Summary

Primer für die Immunhistochemie auf gefriergeschnitten Rat Brain Tissue: Beispiel Färbung für Mikroglia und Neuronen

Published: May 12, 2015
doi:

Summary

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Abstract

Immunhistochemie ist eine weit verbreitete Technik zur Erfassung der Anwesenheit, den Ort und die relative Häufigkeit von Antigenen in situ. Dieser Einführungs Level-Protokoll beschreibt die Reagenzien, Geräte und Techniken erforderlich, um die immunhistochemische Färbung von Hirngewebe von Nagern zu vervollständigen, mit Markern für Mikrogliazellen und neuronale Elemente als Beispiel. Genauer gesagt, dieses Papier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für fluoreszierende Visualisierung von Mikroglia und Neuronen über die Immunhistochemie für Iba1 und Pan-neuronalen sind. Fluoreszenzdoppelmarkierung ist besonders nützlich für die Lokalisierung mehrerer Proteine ​​innerhalb der gleichen Probe, die Bereitstellung der Möglichkeit, genau zu beobachten Wechselwirkungen zwischen Zelltypen, Rezeptoren, Liganden und / oder der extrazellulären Matrix in Relation zueinander sowie Protein Co- Lokalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle. Im Gegensatz zu anderen Visualisierungstechniken kann Fluoreszenz Immunhistochemie Färbeintensität Abnahmedie Wochen bis Monate nach Färbung, es sei denn, entsprechende Vorkehrungen getroffen werden. Trotz dieser Einschränkung in vielen Anwendungen Fluoreszenzdoppelmarkierung über Alternativen wie 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) oder alkalische Phosphatase (AP) bevorzugt, da die Fluoreszenz zeiteffizienter und ermöglicht genauere Unterscheidung zwischen zwei oder mehr Marker. Die Diskussion enthält Tipps zur Fehlerbehebung und Beratung zum Erfolg zu fördern.

Introduction

Immunohistochemie ist ein Verfahren zum Nachweis von Antigenen (dh Proteine) in Gewebeschnitten unter Verwendung von primären Antikörpern, die spezifisch gegen die Antigene von Interesse binden. Immunhistochemie wurde von JR Marrack 1934 Pionierarbeit geleistet, als er festgestellt, dass Antikörper könnten Antigene mit großer Spezifität 1 zu lokalisieren. Ab 1942 einige der ersten in-vitro-Studien unter Verwendung von fluoreszierenden Antikörpern immunhistochemisch visualisieren veröffentlicht wurden 2,3, wonach die erste in vivo histochemische Studie veröffentlicht 4. Während der 1960er drei Jahrzehnte nach dem Beginn des immunhistochemische Verfahren begann, Enzym-konjugierten Antikörper als sekundäre Reagentien verwendet werden. Diese Methoden wurden gleichzeitig und unabhängig voneinander in Frankreich und in den USA 5,6 entwickelt. Heute, ein breites Spektrum von Antikörpern bietet unendlich viele Möglichkeiten für die Immunhistochemie Studien 7.

"> Das übergeordnete Ziel dieser Korrespondenz ist es, eine kurze Einführung in immunhistochemischen Färbung bereitzustellen; es ist nicht als eine umfassende und abschließende Bewertung dieser Technik werden in der Methode beschrieben werden immunhistochemischen Techniken für zwei Antigene präsentiert (Marker für die Mikroglia und. Neuronen) für die Färbung von Paraformaldehyd perfundiert beginnt Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn. Die immunhistochemische Färbung mit Blockierungs unspezifische Antigen-Bindung an die Hintergrundfärbung zu reduzieren. Als nächstes wird die Inkubation mit dem primären Antikörper können zur Bindung an ein spezifisches Antigen im Gewebe. Im Anschluss an die primären Antikörper, ein anderer Antikörper, bezeichnet als sekundärer Antikörper, aufgebracht wird, um den primären Antikörper auf einen konjugierten Visualisierungssignal 8 zu verknüpfen. Der sekundäre Antikörper zielt auf das Immunglobulin G (IgG) Domäne spezifisch für die Spezies, in denen das primäre Antikörper gezüchtet wurde. Der sekundäre Antikörper verstärkt das Signal, des primären Antikörpers, da die Fab Regionen ter sekundären Antikörper binden sich an mehreren Stellen auf dem IgG-Domäne des primären Antikörpers. Entweder Enzymen oder fluoreszierenden Moleküle an die Fc-Bereiche der sekundären Antikörper konjugiert ermöglichen Visualisierung. Beispielsweise ist ein Kaninchen-Anti-Iba1 Primärantikörper ein Kaninchen-IgG-Molekül spezifisch für Iba1. Wenn Esel-Anti-Kaninchen-IgG als sekundärer Antikörper verwendet, wird es zu erkennen und zu mehreren Regionen des Kaninchen-Anti-Iba1 IgG (siehe 1), zu binden. Der Esel-Antikörper kann durch verschiedene Verfahren sichtbar gemacht werden. Diese Entsprechung konzentriert sich auf Erfassung eines Fluorophors an den sekundären Antikörper, der den primären Antikörper erkennt, zur Sichtbarmachung durch Fluoreszenzmikroskopie konjugiert. In fluoreszierenden Immunhistochemie kann eine Kernfärbung wie Hoechst oder DAPI verwendet, um alle Kerne zu visualisieren.

Abbildung 1
Abbildung 1: SchEmatic Darstellung direkte vs. indirekte Antikörper-Markierungstechniken. Antikörper binden an das Antigen von Interesse und kann durch sekundäre Antikörper, die gegen die Spezies des primären Antikörper erzeugt amplifiziert werden. Diese Technik kann durchgeführt werden unter Verwendung von Avidin-Biotin-Komplex (ABC) zur Verstärkung und DAB zur Visualisierung (A) oder einem direkt konjugierten fluoreszierenden Sekundärantikörper (B). Alternativ können primäre Antikörper direkt mit vielen verschiedenen Tags, einschließlich Biotin oder ein Fluorophor (C) konjugiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Ein alternatives Verfahren zur Visualisierung von immunhistochemischen Färbung verwendet 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB; siehe 1 und 2). Dies unterscheidet sich von Fluoreszenz, die durch Verwendung eines biotinylierten oderMeerrettich-Peroxidase (HRP) konjugierten Sekundärantikörper, die ein Enzym, um DAB zu einem Niederschlag, der unter Hellfeldmikroskopie sichtbar zu konvertieren bietet. In Fällen, in denen eine einzige Antigen von Interesse ist oder Färbung ist erforderlich, langlebig zu sein, kann DAB besser geeignet als Fluoreszenzfärbung ist. Allerdings DAB-Färbung nicht zur Differenzierung zwischen mehreren Markern gut geeignet, vor allem, wenn zwei nukleäre Antigene von Interesse. Informationen zur DAB Materialien und Protokoll Änderungen, wenden Tabelle 1. Alternativ Nitroblautetrazoliumchlorid / 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat (NBT / BCIP) kann verwendet werden, um eine alkalische Phosphatase (AP) konjugierten sekundären visualisieren Antikörper.

Figur 2
Abb. 2: Repräsentative Bilder von Nickel-verstärkten DAB einfach markierten Rattenhirngewebeschnitten Rattenhirn-sections, die mit Nickel-verstärkten DAB für Iba1 (A) und Pan-neuronalen (B) markiert sind, ermöglichen eine lang anhaltende Analyse von Mikrogliazellen oder Neuronen allein. Maßstabsleiste 20 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Man muß bedenken die geschätzte Häufigkeit des Antigens von Interesse innerhalb des Gewebes analysiert. Indirekten Methoden (wie oben beschrieben) sind nützlich für Ziele mit geringer Häufigkeit. Wenn das Antigen von Interesse in besonders hoher Zahl, können direkte Verfahren aufgebracht werden. Direkte Verfahren umfassen einen primären Antikörper, der direkt an ein Visualisierungssignal konjugiert ist, und damit keine sekundären Antikörpers erforderlich ist. Diese Methode vereinfacht die Färbung Prozess, aber beseitigt die durch indirekte Methoden erreicht Verstärkung. Mit Hilfe eines direkt konjugierten primären Antikörper beseitigt auch Kreuzreaktivität Sekundärantikörperals Doppelmarkierung.

Diese Mitteilung beschreibt die Protokoll für Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronalen (Details in Tabelle 1). Iba1 Flecken Mikroglia-Aktivierung in vielen Staaten, darunter verzweigte, hyperverzweigte, aktiviert, amoeboid und Stange. Pan-neuronalen Flecken neuronalen Axonen, Dendriten, und Soma. Seit Iba1 Flecken meisten Mikroglia und Pan-neuronalen Ziele das Neuron ist diese Kombination von Flecken nützlich gewinnen ein umfassendes Verständnis von Mikroglia-Neuron-Interaktionen.

Zusammengefasst beruht die immunhistochemische Färbung auf die sorgfältige Auswahl von Antikörpern. Da die Fragestellung wird präziser können Antikörper, Antigene, um alternative angehoben wünschen übrig. Um einen bestimmten Mikrogliaaktivierung Staaten abzielen, kann man sich dafür entscheiden, CD45 oder CD68-Antikörper verwenden, anstatt Iba1. Ferner wird bei der Arbeit mit Mäusen, F4 / 80 können die erforderlichen Ergebnisse zu liefern. In ähnlicher Weise kann die neuronale Elemente spezifisch mit Antikörpern ra gezieltsierten gegen den Zellkern, synapse (Pre- oder Post), Axon, und Wachstumskegel. Darüber hinaus gibt es andere Markierungen, die das Alter des Neurons (Doppel-Cortin, NeuN) unterscheiden und neuronalen Regeneration (GAP-43).

Protocol

HINWEIS: Alle Verfahren wurden in Einklang mit den institutionellen Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der Universität von Arizona durchgeführt. Eine Liste der empfohlenen Materialien und Geräte können in Tabelle 1 gefunden werden. 1. Gewebepräparation Perfusion Euthanize Nager mit einer Überdosis von Natriumpentobarbital (25 mg / kg, IP), und transkardial perfundiert mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), bis sie vollständig ausge…

Representative Results

Diese Färbung Protokoll führt Rattenhirngewebeschnitten, die Mikroglia fluoreszenz im Kanal 594 (rot) markiert sind und Neuronen in dem Kanal 488 markiert (grün; siehe Abbildung 4). Wenn eine Kernfärbung durchgeführt wurde, wird es in der 405-Kanal (blau) zeigen. Bilder können in verschiedenen Kanälen zwischen zwei beliebigen Kanälen aufgenommen werden und überlagert zum direkten Vergleich der drei Kanäle oder. Viele digitale Erfassungssoftware Suiten verfügen diese Funktionalität. Doppelmar…

Discussion

Das übergeordnete Ziel dieser Mitteilung war die Immunhistochemie Verfahren für den Leser einzuführen. Hierzu wird das Beispiel der Doppelmarkierung mit Iba1 und Pan-neuronale Antigene an Mikroglia und Neuronen in Paraformaldehyd perfundiert beobachten, wurde Saccharose kryogeschützt, gefriergeschnitten Rattenhirn verwendet.

Diese Technik lässt sich an endlosen Zwecken dienen werden. Ein Array von verschiedenen Antigenen in einer Vielzahl von Gewebetypen, wie beispielsweise, jedoch nich…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Mr. Ryan Hart and Mr. Arriz Lucas for their invaluable feedback on this communication. This work was supported by NIH NINDS R01 NS065052 and Phoenix Children’s Hospital Mission Support Funds.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Fisherbrand Superfrost Plus Glass Slides  Fisher Scientific 22-034-979 Used for tissue mounting (1.2.2)
Oven Thermo Scientific 51028112 Used for tissue drying (2.1.1)
Mini Pap pen Life Technologies 00-8877 Used in step 2.2.2
Andwin Scientific Tissue-tek Slide Staining Dish Fisher Scientific 22-149-429 Used for all washes during staining (2.2), as well as the Hoechst step (2.2.8) 
Kimwipes Fisher Scientific 06-666-A Used for drying slides (2.2)
Black Staining Box Ted Pella 21050 Used for blocking and staining steps (2.2)
Normal Donkey Serum Fisher Scientific 50-413-253 Used for block and antibody incubation (2.2)
Mouse α-Pan-neuronal Millipore MAB2300 Used for primary antibody (2.2.4)
Rabbit α-Iba1 Wako Chemical 019-19741 Used for primary antibody (2.2.4)
Donkey α-Rabbit 594 Jackson ImmunoResearch 711-585-152 Used for secondary antibody (2.2.6)
Donkey α-mouse 488 Jackson ImmunoResearch 715-545-150 Used for secondary antibody (2.2.6)
Caterer's foil Any N/A Used in steps 1.2.2 and 2.3.2
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01 Used for coverslipping (2.2.8)
Coverslips Fisher Scientific 12544E Used for coverslipping (2.2.8)
Clear Nail Polish  Any N/A Used for coverslipping (2.2.8)
Axio Observer.Z1 and LSM 710 (laser scanning, confocal) Carl Zeiss N/A Used for imaging (3)
Axioskop A2 Carl Zeiss N/A Used for imaging (3)
CitriSolv  FisherScientific For DAB protocol
ABC Vector Laboratories PK-6100 For DAB protocol
DAB Peroxidase kit Vector Laboratories SK-4100 For DAB protocol
Biotinylated horse α-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1100 For DAB protocol
Biotinylated horse α-mouse IgG Vector Laboratories BA-2001 For DAB protocol
30% Hydrogen Peroxide FisherScientific H325-500 For DAB protocol
Wheaton slide racks and staining dishes TedPella 21043 For DAB protocol
Masterflex perfusion pump and tubing Cole-Parmer Used for perfusion (1.1.1 and 1.1.2)
Andwin scientific tissue-tek CRYO-OCT compound (case of 12) Fisher Scientific 14-373-65 Used for tissue freezing (1.2.1)
Thermometer (-50 to 50 C)  Fisher Scientific 15-059-228 Used for tissue freezing (1.2.1)
Cryostat Leica  CM3500S Used for tissue sectioning (1.2.2)
Staining Dish, Plastic with 2 Lids Grale Scientific 353 For antigen retrival
20 Place Staining Rack, Slides Horizontal Grale Scientific 354 For antigen retrival
Microwave Any N/A For antigen retrival

References

  1. Marrack, J. R. Chemistry of antigens and antibodies. Nature. 134, 468-469 (1934).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. J Immunol. 45, 159-170 (1942).
  3. Marshall, J. M. Localization of adrenocorticotropic hormone by histochemical and immunochemical methods. The Journal of experimental medicine. 94, 21-30 (1951).
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Cite This Article
Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons. J. Vis. Exp. (99), e52293, doi:10.3791/52293 (2015).

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