Abstract
Immunohistochemie is een veel gebruikte techniek om de aanwezigheid, locatie en relatieve overvloed van antigenen in situ. Deze inleidende niveau protocol beschrijft de reagentia, apparatuur en technieken die nodig zijn voor immunohistochemische kleuring van knaagdieren hersenweefsel te voltooien, met behulp van markers voor microglia en neuronale elementen als een voorbeeld. Concreet dit document is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie visualisatie van microglia en neuronen via immunohistochemie voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Fluorescentie double-labeling is bijzonder bruikbaar voor de lokalisatie van meerdere eiwitten in hetzelfde monster, de mogelijkheid ontstaat om interacties tussen celsoorten, receptoren, liganden nauwkeurig observeren, en / of de extracellulaire matrix ten opzichte van elkaar en proteïne co- lokalisatie binnen een enkele cel. In tegenstelling tot andere visualisatietechnieken, kan fluorescentie immunohistochemie kleurintensiteit afnamede weken tot maanden na vlekken, tenzij passende voorzorgsmaatregelen worden genomen. Ondanks deze beperking in vele toepassingen fluorescentie double-labeling heeft de voorkeur boven alternatieven zoals 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) of alkalisch fosfatase (AP), zoals fluorescentie tijdsefficiënter en maakt een zeer nauwkeurige onderscheiden van twee of meer markers. De discussie omvat tips voor probleemoplossing en advies om het succes te bevorderen.
Introduction
Immunohistochemie is een werkwijze voor het detecteren van antigenen (bijvoorbeeld eiwitten) in weefselsecties met primaire antilichamen die specifiek binden aan de antigenen van interesse. Immunohistochemie werd ontwikkeld door JR Marrack in 1934, toen hij bepaald dat antilichamen antigenen met grote specificiteit 1 kon lokaliseren. Beginnend in 1942, enkele eerste in vitro studies met fluorescerende antilichamen tegen immunohistochemie visualiseren gepubliceerd 2,3, waarna de eerste in vivo histochemische studie werd gepubliceerd 4. Gedurende de 1960's, dertig jaar na de start van immunohistochemische werkwijzen, begon enzym-geconjugeerde antilichamen voor gebruik als secundaire reagentia. Deze methoden werden gelijktijdig en onafhankelijk van elkaar ontwikkeld in Frankrijk en de VS 5,6. Vandaag de dag, een breed scala van antilichamen biedt eindeloze mogelijkheden voor immunohistochemie studies 7.
"> De algemene doelstelling van deze correspondentie is om een korte introductie in immunohistochemische kleuring zorgen, het is niet bedoeld om een uitgebreid en uitputtend overzicht van deze techniek in de geschetste methode worden immunohistochemische technieken voor twee antigenen gepresenteerd (markers voor microglia en. neuronen) voor kleuring paraformaldehyd geperfundeerde, sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen. Immunohistochemische kleuring begint blokkeermiddelen-specifieke antigeenbinding aan achtergrondkleuring te verminderen. Vervolgens incubatie met primair antilichaam zorgt voor binding aan een specifiek antigeen in het weefsel. Na het primaire antilichaam, een ander antilichaam, genaamd secundaire antilichaam wordt aan het primaire antilichaam te koppelen aan een geconjugeerd visualisatie signaal 8. Het tweede antilichaam is gericht op de immunoglobuline G (IgG) domein specifiek voor de diersoorten waarin de eerste antistof opgewekt werd. Het tweede antilichaam versterkt het signaal van het primaire antilichaam, aangezien de Fab-regio van tHij secundair antilichaam binden aan meerdere plaatsen op het IgG gebied van het primaire antilichaam. Enzymen of fluorescente moleculen geconjugeerd met de Fc-regio van het secundaire antilichaam mogelijk visualisatie. Bijvoorbeeld, een konijn anti-Iba1 primair antilichaam een konijn IgG-molecuul specifiek voor Iba1. Wanneer ezel anti-konijn IgG gebruikt als een secundair antilichaam, zal herkennen en binden aan meerdere gebieden van het konijn anti-Iba1 IgG (zie figuur 1). De ezel antilichaam kan worden gevisualiseerd door verschillende werkwijzen. Deze overeenstemming is gericht op de detectie van een fluorofoor geconjugeerd aan het tweede antilichaam, waarbij het primaire antilichaam herkent, voor visualisatie door fluorescentiemicroscopie. In fluorescerende immunohistochemie kan een nucleaire kleuring zoals Hoechst en DAPI worden gebruikt om alle kernen te visualiseren.
Figuur 1: SchEmatic representatie direct- en indirect antilichaam labeling technieken. Antilichamen binden aan het antigeen van belang en kan worden geamplificeerd door secundaire antilichamen opgewekt tegen de species van het primaire antilichamen. Deze techniek kan worden uitgevoerd met avidine-biotine complex (ABC) voor amplificatie en DAB visualisatie (A), of direct fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam (B). Als alternatief kunnen primaire antilichamen direct worden geconjugeerd met veel verschillende labels, waaronder biotine of een fluorofoor (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een alternatieve werkwijze voor het zichtbaar maken van immunohistochemische kleuring gebruikt 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; zie figuren 1 en 2). Dit verschilt van fluorescentie met behulp van een gebiotinyleerd ofhorse-radish peroxidase (HRP) geconjugeerd secundair antilichaam, dat een enzym DAB zetten naar een precipitaat dat zichtbaar is onder helderveld microscopie levert. In gevallen waarin een enkele antigeen is van belang of kleuring is verplicht langdurig te zijn, kan DAB beter geschikt zijn dan fluorescerende vlekken zijn. Echter, DAB-kleuring is niet goed geschikt voor differentiatie tussen meerdere markers, met name als twee nucleaire antigenen van belang. Voor informatie over DAB materialen en protocol modificaties raadplegen Tabel 1. Anders, nitro blauw tetrazolium chloride / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) kan worden gebruikt om een alkalische fosfatase (AP) geconjugeerd secundair visualiseren antilichaam.
Figuur 2:. Vertegenwoordiger beelden van nikkel verbeterde DAB single-gelabeld rat hersenweefsel secties Rat hersenen seCTIES die zijn gelabeld met nikkel verbeterde DAB voor Iba1 (A) en Pan-neuronale (B) zorgen voor langdurige analyse van microglia of neuronen alleen. Schaalbalk 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Men moet rekening houden met de geraamde omvang van het antigeen van belang in het weefsel dat wordt onderzocht. Indirecte werkwijzen (zoals hierboven beschreven) zijn nuttig voor doelen met lage abundantie. Wanneer het antigeen van interesse is in hoge overvloed, kan directe methoden worden toegepast. Direct werkwijzen omvatten een primair antilichaam dat rechtstreeks is geconjugeerd aan een visualisatie signaal en dus geen secundair antilichaam nodig. Deze werkwijze vereenvoudigt het kleurproces, maar elimineert de versterking bereikt met indirecte methoden. Met behulp van een direct geconjugeerd primair antilichaam elimineert ook cross-reactiviteit van secundaire antilichamenals dubbel-labeling.
Deze mededeling beschrijft de protocol voor double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale (details in tabel 1). Iba1 vlekken microglia in veel activering staten, waaronder vertakte, hyper-vertakte, geactiveerde, amoeboid en staaf. Pan-neuronale vlekken neuronale axonen, dendrieten, en soma. Aangezien Iba1 vlekken meest microglia en Pan-neuronale targets het neuron, deze combinatie van vlekken is nuttig bij het verkrijgen van een breed begrip van microglia-neuron interacties.
Kortom, immunohistochemische kleuring voert de zorgvuldige selectie van antilichamen. Aangezien de vraagstelling wordt specifieker kunnen antilichamen opgewekt alternatieve antigenen wensen. Om een specifieke microgliale activeringstoestand richten, kan men kiezen om CD45 of CD68 antilichamen, in plaats van Iba1. Verder, in samenwerking met muizen, F4 / 80 kan de benodigde resultaten. Op dezelfde manier kan neuronale elementen specifiek worden gericht met antilichamen raseerde tegen de kern, synaps (pre- of post-), axon, en de groei kegel. Daarnaast zijn er andere merkers die de leeftijd van het neuron (Double-Cortin, NeuN) differentiëren en neuronale regeneratie (GAP-43).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van de Universiteit van Arizona uitgevoerd. Een lijst met aanbevolen materialen en apparatuur zijn te vinden in tabel 1.
1. Tissue Voorbereiding
- Perfusie
- Euthanaseren knaagdier met een overdosis van natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP) en perfuseren transcardially met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot volledig bloed ontdaan (3-5 min) bij een stroomsnelheid van 8 ml / min. Voor diepgaande perfusie instructies, zie Gage et al 2012 9.
- Onmiddellijk na PBS flush, vast weefsel door perfuseren met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15-20 min bij een stroomsnelheid van 8 ml / min.
- Verwijder hersenen en plaats in 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, gevolgd door gegradeerde sucrose-oplossingen (15%, 30%, 30%, in volgorde, bereid in Tris gebufferde zoutoplossing) bij 4 ° C. Breng de hersenen naar de volgende sucroseoplossing olleen nadat het brein is gezonken in elke oplossing. Opmerking: Meestal, 5 dagen in elke oplossing is voldoende tijd voor tissue te zinken.
- Tissue Invriezen en cryosectioning
- Plaats de hersenen in inbeddingsmedium, zoals oktober verbinding en onder in isopentaan bij een temperatuur van -35 ° C. Laat de hersenen te bevriezen gedurende minimaal 10 minuten en bewaar bij -80 ° C. Problemen kunnen ontstaan als ijver om de temperatuur niet wordt genomen; zie bespreking voor informatie over probleemoplossing.
- Knip seriële coronale secties met een dikte van 20 urn en een temperatuur van -20 ° C. Verzamel weefsel op positief geladen dia's. Brain secties kunnen in een dia doos verpakt in folie in een zip-top zak en opgeslagen op lange termijn bij -80 ° C worden geplaatst. Deze opslagmethode maakt een dubbele grens tot blootstelling aan lucht of bevriest.
2. Tissue Processing
OPMERKING: Voorbeeld apparatuur en materialen rerplicht voor het kleuren worden weergegeven in figuur 3. Alternatieven zijn beschikbaar, echter, zullen deze beelden helpen die nieuw voor immunohistochemische kleuring om passende items visualiseren voorafgaand aan het kopen.
Figuur 3: Voorbeeld goederen voor immunohistochemische kleuring The black box is getoond in (A) is een ideaal vochtige kamer voor immunofluorescentie zoals slides worden beschermd tegen licht zonder dat de box wikkelen op folie.. Na snijden kan schuiven in een doos worden opgeslagen, zoals de gele vakje getoond in (B). Het verpakken van de doos stevig in folie en plaatsing in een zip-top zak voorafgaand aan de vriezer beschermt de weefselmonsters van vriesbrand. Een voorbeeld dia wordt in (C), met verschillende kleuring schotels weergegeven in (D) en (E (F), maar 1,2 dikke coverslips bieden leuke imaging resultaten op de meeste rechtop en confocale microscopen. Een potlood zoals getoond in (G) kan worden gebruikt om objectglaasjes te labelen. Permanente markers moet vermeden worden omdat de inkt kan draaien, die zowel kleuring en de mogelijkheid om te bepalen welke monster. Een mini pap pen zoals getoond in (H) maakt een afweermiddel grens ook op objectglaasjes.
- Slide voorbereiding
- Verwijder dia's uit vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
- Optioneel: Indien delen eerder gedreven van objectglaasjes, objectglaasjes plaats ontdooid in een oven bij 60 ° C gedurende maximaal 4 uur om te voorkomen weefselsecties drijven af glijdt.
- Plaats de glaasjes in een dia rack en de bijbehorende schotel.
- Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten. Vanaf deze stap voorwaarts, voorkomen dat sections zonder vloeistof voor langere tijd. Opmerking: Indien delen uitdrogen, wordt achtergrond kleuring verhoogd en betekenisvolle data betrouwbaar kan niet worden verkregen.
- Verwijder dia's uit vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur.
- Weefselkleuring
- In een lichtdichte vlekken doos, een "vochtige kamer" met een niet-pluizende weefsels doordrenkt met gedemineraliseerd water.
- Droog de randen van de dia met een niet-pluizende tissue, gebruik maken van een mini pap pen om een vloeistof afstotend grens te maken aan de rand van de dia, weg van weefsel secties. Deze grens moet zorgen voldoende ruimte tussen de meniscus van de vloeistof en de rand van het weefsel, zodat oppervlaktespanning heeft geen invloed op kleuring.
OPMERKING: De pap pen afweermiddel grens kan worden toegepast voorafgaand aan 2.1.3 als de antilichamen van belang niet magnetron antigen herstel vereisen. Als de pap pen is voorafgaand toegepast op wassen in PBS, moet de integriteit van de vloeistof afstotende grens bij deze stap gecontroleerd. Gebruik een mini-pap pen in de openingen in de border te vullen. - Met serum van dezelfde soort waarin secundaire antilichaam wordt gemaakt. Opmerking: In deze procedure worden de secundaire antilichamen in ezel, en dus donkey serum wordt gebruikt. Als secundaire antilichamen uit twee of meer verschillende soorten worden gebruikt, omvatten serum van elke soort.
- Pipette primaire antilichaam op dia's. Opmerking: Antilichaamconcentraties hiervoor kleuring werden geoptimaliseerd bij 1: 5000 en 1: 500 voor Iba1 en Pan-neuronale resp. Deze concentraties zijn als zinvolle kleuring vertonen met een afwezigheid van achtergrondkleuring.
- Verdunnen blok oplossing voor1% serum in PBS en voeg primaire antilichamen. Pipetteer 300 ul van primair antilichaam oplossing in 1% serum per slide. Ook hier zorgen de vloeistof aan de rand van de pap pen. Incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Omvatten drie controle dia's: één dat noch Iba1 noch Pan-neuronale antistoffen bevat, een met Iba1 zonder Pan-neuronale antilichaam, en één met Pan-neuronale antilichaam zonder Iba1. Vlekken op deze slides in dezelfde run met hetzelfde oplossingen evenwel laat de primaire antilichamen tegen het niet-specifieke binding van de secundaire antilichamen te testen.
- De volgende ochtend was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk, veranderende oplossing tussen wasbeurten.
- TL-antilichamen zijn lichtgevoelig, dus uit deze stap voorwaarts, het minimaliseren van de blootstelling aan licht door te zorgen voor wassen containers zijn verpakt in folie en hybridisatie dozen zijn zwart of in het donker geïncubeerd. Pipet de juiste secundaire antilichamen op alle dia's en incubeer60 min bij kamertemperatuur bij een concentratie van 1: 250 in blokkeeroplossing (zie stap 2.2.3) in een lichtdichte "vochtkamer" (zie stap 2.2.1).
- Gebruik secundaire antilichamen van verschillende golflengten. Hier, voor het primaire antilichaam konijn anti-Iba1 Gebruik ezel anti- konijn 594 als het geschikte secundaire antilichaam. Voor het primaire antilichaam muizen anti-Pan-neuronale Gebruik ezel-anti-muizen-488 als het geschikte secundaire antilichaam. Anders, gebruik anti-konijnen 488 en anti-muis 594.
- Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Optioneel: het uitvoeren van nucleaire kleuring.
- Plaats Hoechst (of andere nucleaire kleuring) bij een concentratie van 0,03 ug / ml in dubbel gedestilleerd H 2 0 gedurende precies 60 sec.
- Was glijdt driemaal in PBS gedurende 5 minuten elk.
- Was in DDH 2 0.
- Coverslip slides met een waterig fixeermiddel zoals Fluoromount-G of ProlongGold. Zorg ervoor dat alle bellen met behulp van een wattenstaafje verwijderen.
Opmerking: Overige montage stoffen kunnen worden gebruikt, heeft echter een hoge doorbloeding tussen kleurstoffen is opgemerkt door enkele binnen enkele dagen van afdekken. - Gebruik heldere nagellak om de randen af te dichten, waardoor de secties uitdroogt door verdamping. Laat nagellak te drogen in een lichtdichte container terwijl dia's plat en bij kamertemperatuur blijven en vervolgens opslaan in een lichtdichte container verpakt in folie bij 4 ° C.
3. Beeldvorming de Stained Tissue
- Microscopie
- Laat de nagellak te drogen voor ten minste een uur voor aanvang van de microscopie, die moet plaatsvinden in een verduisterde kamer.
- Verwerven microfoto met behulp van een confocale microscoop of onderzoek met een fluorescerende lichtbron en een digitale camera bevestiging. Met behulp van de bijbehorende software, stellen de belichting voor elke golflengte - 405, 488, en 594 - afzonderlijk. Let op: diepte-imaging instructies online beschikbaar via de microscoop fabrikant moet zijn.
- Acquire microscoopfoto in elk kanaal zonder te bewegen de afdelingen of het aanpassen van de focus. Neem beelden in kleur, of afwisselend in grijstinten en converteren naar daarna te kleuren.
Opmerking: Kleur of grijswaarden beelden van elk kanaal kan worden verzameld in post-processing. - Controleer of weefselcoupes worden niet blootgesteld aan omgevingslicht of microscopische licht voor langere tijd, als foto-bleking van de secties optreedt. Om dit te voorkomen, verhogen de blootstelling tijd in plaats van het verhogen van het licht / laser intensiteit.
- Laat de fluorescerende lichtbron niet binnen 30 minuten worden ingeschakeld uit te schakelen.
Opmerking: Het schakelen van de bron aan en uit in snelle opeenvolging kan de levensduur van de tl-lamp te verlagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit kleuringsprotocol resultaten in ratten hersenweefsel secties die microglia fluorescent zijn gelabeld in de 594-kanaal (rood) en neuronen geëtiketteerd in de 488-kanaal (groen; zie figuur 4). Als een nucleaire vlek werd geschreven, zal laten zien in het kanaal 405 (blauw). Afbeeldingen kunnen worden genomen in verschillende kanalen en bedekt voor directe vergelijking van de drie kanalen, of tussen twee kanalen. Veel digitale acquisitie software suites zijn voorzien van deze functionaliteit. Double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale marker hier getoonde toont meestal vertakte microglia, met lange fijne neuronale projecties duidelijk over corticale lagen.
Figuur 4:. Vertegenwoordiger confocale fluorescente beelden van Iba-1 / Pan-neuronale double-labeling Kolom 1 toont microglia gekleurd met Iba1 (rood). Neuronen worden in detweede kolom in groen, de overlay afbeelding van zowel rode en groene kanalen in de derde kolom. In de eerste rij wordt een compleet ontbreken van specifieke kleuring als gevolg van afwezigheid van zowel primaire antilichamen. De tweede rij toont de specificiteit van de Pan-neuronale primaire antilichaam voor neuronale vlekken, terwijl de derde rij toont de specificiteit van Iba1 voor microglia, met een compleet gebrek aan cross-reactiviteit in beide gevallen. De vierde rij illustreert double-labeling met een overlay van de twee kanalen tonen zowel microglia en neuronale vlekken. Scale bar 50 micrometer.
Slechte kleuring resultaten worden ook getoond (Figuur 5), zoals blijkt uit het ontbreken van duidelijk omschreven cellichamen en gefragmenteerde microglia / neuronale processen. High achtergrond wijst op slechte kwaliteit kleuring en kan worden gezien door niet-specifieke co-lokalisatie van antilichamen (zie figuur 5). Bovendien, als het signaal zwak is, een amplificatiestap met fluorescent gebonden streptavidin kan worden opgenomen. In plaats van een direct fluorescent gelabeld secundair antilichaam in stap 2.2.6, een gebiotinyleerd secundair wordt toegepast. Na wassen in PBS, streptavidine: is (1 1000 in PBS) geïncubeerd op de objectglaasjes gedurende 1 uur. Keer terug naar het protocol bij stap 2.2.7, waar dia's vervolgens worden gewassen en gedrenkt in een tegenkleuring of het deksel gleed.
Figuur 5:. Representatieve fluorescente beelden van slechte kwaliteit tissue afbeelding toont een voorbeeld van kleuring in slechte weefsel waardoor onduidelijkheid van microgliale kleuring (a) en compleet gebrek aan neuronale kleuring (b). Dit neuronale vlekken is gewoon hoog achtergrond. De overlay image (c) is niet zinvol.
| Naam van Material / Equipment | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen / Beschrijving |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Gebruikt voor weefsel montage (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Gebruikt voor weefsel drogen (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Gebruikt in stap 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-Tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Gebruikt voor wasbeurten gedurende kleuring (2,2), alsmede de Hoechst stap (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Gebruikt voor het drogen slides (2,2) |
| Black Box kleuring | Ted Pella | 21050 | Gebruikt voor het blokkeren en vlekken stappen (2.2) |
| Normale Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Gebruikt voor het blok en antilichaam incubatie (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronale | Millipore | MAB2300 | Gebruikt voor het primaire antilichaam (2.2.4) |
| Konijn α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19.741 | Gebruikt voor het primaire antilichaam (2.2.4) |
| Donkey α-Rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Gebruikt voor secundaire antilichaam (2.2.6) |
| Donkey α-muis 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Gebruikt voor secundaire antilichaam (2.2.6) |
| Traiteur folie | Ieder | N / A | Gebruikt in de stappen 1.2.2 en 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Gebruikt voor het afdekken (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Gebruikt voor het afdekken (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Ieder | N / A | Gebruikt voor het afdekken (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 en LSM 710 (laser scanning, confocale) | Carl Zeiss | N / A | Gebruikt voor imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N / A | Gebruikt voor imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | Voor DAB-protocol | |
| Abc | Vector Laboratories | PK-6100 | Voor DAB-protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Voor DAB-protocol |
| Gebiotinyleerd paard α-konijn IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | Voor DAB-protocol |
| Gebiotinyleerd paard α-muis IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | Voor DAB-protocol |
| 30% waterstofperoxide | FisherScientific | H325-500 | Voor DAB-protocol |
| Wheaton slide racks en vlekken gerechten | TedPella | 21043 | Voor DAB-protocol |
| Masterflex perfusie pomp en slangen | Cole-Parmer | Gebruikt voor perfusie (1.1.1 en 1.1.2) | |
| Andwin wetenschappelijke tissue-tek CRYO-oktober verbinding (bij 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Gebruikt voor het weefsel bevriezen (1.2.1) |
| Thermometer (-50 tot 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Gebruikt voor het weefsel bevriezen (1.2.1) |
| Cryostaat | Leica | CM3500S | Gebruikt voor weefsel snijden (1.2.2) |
| Kleuring schotel, plastic met 2 Deksels | Grale Scientific | 353 | Voor antigen Retrival |
| 20 Place kleuring Rack, Slides Horizontaal | Grale Scientific | 354 | Voor antigen Retrival |
| Magnetron | Ieder | N / A | Voor antigen Retrival |
Tabel 1: Materialen List.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De algemene doelstelling van deze mededeling was immunohistochemie procedures voeren om de lezer. Hiervoor heeft het voorbeeld van de dubbele labeling met Iba1 en pan-neuronale antigenen microglia en neuronen in paraformaldehyde geperfundeerde observeren, werd sucrose cryobeschermd, cryosectioned rattenhersenen gebruikt.
Deze techniek kan worden aangepast om eindeloze doeleinden. Een array van verschillende antigenen in verschillende weefseltypen zoals, maar niet beperkt tot de hersenen, longen, lever, nieren en darmen kan immunohistochemisch worden gevisualiseerd met kleine aanpassingen aan het protocol. Immunohistochemie maakt de directe vergelijking van meerdere markers en kan omvatten vier verschillende antilichamen in een enkel monster. Het aantal antilichamen gebruikt in een monster wordt beperkt door de doorbloeding, waardoor overlapping van fluorescerende golflengten beschrijft. Er is een beperkt spectrum fluorescerend licht die dientengevolge beperkt de kleuring combinaties binnen eningle monster (zie figuur 6).
Wanneer double-labeling, het beste primaire antilichamen in verschillende species te kiezen, aangezien beide antilichamen gelijktijdig kunnen worden toegepast. Double-labeling met twee antilichamen uit dezelfde species mogelijk, hoewel technisch moeilijk. Wanneer beide primaire antilichamen worden binnen dezelfde soort moeten kleuring na elkaar plaatsvinden, via het kleuring voor één antigeen voor de tweede. Minder problemen zullen ontstaan als de primaire antilichamen uit dezelfde species verschillende Ig klassen (bijvoorbeeld muis IgG en IgM van muis of andere subklassen IgG1 en IgG2a). Voor meer informatie raadpleeg extra referenties 10,11. Dit protocol maakt gebruik van konijnen anti-Iba1 en muis anti-Pan-neuronale. Ook moeten passende negatieve controles omvatten. Voor double-labeling met Iba1 en Pan-neuronale, één dia bevat geen primaire antilichamen, een glijbaan en bevat slechts één dia bevat anti-Pan-neuronale enige anti-Iba1 (zie figuur 4). Deze negatieve controles bevestigen de afwezigheid van kruisreactiviteit en valse kleuring. Alle andere dia's bevatten zowel primaire antilichamen. Het is ook belangrijk om het gebruik van secundaire antilichamen die kunnen kruisreageren. Het gebruik van bijvoorbeeld ezel anti-konijnen 594 en konijn anti-muis 488 zou leiden ezel anti-konijn 594 binding aan zowel konijnen anti-Iba1 primair antilichaam en ezel anti-konijn-antimuis 594 488 secundair antilichaam. Dit zou valse co-labeling maken. Antilichamen voor een bepaald eiwit (antigen) zijn niet altijd hetzelfde. Bijvoorbeeld, sommige antilichamen opgewekt tegen antigenen die aanwezig zijn in bevroren weefsel, terwijl andere een antigeen dat werd gewijzigd tijdens de paraffine inbedden herkent. Om deze reden, moet bijzondere aandacht worden besteed aan tHij antilichaam specificatieblad voorafgaand aan de aankoop. Indien de beoogde toepassing van het antilichaam niet wordt vermeld, kan het oplossen van problemen worden verplicht om vlekken te krijgen, of vlekken kan helemaal niet werken. Daarnaast kunnen eerder gepubliceerde gegevens "kneepjes van het vak" bieden om vlekken te verkrijgen. Van belang om op te merken dat subtiele verschillen kunnen worden gezien in verschillende batches van antilichamen; geringe modificaties kunnen nodig zijn bij elke re-order van een antilichaam. De meeste antilichamen zijn goed voor 12 maanden vanaf de datum van ontvangst. Zorg ervoor dat u de datum van aankomst op de productspecificatie sheet te geven. Als antilichaamkleuring niet wordt nageleefd, kan het antilichaam te oud of onjuist opgeslagen zijn. Het is dan ook belangrijk om elk antilichaam specificatieblad controleren voor een goede opslag. Bovendien, voor veel antilichamen verschillende klonen verkrijgbaar. Verschillende klonen herkennen verschillende delen van het antigeen van belang. EENgegeven kloon kan beter voor weefsel onderworpen aan verschillende verwerkingstechnieken worden (wax ingesloten / bevroren), gericht op het type weefsel of doelsoorten. Bijzondere aandacht besteden aan de soorten waarvan het antilichaam werd opgewekt. Wanneer het antilichaam wordt verhoogd in dezelfde species als het weefsel voor onderzoek, kunnen hoge achtergrond worden waargenomen. Om dit extra blokkering met commercieel verkrijgbare kits bestrijden, zoals een muis in mouse kit, kunnen nodig zijn voor kleuring. Deze techniek kan ook worden aangepast om celkweek. Fixatie van de cellen, kloon en specificiteit moeten worden gecontroleerd op de specificatie blad voor toepassingen. Fixatie met paraformaldehyde crosslinks eiwitten, die antigenbindingsplaatsen in sommige omstandigheden kon verbergen. Antigen ophalen kunnen eiwit dwarsverbindingen te breken en bindingsplaatsen bloot. Als antigen herstel nodig is, plaatst u de volgende protocol na stap 2.1.3: met behulp van een plastic schaaltje vlekken en plaats (zie tabel 1), magnetron slidesin citraatbuffer op een laag vermogen instelling gedurende 10 minuten, zorg ervoor dat niet laten de oplossing kook rigoureus (specifieke vermogens niet te wijten aan variabiliteit in de instellingen tussen microgolven). Als alternatief brengt citraatbuffer tot 80 ° C in een glazen schaaltje kleuring in een oven, dia's vervolgens gedurende 10 min. Slechte kwaliteit weefsel kan ook problemen met kleuring (zie figuur 5) te veroorzaken. Er zijn een aantal maatregelen kan nemen om te voorkomen compromitteren weefsel kwaliteit. Ten eerste, wees geduldig en ijverig met sucrose veranderingen om grondig te water te verplaatsen in het weefsel voor het invriezen. Bij het invriezen, houdt de temperatuur constant. Wanneer het weefsel bevriest te langzaam zal watermoleculen uitbreiden naarmate ze bevriezen, waardoor gaten in het weefsel. Alternatief invriezen bij te lage temperatuur zal de weefsels te kraken. Protocollen zal enigszins variëren voor elk antilichaam van belang. Bij ontvangst van een nieuw antilichaam moet geopteerdimize dienovereenkomstig het protocol. Als achtergrond is hoog (figuur 5), probeert het blokkeren gedurende een langere tijdsperiode. Afwisselend, verhoging van de serum concentratie van het blok oplossing of voeg serum van meerdere verschillende soorten zoals geiten en konijnen serum. Bovendien kan caseïne worden gebruikt om niet-specifieke binding te verminderen. Magere melk (uit droog poeder) caseïne en kan gebruikt worden in een reeks concentraties (kenmerkend 1-5% w / v). Melk kan alleen worden gebruikt of in combinatie met serum. Wanneer een antigeen van interesse een intracellulaire marker kan detergentia, bij TritonX-100 en Tween-20 wordt toegevoegd aan de blockingbuffer celmembranen permeabilize. Dikkere weefselcoupes kunnen op soortgelijke wijze worden verwerkt door drijvende de weefselsecties in putjes plaats van opspannen op objectglaasjes. In paraffine ingebed weefsel kunnen ook op soortgelijke wijze worden behandeld, maar vereist een de wassende stap vóór blokkering. Feldengut et al. 12 adressen beide methoden. Een andere factor om rekening te houden met DAB kleuring is dat cellen over meerdere weefsellagen. Het is derhalve moeilijk om duidelijke beelden van cellen te verkrijgen, zoals microglia die overspannen processen. Om dit probleem te overwinnen, sommige onderzoekers snijden in hun secties dunner bij 8-12 micrometer. Beeldvorming van fluorescent gelabelde weefsel wordt het beste bereikt op een confocale microscoop. Confocale microscopen elimineren de nevel normaal gezien met een onderzoek fluorescentiemicroscoop door het isoleren en het vastleggen van een enkel vlak van de focus binnen de steekproef. Met confocale microscopie, fijnere details zijn scherper en bloeden-through tussen fluorescerende kleurstoffen wordt verminderd. Dikkere monsters kunnen worden afgebeeld één vlak tegelijk (z-stack) true co-localisatie te tonen. Wanneer de toegang tot een confocale microscoop niet beschikbaar, weergave op een onderzoeksmicroscoop is echter mogelijk blootstellingstijd en lichtintensiteit moeten loc zijnked tussen de beelden. 
Figuur 6:. Kleurenspectrum chart Elke fluorofoor uitzendt van een specifieke golflengte van licht wanneer opgewekt door een specifieke laser of filter. Om effectief produceren van multi-gemerkte weefsel moet er een minimale overlap tussen specifieke fluoroforen geconjugeerd aan de antilichamen. Hoewel er tenminste 10 verschillende fluoroforen op de markt, is het niet mogelijk om duidelijke resultaten te verkrijgen wanneer alle 10 gebruikt. Bijvoorbeeld, triple-labeling met golflengte emissies bij 405, 488 en 594 (A) duidelijke labels geven als er minimale overlap, indien aanwezig, tussen deze golflengtes. Indien golflengte emissies bij 488, 514 en 555 werden gebruikt, de kleuring niet gemakkelijk geïnterpreteerd elk antilichaam kan worden opgewekt door de laser of filter bestemd voor de andere (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides | Fisher Scientific | 22-034-979 | Used for tissue mounting (1.2.2) |
| Oven | Thermo Scientific | 51028112 | Used for tissue drying (2.1.1) |
| Mini Pap pen | Life Technologies | 00-8877 | Used in step 2.2.2 |
| Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish | Fisher Scientific | 22-149-429 | Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Used for drying slides (2.2) |
| Black Staining Box | Ted Pella | 21050 | Used for blocking and staining steps (2.2) |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | 50-413-253 | Used for block and antibody incubation (2.2) |
| Mouse α-Pan-neuronal | Millipore | MAB2300 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Rabbit α-Iba1 | Wako Chemical | 019-19741 | Used for primary antibody (2.2.4) |
| Donkey α-rabbit 594 | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Donkey α-mouse 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Used for secondary antibody (2.2.6) |
| Caterer's foil | Any | N/A | Used in steps 1.2.2 and 2.3.2 |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12544E | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Clear Nail Polish | Any | N/A | Used for coverslipping (2.2.8) |
| Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| Axioskop A2 | Carl Zeiss | N/A | Used for imaging (3) |
| CitriSolv | FisherScientific | For DAB protocol | |
| ABC | Vector Laboratories | PK-6100 | For DAB protocol |
| DAB Peroxidase kit | Vector Laboratories | SK-4100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-rabbit IgG | Vector Laboratories | BA-1100 | For DAB protocol |
| Biotinylated horse α-mouse IgG | Vector Laboratories | BA-2001 | For DAB protocol |
| 30% Hydrogen Peroxide | FisherScientific | H325-500 | For DAB protocol |
| Wheaton slide racks and staining dishes | TedPella | 21043 | For DAB protocol |
| Masterflex perfusion pump and tubing | Cole-Parmer | Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2) | |
| Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Thermometer (-50 to 50 C) | Fisher Scientific | 15-059-228 | Used for tissue freezing (1.2.1) |
| Cryostat | Leica | CM3500S | Used for tissue sectioning (1.2.2) |
| Staining Dish, Plastic with 2 Lids | Grale Scientific | 353 | For antigen retrival |
| 20 Place Staining Rack, Slides Horizontal | Grale Scientific | 354 | For antigen retrival |
| Microwave | Any | N/A | For antigen retrival |
References
- Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
- Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
- Mellors, R. C. Histochemical demonstration of the in vivo localization of antibodies: antigenic components of the kidney and the pathogenesis of glomerulonephritis. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 3, 284-289 (1955).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. Comptes rendus hebdomadaires des seances de l'Academie des sciences. Serie D: Sciences naturelles. 262, 2543-2545 (1966).
- Cuello, A. C. Immunohistochemistry. , Wiley. (1983).
- Junqueira, L. C. U., Mescher, A. L. Junqueira's basic histology : text and atlas. , Thirteenth edition / edn, (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Christensen, N. K., Winther, L. Education Guide: Immunohistochemical (IHC) staining methods. Kumar, G. L., Rudbeck, L. , DAKO North America. Carpinteria, California. 103-108 (2009).
- Wang, G., Achim, C. L., Hamilton, R. L., Wiley, C. A., Soontornniyomkij, V. Tyramide signal amplification method in multiple-label immunofluorescence confocal microscopy). Methods. 18, 459-464 (1999).
- Feldengut, S., Del Tredici, K., Braak, H. Paraffin sections of 70-100 mum: a novel technique and its benefits for studying the nervous system. Journal of neuroscience methods. 215, 241-244 (2013).
