Abstract
Immunhistokemi er en meget anvendt teknik til påvisning af tilstedeværelsen, placering og relative forekomst af antigener in situ. Denne indledende niveau protokol beskriver de reagenser, udstyr og teknikker, der kræves for at gennemføre immunhistokemisk farvning af gnavere hjernevæv, hjælp markører for mikroglia og neuronale elementer som et eksempel. Konkret dette papir er en trin-for-trin-protokollen for fluorescerende visualisering af mikroglia og neuroner via immunhistokemi for Iba1 og Pan-neuronal hhv. Fluorescens dobbelt-mærkning er særlig nyttig til lokalisering af flere proteiner i den samme prøve, hvilket giver mulighed for nøjagtigt at observere interaktioner mellem celletyper, receptorer, ligander, og / eller den ekstracellulære matrix i forhold til hinanden såvel som protein co- lokalisering inden for en enkelt celle. I modsætning til andre visualiseringsteknikker, kan fluorescens immunohistokemi farvningsintensitet falde iugerne til måneder efter farvning, medmindre der tages passende forholdsregler. Trods denne begrænsning ved mange anvendelser fluorescens dobbelt-mærkning foretrækkes fremfor alternativer såsom 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) eller alkalisk phosphatase (AP), som fluorescens er mere tid effektivt og giver mulighed for mere præcis differentiering mellem to eller flere markører. Diskussionen omfatter tips og råd til at fremme succes fejlfinding.
Introduction
Immunhistokemi er en proces til påvisning af antigener (dvs. proteiner) i vævssnit ved hjælp af primære antistoffer som binder specifikt til de antigener af interesse. Immunhistokemi blev udviklet af JR Marrack i 1934, da han besluttede at antistoffer kunne lokalisere antigener med stor specificitet 1. Begyndende i 1942, var nogle af de første in vitro undersøgelser med anvendelse af fluorescerende antistoffer til at visualisere immunhistokemi publiceret 2,3, hvorefter den første in vivo histokemisk undersøgelse blev offentliggjort 4. I løbet af 1960'erne, tre årtier efter starten af immunhistokemiske metoder, begyndte enzym-konjugerede antistoffer, der skal anvendes som sekundære reagenser. Disse metoder blev samtidigt og uafhængigt udviklet i Frankrig og USA 5,6. I dag er en bred vifte af antistoffer giver uendelige muligheder for immunhistokemiske undersøgelser 7.
"> Det overordnede mål med denne korrespondance er at give en kort indføring i immunhistokemisk farvning, det er ikke meningen at være en omfattende og udtømmende gennemgang af denne teknik i metoden, er immunhistokemiske teknikker til to antigener præsenteret (markører for microglia og. neuroner) til farvning af paraformaldehyd perfunderet, sucrose kryobeskyttet, cryosectioned rottehjerne. Immunohistokemisk farvning begynder med at blokere ikke-specifik antigenbinding at reducere baggrundsfarvning. Dernæst inkubering med primært antistof tillader binding til et specifikt antigen i vævet. Efter det primære antistof, et andet antistof, betegnet sekundære antistof, der anvendes til at forbinde det primære antistof til et konjugeret visualisering signal 8. Det sekundære antistof rettet mod immunoglobulin G (IgG) domæne specifikke arter, hvor det primære antistof blev rejst. Det sekundære antistof forstærker signalet af det primære antistof, eftersom Fab regioner than sekundært antistof binder til flere steder på IgG-domænet i det primære antistof. Enten enzymer eller fluorescerende molekyler konjugeret til F c regioner af det sekundære antistof aktivere visualisering. For eksempel et kanin-anti-Iba1 primære antistof er et kanin-IgG-molekyle specifikt for Iba1. Når æsel anti-kanin IgG anvendes som et sekundært antistof, vil det genkender og binder til multiple regioner af kanin-anti-Iba1 IgG (se figur 1). Æsel antistof kan visualiseres ved forskellige fremgangsmåder. Denne korrespondance fokuserer på påvisning af en fluorofor konjugeret til det sekundære antistof, der genkender det primære antistof, til visualisering af fluorescerende mikroskopi. I fluorescerende immunhistokemi, kan en nuklear plet såsom Hoechst eller DAPI benyttes til at visualisere alle kerner.
Figur 1: Schematic repræsentation af direkte vs. indirekte antistof-mærkningsteknikker. Antistoffer binder til antigenet af interesse og kan forstærkes ved sekundære antistoffer dannet mod arterne af de primære antistoffer. Denne teknik kan udføres under anvendelse af avidin-biotin-kompleks (ABC) til amplifikation og DAB til visualisering (A) eller et direkte konjugeret fluorescerende sekundært antistof (B). Alternativt kan primære antistoffer direkte konjugeret med mange forskellige mærker, herunder biotin eller en fluorofor (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
En alternativ fremgangsmåde til visualisering af immunhistokemisk farvning anvender 3,3'-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB, se figur 1 og 2). Dette adskiller sig fra fluorescens ved anvendelse af et biotinyleret ellerpeberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundært antistof, som tilvejebringer et enzym til at konvertere DAB til et bundfald, der er synlig under lysfeltmikroskopi. I tilfælde, hvor et enkelt antigen er af interesse eller farvning er forpligtet til at være langtidsholdbare, kan DAB være mere passende end fluorescerende farvning. Imidlertid DAB-farvning er ikke velegnet til differentiering mellem flere markører, især hvis to nukleare antigener er af interesse. For information om DAB materialer og protokol modifikationer, konsultere tabel 1. Alternativt kan nitro blue tetrazolium chlorid / 5-brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT / BCIP) anvendes til at visualisere et alkalisk phosphatase (AP) konjugeret sekundært antistof.
Figur 2:. Repræsentative billeder af nikkel-forstærket DAB single-mærket rotte hjerne vævssnit Rat hjerne SEKTIONER der er mærket med nikkel-forstærket DAB for Iba1 (A) og Pan-neuronal (B) giver mulighed for langvarig analyse af mikroglia eller neuroner alene. Scale bar 20 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Man må overveje den anslåede overflod af antigenet af interesse inde i vævet, der analyseres. Indirekte metoder (som beskrevet ovenfor) er nyttige for mål med lav tæthed. Når antigenet af interesse er i høj overflod, kan påføres direkte metoder. Direkte metoder involverer et primært antistof, der er direkte konjugeret til en visualisering signal, og dermed ingen sekundære antistof er påkrævet. Denne metode forenkler farvningen processen, men eliminerer amplifikation opnås ved indirekte metoder. Ved anvendelse af en direkte konjugeret primært antistof fjerner også krydsreaktivitet af sekundære antistoffernår dobbelt-mærkning.
Denne meddelelse beskriver protokollen for dobbelt-mærkning med Iba1 og Pan-neuronale (detaljer i tabel 1). Iba1 farver mikroglia i mange aktivering stater, herunder forgrenet, hyper-forgrenet, aktiveret, amoeboid og stang. Pan-neuronale pletter neuronal axoner, dendritter, og Soma. Siden Iba1 pletter fleste mikroglia og Pan-neuronale mål neuron, denne kombination af pletter er nyttig i at få en bred forståelse af mikroglia-neuron interaktioner.
Kort sagt immunhistokemisk farvning afhængig af omhyggelig udvælgelse af antistoffer. Som forskningsspørgsmålet bliver mere specifikke, kan antistoffer rejst til alternative antigener ønske. At målrette en specifik mikroglial aktivering tilstand, kan man vælge at anvende CD45 eller CD68-antistoffer, snarere end Iba1. Yderligere, at arbejde med mus, kan F4 / 80 levere de nødvendige resultater. Ligeledes kan neuronale elementer specifikt målrettet med antistoffer raserede mod kernen, synapse (præ- eller post-), axon, og væksten kegle. Derudover er der andre markører, som differentierer alder neuron (Double-cortin, NeuN) og neuronal regenerering (GAP-43).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med den institutionelle Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Arizona. En liste over anbefalede materialer og udstyr kan findes i tabel 1.
1. Vævspræparat
- Perfusion
- Euthanize gnaver med en overdosis af natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP), og perfundere transkardialt med phosphatbufret saltvand (PBS), indtil fuldstændig afblødt (3-5 min) ved en strømningshastighed på 8 ml / min. For dybdegående perfusion instruktioner, se Gage et al 2012 9.
- Umiddelbart efter PBS flush, fix væv ved perfusion med 4% paraformaldehyd i PBS i 15-20 minutter ved en strømningshastighed på 8 ml / min.
- Fjern hjerne og sted i 4% paraformaldehyd i 24 timer, efterfulgt af graduerede sucroseopløsninger (15%, 30%, 30%, i rækkefølge; fremstillet i tris-pufret saltvand) ved 4 ° C. Overfør hjernen til den efterfølgende saccharoseopløsning oun efter hjernen er sunket i hver opløsning. Bemærk: Normalt 5 dage i hver opløsning er tilstrækkelig tid for vævet at synke.
- Tissue Frysning og Cryosectioning
- Placer hjernen i omsluttende medium, såsom OCT-forbindelse og nedsænkes i isopentan ved en temperatur på -35 ° C. Tillad hjernen til at fryse i mindst 10 min, og derefter opbevares ved -80 ° C. Kan opstå, hvis flid til temperatur ikke er taget problemer; se diskussionen for oplysninger om fejlfinding.
- Skåret serielle kranssektioner i en tykkelse på 20 um og en temperatur på -20 ° C. Saml væv på positivt ladede dias. Hjernesnit kan anbringes i en slæde kasse indpakket i folie i en zip-top taske og lagret langsigtet ved -80 ° C. Denne metode til opbevaring skaber en dobbelt grænse for at forhindre udsættelse for luft og frost.
2. Tissue Processing
BEMÆRK: Eksempel udstyr og materialer required til farvning er vist i figur 3. Der findes alternativer, dog vil disse billeder hjælpe de nye til immunhistokemisk farvning for at visualisere passende punkter før du køber.
Figur 3: Eksempler varer til immunhistokemisk farvning Den sorte boks er vist i (A) er et ideelt fugtighedskammer for immunfluorescens, som slides er beskyttet mod lys uden behov for at vikle boks på folie.. Efter sektionering, kan objektglas opbevares i en kasse, såsom den gule boks vist i (B). Indpakning kassen stramt i folie og anbringelse i en zip-top taske før fryseren hjælper med at beskytte de vævsprøver fra frostbrand. Et eksempel på objektglas er givet i (C), med forskellige farvende retter afbildet i (D) og (E (F), dog 1,2 tykke dækglas giver flotte billeddiagnostiske resultater på de fleste opretstående og konfokale mikroskoper. En blyant som vist i (G) kan anvendes til at mærke objektglas. Faste markører bør undgås, da blækket kan løbe, der påvirker både farvning og evnen til at bestemme, hvad prøven er. En mini pap pen som den, der er vist i (H) giver mulighed for en afvisende grænse, der kan drages på dias.
- Forberedelse Slide
- Fjern slides fra fryser og tø ved stuetemperatur.
- Valgfrit: Hvis sektioner tidligere har flød fra dias, sted optøede dias i en ovn ved 60 ° C i mere end 4 timer at hjælpe med at forhindre vævssnit fra flydende off dias.
- Placer dias i et dias rack og tilhørende fad.
- Wash slides tre gange i PBS i 5 minutter hver, skiftende opløsning mellem vaskene. Fra denne skridt fremad, undgå at have sections uden væske i længere tid. Bemærk: Hvis sektioner tørre ud, er baggrundsfarvning øges og kan ikke pålideligt opnås meningsfulde data.
- Fjern slides fra fryser og tø ved stuetemperatur.
- Vævsfarvning
- I et lystæt farvning box, skabe en "fugtighed kammer" med fnugfri væv gennemvædet med deioniseret vand.
- Tør kanterne af objektglasset med en fnugfri væv, bruge en mini pap pen til at lave en væskeafvisende grænsen ved selve kanten af dias, væk fra vævssnit. Denne grænse bør sikre rigelig plads mellem menisken af væsken og kanten af vævet, således at overfladespændingen ikke påvirker farvning.
BEMÆRK: pap pen afvisende grænse kan anvendes før 2.1.3, hvis antistofferne af interesse ikke kræver mikrobølge antigen hentning. Hvis pap pen er blevet anvendt før vask i PBS, skal integriteten af væskeskyende grænse kontrolleres på dette trin. Brug et mini-pap pen til at udfylde eventuelle huller i grænsen. - Brug serum fra den samme art, hvor sekundære antistof fremstillet. Bemærk: I denne procedure er de sekundære antistoffer fremstillet i æsel, og dermed æsel serum anvendes. Hvis der anvendes sekundære antistoffer fra to eller flere forskellige arter, omfatter serum fra hver art.
- Pipette primært antistof på dias. Bemærk: Antistofkoncentrationer til denne farvning er blevet optimeret ved 1: 5.000 og 1: 500 for Iba1 og Pan-neuronal hhv. Disse koncentrationer har vist sig at vise meningsfuld farvning med et fravær af baggrundsfarvning.
- Blok opløsning for at fortynde1% serum i PBS og tilføj primære antistoffer. Pipette 300 pi primært antistof løsning i 1% serum pr dias. Igen sikrer fluidet er til kanten af pap pen. Der inkuberes natten over ved 4 ° C.
- Omfatter tre kontrolglas: en, der indeholder hverken Iba1 eller pan-neuronale antistoffer, det ene med Iba1 uden Pan-neuronal antistof, og et med pan-neuronal antistof uden Iba1. Farv disse slides i samme kørsel med de samme opløsninger, men udelade de primære antistoffer til at teste ikke-specifik binding af de sekundære antistoffer.
- Den følgende morgen, vask glider tre gange i PBS i 5 minutter hver, skiftende opløsning mellem vaskene.
- Fluorescerende antistoffer er lysfølsomme derfor fra dette trin fremad, minimere lyseksponering ved at sikre vask beholdere er pakket ind i folie og hybridiseringsbetingelser bokse er enten sort eller inkuberes i mørke. Pipettere passende sekundære antistoffer på alle objektglas og inkuberes i60 minutter ved stuetemperatur i en koncentration på 1: 250 i blok-opløsning (se trin 2.2.3) i en lystæt "fugtighedskammer" (se trin 2.2.1).
- Bruge sekundære antistoffer af forskellige bølgelængder. Her, for det primære antistof kanin anti-Iba1 bruge æsel anti kanin 594 som passende sekundære antistof. For det primære antistof muse-anti-pan-neuronal, brug æsel-anti-muse 488 som passende sekundært antistof. Alternativt bruge anti-kanin 488 og anti-muse 594.
- Wash slides tre gange i PBS i 5 minutter hver.
- Valgfrit: udføre nukleare farvning.
- Sted i Hoechst (eller anden nuklear farvning) ved en koncentration på 0,03 ug / ml i dobbelt destilleret H 2 0 i nøjagtigt 60 sek.
- Wash slides tre gange i PBS i 5 minutter hver.
- Vask i Hedeselskabet 2 0.
- Dækglasset dias med et vandigt monteringsmedium såsom Fluoromount-G eller ProlongGold. Sørge for at fjerne alle boblerne ved hjælp af en bomuld spids applikator.
Bemærk: Andre montering midler kunne bruges, har dog høj gennemblødning mellem farvestoffer blevet bemærket af nogle inden for få dage dækglas. - Anvende klare neglelak til at forsegle kanterne, hvilket forhindrer afsnittene tørrer ud på grund af fordampning. Tillad neglelak til tørre i en lystæt beholder, mens objektglas forblive flad og ved stuetemperatur, og derefter opbevares i en lystæt beholder indpakket i folie ved 4 ° C.
3. Imaging af Stained Tissue
- Mikroskopi
- Tillad neglelak til at tørre i mindst en time, før de påbegynder mikroskopi, som bør finde sted i et mørklagt rum.
- Erhverve mikrofotografier bruger konfokal eller forskning mikroskop med en fluorescerende lyskilde og et digitalt kamera vedhæftet fil. Ved hjælp af medfølgende software, indstille eksponeringen for hver bølgelængde - 405, 488, og 594 - separat. Bemærk: dybdegående billeddiagnostiske instruktioner bør være tilgængelige online fra mikroskopet producenten.
- Anskaf mikrofotografier i hver kanal uden at flytte sektionerne eller justering af fokus. Tag billeder i farver, eller alternativt i gråtoner og konvertere til at farve bagefter.
Bemærk: Farve eller gråtonebilleder fra hver kanal kan samles i efterbehandling. - Sikre, at vævssnit ikke udsættes for omgivende lys eller mikroskopisk lys i længere tid, som foto-blegning af sektionerne vil forekomme. For at undgå dette, øge eksponeringen tid snarere end at øge lys / laser intensitet.
- Sluk ikke for fluorescerende lyskilde inden for 30 min for at blive tændt.
Bemærk: Skift af kilden til og fra i hurtig rækkefølge kan nedsætte levetiden for den fluorescerende pære.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne farvningsprotokol resulterer i rottehjerne vævssnit, der mikroglia fluorescensmærkede i 594 kanal (rød) og neuroner mærket i 488 kanal (grøn, se figur 4). Hvis en nuklear pletten er blevet gjort, vil det vise i 405 kanal (blå). Billeder kan tages på forskellige kanaler og overlejret til direkte sammenligning af de tre kanaler, eller mellem to kanaler. Mange digitale erhvervelse softwarepakker omfatter denne funktionalitet. Dobbelt-mærkning med Iba1 og Pan-neuronal markør er vist her demonstrerer meste forgrenet mikroglia, med lange fine neuronale projektioner tydelige tværs kortikale lag.
Figur 4:. Repræsentative konfokale fluorescerende billeder af Iba-1 / Pan-neuronal dobbelt-mærkning Kolonne 1 viser microglia farvet med Iba1 (rød). Neuroner er vist ianden kolonne i grøn, med overlejret billede af både røde og grønne kanaler i den tredje kolonne. I den første række, er der en fuldstændig mangel på specifik farvning på grund af fravær af begge primære antistoffer. Den anden række viser specificitet Pan-neuronal primære antistof for neuronal farvning, mens den tredje række viser specificitet Iba1 for mikroglia, med en total mangel på krydsreaktivitet i begge tilfælde. Den fjerde række viser dobbelt-mærkning med en overlejring af de to kanaler, der viser både mikroglial og neuronal farvning. Scale bar 50 pm.
Dårlige farvningsresultater er også vist (figur 5), som påvist ved mangel på klart definerede cellelegemer og fragmenterede microgliale / neuronale processer. Høj baggrund indikerer dårlig kvalitet farvning, og kan ses ved ikke-specifik co-lokalisering af antistoffer (se figur 5). Desuden, hvis signalet er svagt, et amplifikationstrin med fluorescens bundet streptavidin kan indarbejdes. Stedet for at bruge en direkte mærket fluorescerende sekundært antistof i trin 2.2.6, er et biotinyleret sekundært anvendt. Efter vask i PBS, streptavidin: er (1 1000 i PBS) inkuberes på objektglassene i 1 time. Retur til protokol i trin 2.2.7, hvor dias vaskes derefter og dyppet i en kontrastfarve eller dække gled.
Figur 5:. Repræsentative fluorescerende billeder af dårlig kvalitet væv Vist her er et eksempel på farvning i dårlig væv, der resulterer i en mangel på klarhed i mikroglial farvning (a) og fuldstændig mangel på neuronal farvning (b). Denne neuronale farvningen er simpelthen høj baggrund. Det overlejret billede (c), ikke giver mening.
| Navn på Material / Udstyr | Firma | Catalog Number | Kommentarer / Beskrivelse |
| Fisherbrand SuperFrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Anvendes til væv montering (1.2.2) |
| Ovn | Thermo Scientific | 51028112 | Bruges til væv tørring (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Anvendt i trin 2.2.2 |
| Andwin Videnskabelig Tissue-tek Slide Farvning Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Anvendes til alle vaskninger under farvning (2.2), samt Hoechst trin (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Anvendes til tørring slides (2.2) |
| Sort Farvning Box | Ted Pella | 21050 | Bruges til blokering og farvning trin (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Anvendes til blok og antistof inkubation (2.2) |
| Muse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Anvendes til primært antistof (2.2.4) |
| Kanin α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Anvendes til primært antistof (2.2.4) |
| Donkey α-kanin 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Bruges til sekundært antistof (2.2.6) |
| Æsel α-mus 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Bruges til sekundært antistof (2.2.6) |
| Catering er folie | Nogen | N / A | Bruges i trin 1.2.2 og 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Bruges til dækglas (2.2.8) |
| Dækglas | Fisher Scientific | 12544E | Bruges til dækglas (2.2.8) |
| Klar neglelak | Nogen | N / A | Bruges til dækglas (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 og LSM 710 (laserscanning, konfokal) | Carl Zeiss | N / A | Bruges til billeddannelse (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Bruges til billeddannelse (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB-protokol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB-protokol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB-protokol |
| Biotinyleret heste α-kanin-IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB-protokol |
| Biotinyleret heste α-muse-IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB-protokol |
| 30% Hydrogenperoxid | FisherScientific | H325-500 | For DAB-protokol |
| Wheaton slide stativer og farvning retter | TedPella | 21.043 | For DAB-protokol |
| Masterflex perfusion pumpe og slanger | Cole-Parmer | Bruges til perfusion (1.1.1 og 1.1.2) | |
| Andwin videnskabelig væv-tek CRYO-Oktober forbindelse (tilfælde af 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Bruges til væv frysning (1.2.1) |
| Termometer (-50 til 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Bruges til væv frysning (1.2.1) |
| Kryostat | Leica | CM3500S | Bruges til væv sektionering (1.2.2) |
| Farvning Dish, Plastic med 2 Låg | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Farvning Rack, Slides Vandret | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Mikroovn | Nogen | N / A | For antigen retrival |
Tabel 1: Materialer List.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det overordnede mål med denne meddelelse var at indføre immunhistokemi procedurer til læseren. For dette, at eksemplet med dobbelt-mærkning med Iba1 og Pan-neuronale antigener observere mikroglia og neuroner i paraformaldehyd perfunderet, blev saccharose kryobeskyttet, cryosectioned rottehjerne brugt.
Denne teknik kan tilpasses til at tjene endeløse formål. En række forskellige antigener i en række forskellige vævstyper, såsom, men ikke begrænset til hjerne, lunge, lever, nyre og tarm kan visualiseres immunhistokemisk med mindre justeringer af protokollen. Immunhistokemi giver mulighed for direkte sammenligning af flere markører og kan omfatte op til fire forskellige antistoffer i en enkelt prøve. Antallet af antistoffer anvendt i en prøve er begrænset af gennemblødning, som beskriver overlapning af fluorescerende bølgelængder. Der er et begrænset fluorescerende lysspektrum, som derfor begrænser farvningsresultaterne kombinationer inden for såIngle prøve (se figur 6).
Når dobbelt-mærkning, er det bedst at vælge primære antistoffer fremstillet i forskellige arter, som begge antistoffer kan anvendes samtidigt. Dobbelt-mærkning med to antistoffer fra den samme art er mulig, selv om de teknisk vanskelig. Når begge primære antistoffer er lavet i samme art, skal farvning udføres sekventielt, ved at udfylde farvning for et antigen før det andet. Færre problemer vil opstå, hvis de primære antistoffer fra samme art har forskellige Ig klasser (dvs. muse IgG og muse IgM eller forskellige underklasser IgG1 og IgG2a). For flere detaljer konsultere yderligere referencer 10,11. Denne protokol anvender kanin-anti-Iba1 og muse-anti-pan-neuronal. Det er også nødvendigt at medtage passende negative kontroller. For dobbelt-mærkning med Iba1 og Pan-neuronal, ét dias indeholder ingen primære antistoffer, ét dias indeholder anti-Iba1 kun og ét dias indeholder kun anti-Pan-neuronal (se figur 4). Disse negative kontroller bekræfter et fravær af krydsreaktivitet og falsk farvning. Alle andre dias indeholder både primære antistoffer. Det er også vigtigt at undgå at bruge sekundære antistoffer, som kan krydsreagere. For eksempel ved anvendelse af æsel-anti-kanin 594 og kanin-anti-muse 488 ville resultere i æsel-anti-kanin 594 binder til både kanin-anti-Iba1 primært antistof og æsel-anti-kanin 594 anti-muse 488 sekundært antistof. Dette ville skabe falsk co-mærkning. Antistoffer for et bestemt protein (antigen) er ikke altid den samme. For eksempel er nogle antistoffer mod antigener, som er til stede i frosset væv, mens andre vil genkende et antigen, der er blevet ændret i løbet af paraffinindlejring processen. Derfor bør der lægges særlig vægt til than antistof typeblad forud for køb. Hvis den tilsigtede anvendelse for antistoffet ikke er angivet, kan det være nødvendigt fejlfinding for at få farvning eller farvning kan ikke arbejde på alle. Desuden kan tidligere offentliggjorte data tilbyder "tricks af handelen" at opnå farvning. Af betydning at bemærke, er, at fine forskelle kan ses i forskellige batcher af antistoffer; muligvis ske med hver omgruppere af et antistof små modifikationer. De fleste antistoffer er gode for 12 måneder fra datoen for modtagelsen. Sørg for at angive ankomst på produktet specifikation ark. Hvis antistoffarvning ikke overholdes, kan antistoffet være for gammel eller opbevares forkert. Det er derfor også vigtigt at kontrollere hvert antistof specifikationer ark for korrekt opbevaring. Derudover, for mange antistoffer, fås forskellige kloner. Forskellige kloner genkender forskellige dele af antigenet af interesse. Engiven klon kan være bedre for væv udsættes for forskellige behandlingsteknikker (voks-embedded / frosne), målrette vævstype eller målarter. Vær særlig opmærksom på de arter, hvor antistoffet blev rejst. Når antistoffet er rejst i den samme art som vævet til analyse, kan observeres høj baggrund. For at bekæmpe dette, yderligere blokering med kommercielt tilgængelige kits, såsom en mus på mus kit, kan være nødvendig for farvning. Denne teknik kan også tilpasses til cellekultur. Fiksering af celler, klon og specificitet skal kontrolleres på specifikationen ark til applikationer. Fiksering med paraformaldehyd tværbinder proteiner, som kunne skjule antigenbindingssteder i visse betingelser. Antigengenfinding kan bryde protein-tværbindinger og eksponere bindingssteder. Hvis antigen hentning er påkrævet, skal du indsætte følgende protokol efter trin 2.1.3: ved hjælp af en plastik farvning skål og sæt (se tabel 1), mikroovn diasi citratbuffer på en lav effekt indstilling i 10 minutter, idet man ikke lade løsningen kog strengt (specifikke effektniveauer ikke inkluderet på grund af variation i indstillingerne mellem mikrobølger). Alternativt bringe citratpuffer til 80 ° C i et glas farvning skålen i en ovn, tilsæt derefter objektglas i 10 minutter. Dårlig væv kvalitet kan også give problemer med farvning (se figur 5). Der er en række forholdsregler man kan tage for at undgå at kompromittere væv kvalitet. Først være tålmodig og flittig med saccharose ændringer for at grundigt fortrænge vand i vævet, før frysning. Ved indfrysning, holde temperaturen konstant. Hvis vævet fryser for langsomt, vil vandmolekylerne ekspandere som de fryser, skaber huller i vævet. Alternativt vil frysning ved for lav temperatur forårsage vævet til at revne. Protokoller vil variere en smule for hvert antistof af interesse. Ved modtagelse af en ny antistof, skal man vælgeimize protokollen i overensstemmelse hermed. Hvis baggrunden er høj (figur 5), prøve blokering i en længere periode. Alternativt, øge serumkoncentrationen af blokken opløsning eller tilføje serum fra flere forskellige arter fx ged og kaninserum. Derudover kan kasein anvendes til at reducere ikke-specifik binding. Skummetmælk (fremstillet af tørt pulver) indeholder kasein og kan anvendes i en række koncentrationer (typisk 1-5% vægt / volumen). Mælk kan anvendes alene, eller sammen med serum. Hvis et antigen af interesse er en intracellulær markør, kan detergenter, på TritonX-100 eller Tween-20 tilsættes til blokeringsopløsningen at permeabilisere cellemembraner. Tykkere vævssnit kan behandles på samme måde af flydende vævssnit i brønde i stedet for at montere dem på objektglas. Paraffinindlejret væv kan også behandles på lignende måde, men kræver en de-voksning trin forud for blokering. Feldengut et al. 12 adresser både af disse metoder. En anden faktor at tage i betragtning med DAB-farvning er, at cellerne over flere lag af væv. Det er derfor vanskeligt at opnå klare billeder af celler, såsom microglia, der har udspændende processer. For at overvinde dette problem, nogle forskere skære deres sektioner tyndere ved 8-12 um. Billeddannelse af fluorescensmærket væv opnås bedst på et konfokalt mikroskop. Konfokale mikroskoper fjerne dis normalt ses med en forskning fluorescerende mikroskop ved at isolere og erobre en enkelt plan fokus inden prøven. Med konfokal mikroskopi, finere detaljer er skarpere og bløder-through mellem fluorescerende farvestoffer reduceres. Tykkere prøver kan afbildes et plan ad gangen (z-stak) at påvise ægte co-lokalisering. Når adgangen til et konfokalt mikroskop ikke er tilgængelig, billedbehandling på en forskning mikroskop er dog muligt eksponeringstid og lysintensitet skal være locKED mellem billeder. 
Figur 6:. Farve spektrum diagram Hver fluorophor udsender en bestemt bølgelængde af lys, når ophidset af en bestemt laser eller filter. For effektivt at producere multi-mærket væv, bør der være minimal overlapning mellem specifikke fluoroforer konjugeret til antistofferne. Selv om der er mindst 10 forskellige fluoroforer er tilgængelige på markedet, er det ikke muligt at opnå klare resultater, hvis alle 10 anvendes. For eksempel ville triple-mærkning med bølgelængde emissioner ved 405, 488 og 594 (A) giver tydelig mærkning, som der er minimal overlapning eventuelle mellem disse bølgelængder. Men hvis der blev brugt bølgelængde emissioner ved 488, 514 og 555, farvningen ikke ville blive let tolkes som hvert antistof kan ophidset af laseren eller et filter beregnet til den anden (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R.
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
