменьшение интенсивности photoconverted сигнала с течением времени контролируется. (D) Данные оснащены экспоненциально убывает функция получения значений констант скорости клиренса (К) и период полураспада (τ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. Монтажные эмбрионы рыбок данио для FDAP экспериментов. (A) Эмбрионы рыбок данио (бластодерма = белый, желток = черный) передаются от эмбриона среды (синий) в расплавленный агарозы (желтый). (B) Эмбрионы и агарозы помещаются на покровного стекла из прозрачным дном блюдо. Эмбрионы затем вручную расположены так, что животное полюсных покровное стекло. Поперечное сечение со стеклянным дном тарелки показано. (C) Схематический обзор со стеклянным дном блюдо с несколькими агарозы капли, содержащие четыре эмбрионов каждый (вид, глядя в чашку).w.jove.com/files/ftp_upload/52266/52266fig2large.jpg "TARGET =" _ пустое "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ данных с помощью PyFDAP. (A) PyFDAP использует алгоритм пороговой Оцу 35 для создания внутри- и внеклеточной маски из внутриклеточного сигнала Alexa488 (зеленый). (B) сигнал Photoconverted (красный) из эмбриона выражения секретируемый Dendra2 слитый белок (Косоглазие-Dendra2 19). Средние внеклеточном и внутриклеточном интенсивности флуоресценции были рассчитаны с использованием маски, показанных на (A). Пространство вне эмбриона был исключен из этих расчетов, отбрасывая пикселей за пределами желтого круга. (C) PyFDAP скриншот отображения данных внеклеточные интенсивности от эксперимента FDAP (черный CIRCles), установленный с экспоненциально убывающей функции (красная пунктирная линия). Внеклеточный полураспада указано красной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Результаты представитель FDAP. () Представитель эмбрион выражения секретируется Косоглазие-Dendra2 только до фотопреобразования (крайний слева) и 27, 87 и 287 мин после фотопреобразования. (B) Для контроля фотообесцвечиванию и случайного фотопреобразования (раздел 5), были проведены эксперименты с 10 или 20-минутные интервалы (данные Мюллера и др., 2012 19). В PyFDAP, внеклеточные профили интенсивности были получены, оснащенный экспоненциально убывающих функций и нормализуется subtracка оборудованная у 0 значение из каждой точки данных и деления на кухню C 0 значение. Данные, полученные в 10 мин (черный, п = 11) и 20 мин (синий, N = 12) Интервал эксперименты затем были усреднены, соответственно. Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Оценка фотопреобразования однородность. (А) Неравномерное фотопреобразования из внеклеточного белка может привести к ошибке короткого видимой полураспада при photoconverted белок диффундирует в более глубоких плоскостей с течением времени. (B) Чтобы определить фотопреобразования равномерно, г-стек покрывающий большую часть бластодермы приобретается на несколько временных точек пост-photoconversиона. Интенсивность флуоресценции будет увеличиваться в более глубоких самолетов в течение долгого времени, если фотопреобразования был неоднороден (обратите внимание, что рассеяние света происходит более глубокие самолеты появляются слабее, чем более высокие планы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Успех эксперимента FDAP опирается на генерацию функциональной photoconvertible слитого белка. Пометка белок может повлиять на его биологическую активность и / или биофизические свойства, в том числе его локализации, растворимости, стабильности и 36-41. Будьте готовы проверить активность различных слитых конструкций для того, чтобы найти тот, который является активным. Мы обнаружили, что изменение положения photoconvertible белка по отношению к интерес белка или с использованием более длинные линкеры (например, с помощью LGDPPVAT аминокислотной последовательности 19) может повысить активность слитого белка. В случае сигнальных белков, активность слитого белка может быть определена путем проверки его способности индуцировать экспрессию генов-мишеней 19. Qrt-PCR или гибридизация обеспечить хорошие показания экспрессии генов целевой 19. Следует отметить, что протокол, описанный здесь, предназначен для определения стабильности белковв начале данио эмбриона и потребует модификации для оценки стабильности белка в других контекстах.

Зеленый к красный photoconvertible белок Dendra2 27 успешно используется в данио FDAP экспериментов 19 (рис 4), но другие варианты 26,42. Чтобы избежать возможных артефактов из-за агрегации слитого белка, выбрать мономерного photoconvertible белка. Photoactivatible белки также могут быть использованы в FDAP анализах 20-22,26.

Перед выполнением эксперимента FDAP, некоторые аспекты протокола, должны быть оптимизированы. Вводите различное количество мРНК Определить минимальное количество, которое обеспечивает полезной сигнал после фотопреобразования; ~ 50 пг мРНК хорошей отправной количество. Для того, чтобы генерировать значимые на отсеки маски (рис 3), сигнал Alexa488 должен быть достаточно ярким, чтобыконкурировать с сигналом от не-photoconverted слитого белка, который постоянно полученного от введенного мРНК; вводить от 0,2 до 4 нг Alexa488-декстран, чтобы найти оптимальное количество флуоресцентного красителя. Найти оптимальные условия визуализации после преобразования и использовать те же условия для всех экспериментов с данной конструкции. Используйте хорошее количественное изображений практикует 43, и выбрать подходящий динамический диапазон, чтобы избежать насыщенные пиксели в красном канале. Определить соответствующий интервал изображения для каждого слитого белка. Белки с очень коротким периодом полураспада может потребоваться более частое изображений в течение более короткого общего периода времени. Установить оптимальный метод, основанный на фотопреобразования организма и photoconvertible белком, используемым. Опишем одну из надежного метода фотопреобразования с помощью дуговой ртутной лампы в шаге 3.5, но Dendra2 также может быть photoconverted с помощью лазера 27 405 33 или 488 нм.

Один Limitation этого протокола FDAP в том, что избыточная экспрессия интересующего белка требуется. Избыточная экспрессия может повлиять на стабильность белка, например, с помощью аномальной экспрессии других генов, которые модифицируют зазора кинетику белка в 14,44. Если интересующий белок представляет собой молекулу сигнализации, рассмотрим проведения экспериментов в присутствии ингибитора сигнализации, чтобы определить, блокируя экспрессию генов-мишеней ли влияет на стабильность белка. В будущем, это может быть возможным для создания трансгенных эмбрионов, выражающие photoconvertible слияния под контролем эндогенных элементов экспрессии 45-50. Если трансгенные эмбрионы производят достаточное сигнал, FDAP эксперименты в контексте не-суперэкспрессии мыслимы, возможно, с использованием светло-листа микроскопии наблюдаем снижение флуоресценции во всем эмбриона 51.

Возможные дополнительные применения FDAP включают исследования Тха механизмыт регулировать стабильность белка путем изучения влияния различных возмущений (например, выражение предполагаемых протеаз) или белковых модификаций (например, фосфорилирования) на устойчивость. Например, факторы, контролирующие внеклеточный стабильность косоглазия в настоящее время неизвестно. Многие выделяемые сигналы развития усваиваются клетками 52-55, которые могли бы способствовать оформления косоглазия и других лигандов из внеклеточного пространства. FDAP эксперименты, в которых интернализация их может предоставить информацию о механизмах, контролирующих внеклеточный просвет белка.

В отличие от обычных анализов для измерения стабильности белка 15, FDAP предлагает альтернативный микроскопии на основе, в котором зазор белков можно контролировать с течением времени в живых организмах. Подобные методы были использованы для мониторинга зазора белка в модельных системах, отличных от эмбрионов данио рерио 20-23. Протокол Это FDAP имеет потенциал быть адаптированы, чтобы определить период полураспада любого taggable белка в биологических системах, в которых живут изображений является возможным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют никаких конфликтов раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Джеффри Фаррелл, Джеймс Ганьон, и Дженнифер Бергманн замечания по рукописи. KWR при поддержке Национального научного фонда аспирантуру Научно-исследовательского стипендий в процессе разработки анализа FDAP. Эта работа была поддержана грантами от NIH к AFS и за счет субсидий из Немецкого исследовательского фонда (Эмми Нётер Program), Общество Макса Планка, и программа в области пограничной науки (премии развития карьеры) до вечера.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab) Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.
mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit Life Technologies AM1340 To generate capped mRNA for injection into embryos
Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa Life Technologies D34682 Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks
6-well plastic dish BD Falcon Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting
Embryo medium 250 mg/L Instant Ocean salt, 1 mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3
Protease from Streptomyces griseus Sigma P5147 Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage
5 cm diameter glass Petri dish For embryo dechorionation
200 ml glass beaker For embryo dechorionation
Microinjection apparatus For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage
Stereomicroscope For injecting and mounting embryos
1x Danieau's medium Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2
UltraPure low melting point agarose Invitrogen 16520-100 For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau's medium: add 200 mg to 20 ml Danieau's medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 °C, re-melted at 70 °C, and cooled to 40–42 °C when ready to use
Glass Pasteur pipette Kimble Chase (via Fisher) 63A53WT For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos
Metal probe For positioning embryos during mounting
Glass bottom dishes MatTek P35G-1.5-14-C Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5
15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium BD Falcon For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette
Inverted laser scanning confocal microscope A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required
Heated stage To maintain embryos at the optimal temperature of 28 °C during the experiment
Confocal software capable of time-lapse imaging Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals 
25X or 40X water objective Objective for imaging
10X air objective Objective for photoconversion
Immersion oil Immersion oil with the same refractive index as water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  2. Boisvert, F. M., et al. A Quantitative Spatial Proteomics Analysis of Proteome Turnover in Human Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (3), 011429 (2012).
  3. Belle, A., Tanay, A., Bitincka, L., Shamir, R., O'Shea, E. K. Quantification of protein half-lives in the budding yeast proteome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (35), 13004-13009 (2006).
  4. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  5. Parry, D. H., O'Farrell, P. H. The schedule of destruction of three mitotic cyclins can dictate the timing of events during exit from mitosis. Current Biology. 11 (9), 671-683 (2001).
  6. Holloway, S. L., Glotzer, M., King, R. W., Murray, A. W. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. Cell. 73 (7), 1393-1402 (1993).
  7. Dharmasiri, N., Estelle, M. Auxin signaling and regulated protein degradation. Trends Plant Sci. 9 (6), 302-308 (2004).
  8. MacDonald, B. T., Tamai, K., He, X. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Developmental Cell. 17 (1), 9-26 (2009).
  9. Chen, X., et al. Processing and turnover of the Hedgehog protein in the endoplasmic reticulum. The Journal of Cell Biology. 192 (5), 825-838 (2011).
  10. Elmore, S. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  11. Yi, J. J., Ehlers, M. D. Emerging Roles for Ubiquitin and Protein Degradation in Neuronal Function. Pharmacological Reviews. 59 (1), 14-39 (2007).
  12. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  13. Müller, P., Schier, A. F. Extracellular Movement of Signaling Molecules. Developmental Cell. 21 (1), 145-158 (2011).
  14. Eldar, A., Rosin, D., Shilo, B. -Z., Barkai, N. Self-enhanced ligand degradation underlies robustness of morphogen gradients. Developmental Cell. 5 (4), 635-646 (2003).
  15. Zhou, P. Determining protein half-lives. Methods In Molecular Biology. 284, 67-77 (2004).
  16. Woodside, K. H. Effects of cycloheximide on protein degradation and gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochim Biophys Acta. 421 (1), 70-79 (1976).
  17. Schimke, R. T., Doyle, D. Control of enzyme levels in animal tissues. Annual Review of Biochemistry. 39, 929-976 (1970).
  18. Kenney, F. T. Turnover of rat liver tyrosine transaminase: stabilization after inhibition of protein synthesis. Science. 156 (3774), 525-528 (1967).
  19. Müller, P., et al. Differential Diffusivity of Nodal and Lefty Underlies a Reaction-Diffusion Patterning System. Science. 336 (6082), 721-724 (2012).
  20. Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K., Mizuno, K. Measurements of spatiotemporal changes in G-actin concentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. The Journal of Cell Biology. 193 (2), 365-380 (2011).
  21. Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biology. 13 (2), 17-123 (2011).
  22. Drocco, J. A., Grimm, O., Tank, D. W., Wieschaus, E. Measurement and Perturbation of Morphogen Lifetime: Effects on Gradient Shape. Biophys J. 101 (8), 1807-1815 (2011).
  23. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
  24. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 636-668 (2011).
  25. Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
  26. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (11), 885-891 (2005).
  27. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
  28. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  29. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  30. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  31. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), (1995).
  32. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).
  33. Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In Vivo Cell Tracking Using PhOTO Zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1148, 217-228 (2014).
  34. Schier, A. F. Nodal Morphogens). Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a003459-a003459 (2009).
  35. Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans Syst Man Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
  36. Pédelacq, J. -D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 24 (1), 79-88 (2005).
  37. Swulius, M. T., Jensen, G. J. The Helical MreB Cytoskeleton in Escherichia coli MC1000/pLE7 Is an Artifact of the N-Terminal Yellow Fluorescent Protein Tag. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6382-6386 (2012).
  38. Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization. Nature Methods. 9 (5), 480-482 (2012).
  39. Stadler, C., et al. Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation for protein localization in mammalian cells. Nature Methods. 10 (4), 315-323 (2013).
  40. Quattrocchio, F. M., Spelt, C., Koes, R. Transgenes and protein localization: myths and legends. Trends Plant Sci. 18 (9), 473-476 (2013).
  41. Morimoto, Y. V., Kojima, S., Namba, K., Minamino, T. M153R Mutation in a pH-Sensitive Green Fluorescent Protein Stabilizes Its Fusion Proteins. PLoS ONE. 6 (5), e19598 (2011).
  42. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  43. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  44. Moll, U. M., Petrenko, O. The MDM2-p53 interaction. Mol Cancer Res. 1 (14), 1001-1008 (2003).
  45. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  46. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  47. Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-2987 (2013).
  48. Hwang, W. Y., et al. Heritable and Precise Zebrafish Genome Editing Using a CRISPR-Cas System. PLoS ONE. 8 (7), 68708 (2013).
  49. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  50. Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Methods. 10 (4), 329-331 (2013).
  51. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of Zebrafish Early Embryonic Development by Scanned Light Sheet Microscopy. Science. 322 (5904), 1064-1069 (2008).
  52. Blanchet, M. H., et al. Cripto Localizes Nodal at the Limiting Membrane of Early Endosomes. Science Signaling. 1 (45), ra13-ra13 (2008).
  53. Jullien, J., Gurdon, J. Morphogen gradient interpretation by a regulated trafficking step during ligand-receptor transduction. Genes & Development. 19 (22), 2682-2694 (2005).
  54. Incardona, J. P., et al. Receptor-mediated endocytosis of soluble and membrane-tethered Sonic hedgehog by Patched-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (22), 12044-12049 (2000).
  55. Scholpp, S., Brand, M. Endocytosis Controls Spreading and Effective Signaling Range of Fgf8 Protein. Current Biology. 14 (20), 1834-1841 (2004).
  56. Bläßle, A., Müller, P. PyFDAP: Automated analysis of Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP) experiments. Bioinformatics. In Press, forthcoming (2014).

Tags

Биология развития выпуск 95 флуоресцентная упадок после фотопреобразования (FDAP) стабильность белка скорости выведения конфокальной микроскопии photoconvertible белка Dendra2 эмбрион данио
Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, K. W., Bläßle, A., … More

Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP). J. Vis. Exp. (95), e52266, doi:10.3791/52266 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter